郭旭川，王艷萍，張強(qiáng)，王璐，曾維斌

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003)

卵泡顆粒細(xì)胞作為卵泡內(nèi)重要的功能細(xì)胞，通過(guò)縫隙連接與卵母細(xì)胞相連，對(duì)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)，卵泡發(fā)育、成熟及微環(huán)境的維持起重要作用，二者關(guān)系緊密，卵母細(xì)胞指導(dǎo)顆粒細(xì)胞的增殖、分化，顆粒細(xì)胞的發(fā)育狀態(tài)會(huì)影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量和隨后胚胎的發(fā)育潛能[1]。因此，顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)將直接影響卵細(xì)胞的發(fā)育，進(jìn)而影響動(dòng)物的繁殖性能，通過(guò)對(duì)顆粒細(xì)胞發(fā)育分子層面的研究，可在一定程度上揭示卵巢卵泡發(fā)育的機(jī)制[2]。研究發(fā)現(xiàn)，顆粒細(xì)胞的凋亡可導(dǎo)致卵泡閉鎖，其功能受損將抑制其雌激素的分泌[3]。因此顆粒細(xì)胞是研究卵泡發(fā)育及內(nèi)分泌的重要細(xì)胞材料。血清因含促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的各種營(yíng)養(yǎng)成分和細(xì)胞因子，成為細(xì)胞培養(yǎng)液的重要成分。目前，胎牛血清(FBS)已普遍用于各種動(dòng)物體外組織的培養(yǎng)，但考慮到其生物安全性、動(dòng)物福利及效率，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)培養(yǎng)材料的自體血清培養(yǎng)效果進(jìn)行了探究，證實(shí)了自體血清的優(yōu)越性[4-5]。但驢自體血清對(duì)驢卵泡顆粒細(xì)胞培養(yǎng)的效果未見報(bào)道。

MTT法是一種利用酶標(biāo)儀快捷檢測(cè)細(xì)胞增值的方法，所測(cè)得的光吸收值與活細(xì)胞數(shù)成正比。劃痕實(shí)驗(yàn)在一定程度上模擬了體內(nèi)細(xì)胞遷移侵襲的過(guò)程，可以直觀的判定細(xì)胞的遷移能力。Annexin V-FITC/PI具有特殊的理化特性，可對(duì)不同狀態(tài)細(xì)胞進(jìn)行著色，經(jīng)流式細(xì)胞儀可以將細(xì)胞分為4個(gè)不同的亞群，從而分析出凋亡細(xì)胞比例。超氧化物歧化酶(SOD)具有極強(qiáng)的抗氧化性，可清除體內(nèi)自由基，防止自由基對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷，檢測(cè)SOD活性在一定程度上可以反映細(xì)胞的活力[6]?；駼AX和BCL-2分別是BCL-2家族中最具代表性的促進(jìn)凋亡和抑制凋亡基因，BCL-2/BAX比值決定細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)BCL-2因子較多時(shí)，BCL-2和BAX的異源二聚體增多，凋亡趨勢(shì)減弱；當(dāng)細(xì)胞內(nèi)BAX較多時(shí)，則BAX本身形成的同源二聚體占主導(dǎo)，則易于發(fā)生凋亡[7]。自噬在維持細(xì)胞水平和整個(gè)生物體內(nèi)的能量穩(wěn)態(tài)方面具有極為重要的作用，ATG7在自噬體形成的過(guò)程中作為激活酶參與了ATG12-ATG5-ATG16L1和ATG8-PE 兩個(gè)關(guān)鍵自噬復(fù)合體的形成，是一種關(guān)鍵酶，它的降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞自噬水平的降低[8]。

本研究通過(guò)測(cè)定體外培養(yǎng)驢卵泡顆粒細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡及自噬情況，比較含驢自體血清與胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)效果，為建立驢卵泡顆粒細(xì)胞安全、高效的培養(yǎng)方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑

DMEM、胎牛血清(Hyclone)，青鏈霉素、MTT、ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(Solarbio)，胰蛋白酶購(gòu)自(Gibco)，超純RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Ι(康為世紀(jì))，超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 驢自體血清的制備

選取3頭健康狀態(tài)良好的母驢，用真空采血管頸靜脈采集全血30 mL，室溫靜置2 h，4℃過(guò)夜，3 000 r·min離心10 min，取淡黃色上清液，無(wú)菌條件下用0.22 μm濾菌器過(guò)濾，56 ℃水浴15 min，滅活血清補(bǔ)體，-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 原代卵泡顆粒細(xì)胞的分離培養(yǎng)

將采自石河子九昌驢業(yè)有限公司屠宰的健康、性成熟母驢的離體卵巢置于含雙抗的37 ℃生理鹽水中，2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。無(wú)菌環(huán)境下，用注射器抽取卵泡液并置于15 mL離心管，1 000 r·min-1離心5 min，PBS洗滌2遍，加入預(yù)先配制好的完全培養(yǎng)液(90%DMEM+10%FBS +100 IU·mL-1青霉素+100 μg·mL-1鏈霉素)懸浮后，調(diào)整細(xì)胞濃度為(0.5～1)×105個(gè)·mL-1，接種于60 mm培養(yǎng)皿中，輕輕晃動(dòng)，使細(xì)胞分散均勻，再加入2 mL培養(yǎng)液置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞鋪滿至80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.4 MTT法測(cè)定不同血清對(duì)驢卵泡顆粒細(xì)胞增殖的影響

當(dāng)?shù)诙雅蓊w粒細(xì)胞長(zhǎng)至90%以上時(shí)，胰蛋白酶消化，重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105/mL，按200 μL·孔-1接種于96孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)24 h完全貼壁后，棄培養(yǎng)液，并分別加入含10%胎牛血清，5%、10%、15%驢自體血清培養(yǎng)液。分別培養(yǎng)12、24、48、72、96 h后棄培養(yǎng)液，再加入含有MTT的培養(yǎng)液120 μL(MTT∶DMEM=1∶5)培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，37 ℃孵育10 min，酶聯(lián)免疫分光儀490 nm測(cè)定吸光度，以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸、吸光值OD490均值為縱軸，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

將第二代顆粒細(xì)胞接種至12孔板，培養(yǎng)細(xì)胞融合至80%～90%后，采用200 μL Tip頭在培養(yǎng)皿中間劃出一條直線，PBS洗去脫落細(xì)胞，形成一條“裸露”區(qū)域。分別加入含10%胎牛血清，5%、10%、15%驢自體血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)至24、48、72 h時(shí)在倒置相差顯微鏡下觀察裸露區(qū)域的細(xì)胞遷移狀態(tài)并拍照，Image J軟件計(jì)算劃痕匯合面積，匯合率=(0 h劃痕面積-檢測(cè)時(shí)劃痕面積)/0 h劃痕面積*100%。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡

收集第二代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，12孔板鋪板每孔104～105個(gè)。孵育至細(xì)胞鋪滿孔底，分別加入含10%胎牛血清，5%、10%、15%驢自體血清培養(yǎng)液，對(duì)照組(DMEM+雙抗)，孵育24 h。將貼壁的顆粒細(xì)胞用0.25%胰酶消化，室溫1 000 r·min-1離心5 min，收集細(xì)胞。用4 ℃ 預(yù)冷PBS洗滌2次，加入1 mL 1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞為1×106個(gè)·mL-1。每管中加入100 μL細(xì)胞(1×105個(gè))，再加入5 μL的Annexin V-FITC混勻后，室溫避光孵育15 min，再加入5 μL PI，室溫避光孵育5 min，加入PBS至500 μL，輕輕混勻，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.7 細(xì)胞SOD活性的測(cè)定

按照SOD活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作。

1.8 凋亡及自噬相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定

第三代細(xì)胞貼壁后更換不同血清培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h，用RNA試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-qPCR測(cè)定細(xì)胞凋亡及自噬相關(guān)基因BAX、BCL-2、ATG7的相對(duì)表達(dá)量。定量相關(guān)基因引物序列見表1，引物由上海生工合成。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.9 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)用SPSS 21.0軟件單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有試驗(yàn)至少重復(fù)3次，結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05或P<0.01分別表示數(shù)據(jù)間差異顯著或極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同血清對(duì)驢卵泡顆粒細(xì)胞增殖的影響

如圖1所示，經(jīng)MTT法檢測(cè)，與添加10%的胎牛血清組相比，添加驢自體血清各組OD值均高于胎牛血清組；48 h后，含15%驢自體血清組的OD值較快速升高；72 h后，生長(zhǎng)曲線趨于平緩，但各時(shí)間段內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的OD值之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。

圖1 不同血清對(duì)驢卵泡顆粒細(xì)胞增殖的影響

2.2 不同血清對(duì)驢卵泡顆粒細(xì)胞遷移能力的影響

如圖2所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，每組劃痕區(qū)域?qū)挾榷疾粩嘧冋?，可明顯觀察到新生細(xì)胞爬至劃痕區(qū)。劃痕匯合率如表2所示，培養(yǎng)24 h后，10%自體血清組極顯著高于10%胎牛血清組(P<0.01)；培養(yǎng)48 h，10%自體血清組極顯著高于除15%自體血清組外的其他各組(P<0.01)；培養(yǎng)72 h，10%胎牛血清組極顯著低于其他各組(P<0.01)，10%自體血清組最高為(88.37±1.93)%，細(xì)胞基本匯合。此表明驢自體血清各組細(xì)胞的遷移能力均優(yōu)于胎牛血清組。

圖2 不同血清對(duì)驢卵泡顆粒細(xì)胞遷移能力的影響(100×)

表2 不同血清組顆粒細(xì)胞劃痕匯合率

2.3 不同血清對(duì)驢卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的影響

如圖3所示，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，各組散點(diǎn)圖中四個(gè)象限Q1、Q2、Q3、Q4分別代表機(jī)械性損傷細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞、活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞所占比例，細(xì)胞凋亡率為Q2與Q4之和；柱狀圖中含10%胎牛血清組細(xì)胞凋亡率極顯著高于不同濃度自體血清組凋亡率(P<0.01)，而含10%自體血清組凋亡率最低15.10%±0.26%。

圖3 不同血清組驢卵泡顆粒細(xì)胞凋亡率

2.4 不同血清對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)SOD含量的影響

如圖4所示，含10%自體血清組SOD活力極顯著高于其他組(P<0.01)。而10%胎牛血清組SOD活力極顯著高于含5%自體血清組(P<0.01)，顯著高于含15%自體血清組(P<0.05)，5%自體血清組SOD活力最低。

圖4 不同血清組驢卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)SOD活力

2.5 不同血清對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞凋亡及自噬相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的影響

如圖5所示，促進(jìn)凋亡基因BAX與自噬基因ATG7在含10%胎牛血清組的表達(dá)水平極顯著高于其他各組(P<0.01)，且含10%自體血清組為最低；抑制凋亡基因BCL-2在含10%胎牛血清組的表達(dá)水平極顯著低于其他各組(P<0.01)，且含10%自體血清組的表達(dá)最高。

同一基因標(biāo)注不同字母表示差異極顯著(P<0.01)， 標(biāo)注相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖5 不同血清對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞凋亡及 自噬相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量影響

3 討論

細(xì)胞培養(yǎng)液是各種細(xì)胞體外培養(yǎng)生存和增殖的基礎(chǔ)，其成分決定培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。血清是細(xì)胞培養(yǎng)液中不可或缺的成分，它能提供維持細(xì)胞快速生長(zhǎng)的各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使培養(yǎng)液接近與機(jī)體內(nèi)環(huán)境。而無(wú)血清培養(yǎng)基的成本高、培養(yǎng)周期長(zhǎng)，且其穩(wěn)定性和安全性仍有待提高。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中血清濃度的設(shè)定亦尤為重要，濃度過(guò)高會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，濃度過(guò)低則會(huì)影響細(xì)胞的增殖。胎牛血清作為動(dòng)物細(xì)胞和組織培養(yǎng)的生長(zhǎng)添加劑在基礎(chǔ)研究中廣泛應(yīng)用，但存在一定局限性，如蛋白質(zhì)和非編碼RNA，在不同物種的血清中是不同的，可能有助于物種特有的作用模式，影響細(xì)胞在培養(yǎng)中的表性差異[9]。

自體血清與自身細(xì)胞來(lái)源于同一物種，相對(duì)而言因其保持了同源性，更接近機(jī)體內(nèi)環(huán)境，能最大限度滿足培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)所需的各種生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子，使細(xì)胞具有更高的活力[10-11]。研究表明，相對(duì)胎牛血清，人血清可顯著促進(jìn)HeLa細(xì)胞遷移能力[12]；不同濃度仔豬血清體外培養(yǎng)金華豬耳緣組織成纖維細(xì)胞，10%濃度組細(xì)胞活力強(qiáng)、增殖迅速[13]；用含10% AB血清、自體血清和胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，自體血清較胎牛血清更能促進(jìn)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的增殖[14]。本研究通過(guò)MTT法及劃痕實(shí)驗(yàn)也表明，驢自體血清組顆粒細(xì)胞具有優(yōu)于胎牛血清組的增殖和遷移能力，尤以10%驢自體血清最優(yōu)。

細(xì)胞凋亡是一種復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象，由多個(gè)相關(guān)基因調(diào)控。卵泡的發(fā)育與顆粒細(xì)胞凋亡過(guò)程中都有細(xì)胞自噬的存在，且自噬與凋亡之間存在緊密復(fù)雜的分子聯(lián)系[15]。大鼠卵泡顆粒細(xì)胞出現(xiàn)凋亡時(shí)，細(xì)胞內(nèi)SOD活性降低[16]，SOD活性降低會(huì)使凋亡關(guān)鍵基因BAX上調(diào)，從而激活凋亡終末剪切酶Caspase-3促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。多囊卵巢綜合征(PCOS)大鼠卵巢中顆粒細(xì)胞的增殖能力減弱，經(jīng)治療BCL-2/BAX比值明顯升高，顆粒細(xì)胞增殖能力恢復(fù)，卵泡發(fā)育趨于正常[18]。BCL-2表達(dá)水平的下降與自噬體的積累誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞的凋亡[19]。ATG7在自噬發(fā)生過(guò)程中起重要作用，特異性敲除生殖細(xì)胞的自噬誘導(dǎo)基因ATG7，會(huì)導(dǎo)致卵巢卵泡嚴(yán)重丟失，雌鼠生育能力低下[20]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，驢體外培養(yǎng)顆粒細(xì)胞各組中含10%驢自體血清組凋亡基因BAX與自噬基因ATG7表達(dá)量最低，抑凋亡基因BCL-2表達(dá)量最高，BCL-2/BAX比值及顆粒細(xì)胞SOD活力顯著高于同濃度的胎牛血清組，自體血清組凋亡率顯著低于胎牛血清組，驢自體血清對(duì)體外培養(yǎng)驢卵巢顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)與活力比胎牛血清具有更好的效果。

4 結(jié)論

含10%驢自體血清培養(yǎng)液培養(yǎng)的驢卵泡顆粒細(xì)胞其增殖、遷移及活力均優(yōu)于含10%胎牛血清培養(yǎng)液，故更適合驢卵泡顆粒細(xì)胞的體外培養(yǎng)，但自體血清優(yōu)于胎牛血清的生物學(xué)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。