李東哲，王丹丹，侯麗娜，宋成軍，陳志宏

（承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北承德 067000）

1921年，加拿大人F.G.班廷和C.H.貝斯特首先發(fā)現(xiàn)了胰島素，它是在內(nèi)源性或外源性物質(zhì)，如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激下由胰島β細(xì)胞分泌的。胰島素是機(jī)體內(nèi)唯一降低血糖的激素，也是機(jī)體內(nèi)唯一同時促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成的激素。胰島素通過與靶細(xì)胞表面的受體結(jié)合后磷酸化胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS），然后主要通過介導(dǎo)PI3K-Akt（PKB）信號通路和MAPK信號通路發(fā)揮效應(yīng)。研究者發(fā)現(xiàn)，在胰島β細(xì)胞也存在胰島素PI3K-Akt信號通路，主要作用是調(diào)控胰島素分泌，維持β細(xì)胞的生長和增殖等[1]。作為PI3K-Akt信號通路重要的上游分子，本研究探討了絲膠（彩色蠶繭水提取物）對2型糖尿病大鼠胰腺IRS-1 mRNA表達(dá)的影響，一方面為豐富絲膠作用的研究提供數(shù)據(jù)支持，另一方面為糖尿病發(fā)病機(jī)制和治療方法的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、處置及分組 36只雄性SD大鼠，自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司購買，合格證號SCXK（京）2012-0001。大鼠隨機(jī)分組，每組12只，分別是正常組、糖尿病模型組和絲膠用藥組。

糖尿病模型組和絲膠用藥組大鼠采用高脂飼料+高糖飼料喂養(yǎng)并聯(lián)合鏈脲佐菌素（35mg/kg，2次）腹腔注射的方法建立2型糖尿病大鼠模型，以空腹血糖≥11.1mmol/L作為成模標(biāo)準(zhǔn)。成功建模后，絲膠用藥組大鼠給予2.4g/kg/d的絲膠灌胃治療35天；正常組、糖尿病模型組大鼠給予同等體積生理鹽水灌胃相同時間。

1.2 制備絲膠 1%的Na2CO3浸泡蠶繭30min（浴比1：30），95～100℃沸煮3h（2次），合并2次提取液并減壓濃縮，8000～14000nm透析袋透析過夜，透析液冷凍干燥成粉末，即得絲膠。

1.3 大鼠取材和檢測相關(guān)指標(biāo)

1.3.1 取材：大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)心臟取血后斷頭處死，迅速取出胰腺，于液氮中加入Trizol研磨后入液氮保存。

1.3.2 檢測血糖：所取大鼠血液3000轉(zhuǎn)/min離心20min，收集血清，檢測血糖水平采取葡萄糖氧化酶法。

1.3.2 檢測胰腺IRS-1 mRNA的表達(dá)：采用Real Time Q-PCR法。引物的設(shè)計與合成由寶生物工程（大連）有限公司完成，引物序列見附表。取胰腺提取總RNA后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA；采用pGM-T質(zhì)粒載體構(gòu)建IRS-1和內(nèi)參GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品用以后續(xù)定量；擴(kuò)增IR和GAPDH，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴(kuò)增曲線和溶解曲線。以IRS-1拷貝數(shù)與GAPDH拷貝數(shù)的比值作為IRS-1 mRNA的相對表達(dá)水平。

附表 Real Time Q-PCR法引物序列表

2 結(jié)果

2.1 大鼠的血糖水平 糖尿病模型組大鼠的血糖為(29.45±4.82)mmol/L，明顯高于正常對照組大鼠[(10.83±2.03)mmol/L，P＜0.05]；絲膠用藥組大鼠的血糖為(13.20±4.09)mmol/L，明顯低于模型組大鼠(P＜0.05)。見圖1：

圖1 各組大鼠的血糖水平

2.2 大鼠胰腺IRS-1 mRNA的表達(dá)情況 以pMD18-T-IRS-1陽性質(zhì)粒DNA的不同濃度梯度（6.65×108-6.65×104）和樣品做為模板，經(jīng)Real Time PCR擴(kuò)增，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴(kuò)增曲線和溶解曲線，結(jié)果見圖2。標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示相關(guān)系數(shù)r=-0.999，斜率=-3.08604，截距=31.187，擴(kuò)增效率為110.882%；擴(kuò)增動力學(xué)曲線呈典型的S型曲線，同時，樣品擴(kuò)增曲線均在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)；溶解曲線呈單峰，無非特異型擴(kuò)增，表明產(chǎn)物單一，擴(kuò)增特異性較好。

與正常組（0.016±0.007）比較，糖尿病模型組大鼠胰腺IRS-1 mRNA（0.005±0.003）的表達(dá)明顯降低(P＜0.05)；絲膠用藥組大鼠胰腺IRS-1 mRNA（0.013±0.008）的表達(dá)明顯高于糖尿病模型組(P＜0.05)。

圖2 Real Time Q-PCR法IRS-1 mRNA的表達(dá)

3 討論

胰島素受體底物(IRS)是參與胰島素及其他細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的磷酸化蛋白，具有十幾個酪氨酸殘基，能夠被激活的胰島素受體酪氨酸激酶作用，磷酸化的IRS能夠結(jié)合并激活下游效應(yīng)物。IRS家族目前已發(fā)現(xiàn)有6個成員，IRS1-1～I(xiàn)RS-6，他們的基因結(jié)構(gòu)基本相似，但在組織分布、亞細(xì)胞定位、發(fā)育過程的表達(dá)時序、與胰島素的結(jié)合及與含SH2蛋白質(zhì)的相互作用方面存在差異[2-3]。

IRS家族成員中，IRS-1是最早被發(fā)現(xiàn)的。人的IRS-1基因位于2號染色體上，包含21個假定的絡(luò)氨酸磷酸化位點，其中的有些位點可與包括PI3K調(diào)節(jié)亞基p85在內(nèi)的含有SH2結(jié)構(gòu)的分子結(jié)合[4]。研究發(fā)現(xiàn)，IRS-1在脂肪細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞及其他多種組織細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用。IRS-1在脂肪細(xì)胞分化中起重要作用，可通過PI3K-Akt信號通路改善脂肪組織胰島素抵抗[5-6]；在骨骼肌細(xì)胞中，IRS-1低表達(dá)與胰島素抵抗和2型糖尿病密切相關(guān)[7]；在其他組織細(xì)胞，IRS-1在IGF-1介導(dǎo)的促生長過程中扮演重要角色[8]。

以前的研究認(rèn)為，只在外周靶組織，如肝臟、肌肉、脂肪組織中存在胰島素抵抗，因而強調(diào)外周抵抗在2型糖尿病發(fā)病中的作用[9]。1995年，Harbeck等[1]發(fā)現(xiàn)胰島β細(xì)胞亦表達(dá)有胰島素受體、IRS-1及胰島素信號通路，主要為PI3K-Akt信號通路和鈣通道及其相關(guān)途徑。胰島素與細(xì)胞膜上的IR結(jié)合后，激活I(lǐng)Rβ亞基的蛋白酪氨酸激酶（PTK），使IR受體自身磷酸化，同時通過磷酸化IRS-1的酪氨酸使IRS-1活化，活化的IRS-1轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，通過PTB（磷酸酪氨酸結(jié)合域）將磷酸酪氨酸固定在IRS-1的酪氨酸激酶上。其后，酪氨酸磷酸化的IRS-1與SH2（含肉瘤同源區(qū)段2）結(jié)構(gòu)域的相關(guān)信號分子結(jié)合，進(jìn)而激活PI3K-Akt信號途徑，從而抑制β細(xì)胞凋亡、促進(jìn)β細(xì)胞增殖[10-11]。有研究顯示，胰島β細(xì)胞IRS-1基因敲除的小鼠，表現(xiàn)出胰島素分泌減少和2型糖尿病[12]。本研究結(jié)果亦證實了這一點，糖尿病模型組大鼠血糖明顯升高，胰腺IRS-1 mRNA的表達(dá)明顯降低。

為降低口服西藥治療糖尿病時的毒副作用，研究者們一直在探尋治療糖尿病的天然物質(zhì)。根據(jù)民間蠶繭泡水降血糖的驗方，以及我國多家中醫(yī)古籍的記載，本研究提取蠶繭中能溶于水的蛋白質(zhì)—絲膠（蛋白），并給予2型糖尿病大鼠灌胃治療。結(jié)果顯示，不但模型大鼠的血糖明顯降低，同時糖尿病模型大鼠胰腺IRS-1 mRNA的表達(dá)明顯升高。提示絲膠可能通過上調(diào)胰腺IRS-1的表達(dá)，進(jìn)而通過影響胰島素相關(guān)信號的傳導(dǎo)，促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖，起到降血糖的作用，但絲膠治療糖尿病的具體機(jī)制尚需深入研究。