田淑芬，月丫,2，張娜，郭艷芳,2

（1. 天津市設(shè)施農(nóng)業(yè)研究所/天津市葡萄遺傳與育種企業(yè)重點實驗室，天津 300192；2. 天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387）

目前我國葡萄的育種方向是經(jīng)濟性（早熟、抗病、耐貯存）與食用性（大粒、香氣濃、無核、色澤鮮艷）并重的優(yōu)良無核葡萄新品種[1-2]。將無核與玫瑰香味兩種性狀相結(jié)合培育無核且具有玫瑰香味的葡萄品種市場前景廣闊。胚挽救技術(shù)為當(dāng)前無核葡萄育種的主要方法，研究無核葡萄胚挽救中影響幼胚生長發(fā)育的因素對培育無核葡萄新品種具有重要指導(dǎo)意義[3-5]。本研究以種子敗育型無核品種‘紅寶石無核’做母本，以二倍體‘玫瑰香’優(yōu)系和四倍體‘巨玫瑰’作父本進行三倍體無核葡萄胚挽救研究[6-7]。研究旨在解決影響無核葡萄離體培養(yǎng)的培養(yǎng)條件，以提高無核葡萄幼胚的萌發(fā)成苗率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究開始于2017年4月，2018年6月結(jié)束。研究地點為天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄研究中心武清試驗基地和天津市葡萄遺傳與育種企業(yè)重點實驗室。研究材料均取自天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄研究中心武清試驗基地葡萄園。供試材料為‘紅寶石無核’‘玫瑰香’和‘巨玫瑰’葡萄。雜交組合設(shè)計（表1）。

1.2 研究方法

1.2.1 田間雜交

本研究于2017年5月開始葡萄花粉的采集工作。在父本葡萄花穗有5%左右的小花開放時，采集花粉，曬干，放在裝有干燥劑（變色硅膠）的瓶中，標記好相應(yīng)的品種名稱，保存于4 ℃冰箱中備用[8-9]。在無核紅寶石葡萄開花前1～3 d進行人工去雄，第2天開始對試驗花穗進行授粉的工作，連續(xù)授粉3 d，每天2次。去雄完成以及每次授粉完成后要立即套袋，在雜交花穗上標注好授粉時間和雜交組合名稱。每組雜交授粉15穗。

1.2.2 幼果采集

雜交胚珠的取樣工作開始于2017年6月，在從最后一次授粉完成以后的30 d開始。每7 d為一個取樣周期，共采摘3次，每次300粒。將幼果采下后帶到實驗室進行清洗消毒工作，基本操作如下：首先進行清洗處理，剪去果柄的幼果用自來水沖洗數(shù)次[10-11]，流水沖洗10 min。然后再進行消毒工作，將清洗后的幼果放置在超凈工作臺上，先用75%酒精沖洗幼果一次，之后用無菌水沖洗3次，再將其放入次氯酸鈉溶液中浸泡3 min，最后再用無菌水沖洗3次。

1.2.3 胚發(fā)育階段胚珠培養(yǎng)

在無菌環(huán)境下，用解剖針將幼果中的胚珠剝離出來，將剝?nèi)〉呐咧榻臃N在培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)室內(nèi)，溫度25～28 ℃，相對濕度45%～60%，pH＝5.8。發(fā)育培養(yǎng)基為：E1，ER＋1.5 mol/L IAA＋0.5 mol/L 6-BA＋0.5 mol/L GA3＋60 g/L蔗糖＋5 g/L瓊脂＋1 g/L活性炭；N1，Nitsch＋1.5 mol/L IAA＋0.5 mol/L 6-BA＋0.5 mol/L GA3＋60 g/L蔗糖＋5 g/L瓊脂＋1 g/L活性炭。

1.2.4 胚萌發(fā)階段胚培養(yǎng)

接種在發(fā)育培養(yǎng)基中的胚珠，經(jīng)過60d的培養(yǎng)以后，在超凈工作臺中將其取出（保證無菌環(huán)境），進行剝胚工作，從而進入胚萌發(fā)階段[12]，30 d后進行調(diào)查。萌發(fā)培養(yǎng)基為：M1，1/2MS＋0.1 mg/L IBA＋30 g/L蔗糖＋5 g/L瓊脂＋1.5 g/L 活性炭；W1，WPM＋0.2 mg/L 6-BA＋30 g/L蔗糖＋5 g/L瓊脂＋1.5 g/L 活性炭，pH＝5.8。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

胚珠在發(fā)育階段經(jīng)過60 d后對其胚發(fā)育率進行計算統(tǒng)計，胚在萌發(fā)階段經(jīng)過30 d后對其胚萌發(fā)率進行計算統(tǒng)計[13-14]。

胚發(fā)育率/%＝（發(fā)育胚數(shù)/接種胚珠數(shù)）×100

胚萌發(fā)率/%＝（萌發(fā)胚數(shù)/接種胚珠數(shù)）×100

表1 葡萄雜交組合設(shè)計Table 1 The hybridization crosses of grapes

2 結(jié)果與分析

2.1 不同父本對幼胚生長發(fā)育的影響

將雜交組合‘紅寶石無核’ב玫瑰香’‘紅寶石無核’ב巨玫瑰’的雜交胚珠接種ER培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，研究不同父本對胚發(fā)育的影響。

表2的數(shù)據(jù)體現(xiàn)出不同雜交組合經(jīng)過胚珠發(fā)育培養(yǎng)階段和60 d的胚珠萌發(fā)培養(yǎng)階段，其胚發(fā)育率和胚萌發(fā)率有一定的差異。從表2中可以看出，雜交組合‘紅寶石無核’ב玫瑰香’的胚發(fā)育率和胚萌發(fā)率比雜交組合‘紅寶石無核’ב巨玫瑰’的胚發(fā)育率相對較高。兩種組合的胚發(fā)育率分別為9.47%和7.51%，胚萌發(fā)率分別為6.55%和2.95%。本研究說明，當(dāng)‘紅寶石無核’葡萄作母本，用‘玫瑰香’做父本比‘巨玫瑰’做父本進行胚挽救更容易成功。

2.2 不同發(fā)育培養(yǎng)基對幼胚發(fā)育的影響

從表3數(shù)據(jù)可以了解到，經(jīng)過在不同的發(fā)育培養(yǎng)基中培養(yǎng)的胚珠，其胚發(fā)育率有所不同。‘紅寶石無核’ב玫瑰香’在發(fā)育培養(yǎng)基Nitsch和ER培養(yǎng)基中的胚發(fā)育率分別為13.61%和7.51%。而‘紅寶石無核’ב巨玫瑰’在發(fā)育培養(yǎng)基Nitsch和ER培養(yǎng)基中的胚發(fā)育率分別為5.92%和2.95%。說明Nitsch培養(yǎng)基比ER培養(yǎng)基更適合2種雜交胚珠的發(fā)育。

2.3 不同萌發(fā)培養(yǎng)基對幼胚萌發(fā)的影響

由表4中的數(shù)據(jù)可以看出，雜交組合‘紅寶石無核’ב玫瑰香’在不同萌發(fā)培養(yǎng)基中經(jīng)過60 d的萌發(fā)培養(yǎng)階段，‘紅寶石無核’ב玫瑰香’雜交胚接種在1/2MS胚萌發(fā)培養(yǎng)基中的胚萌發(fā)率要高于接種在WPM萌發(fā)培養(yǎng)基中萌發(fā)率。但是，用這兩種培養(yǎng)基作為萌發(fā)培養(yǎng)基，其胚萌發(fā)率沒有特別大的差異，由此可以看出1/2MS和WPM都可以作為雜交組合‘紅寶石無核’ב玫瑰香’的萌發(fā)培養(yǎng)基，但是1/2MS作為‘紅寶石無核’ב玫瑰香’的萌發(fā)培養(yǎng)基更好。

3 討論與結(jié)論

無核葡萄胚挽救的成功與否，主要影響因素是材料的母本基因型。本試驗是以‘紅寶石無核’品種作為母本，‘玫瑰香’優(yōu)系和‘巨玫瑰’作為父本探究不同父本基因型對無核葡萄胚挽救的影響，以‘玫瑰香’為父本的胚發(fā)育率和胚萌發(fā)率比以‘巨玫瑰’為父本的胚發(fā)育率和萌發(fā)率相對較高。也就是二倍體間的雜交組合的成功率要高于二倍體與四倍體的雜交組合，說明葡萄的倍性不同相互雜交時有非常嚴重的雜交障礙，所以導(dǎo)致用二倍體×四倍體葡萄雜交很難獲得雜交植株后代。這也是‘紅寶石無核’ב巨玫瑰’葡萄的雜交組合胚挽救不容易成功的主要原因[11]。通過對不同發(fā)育培養(yǎng)基對幼胚發(fā)育的影響研究，本試驗得出的結(jié)論是：‘紅寶石無核’ב玫瑰香’在發(fā)育培養(yǎng)基Nitsch和ER培養(yǎng)基中的胚發(fā)育率分別為13.61%和7.51%。而‘紅寶石無核’ב巨玫瑰’在發(fā)育培養(yǎng)基Nitsch和ER培養(yǎng)基中的胚發(fā)育率分別為5.92%和2.95%。說明Nitsch培養(yǎng)基比ER培養(yǎng)基更適合2種雜交胚珠的發(fā)育。對雜交組合‘紅寶石無核’ב玫瑰香’在不同萌發(fā)培養(yǎng)基中經(jīng)過60 d的萌發(fā)培養(yǎng)認為，本組合雜交胚接種在1/2MS萌發(fā)培養(yǎng)基中的胚萌發(fā)率要高于接種在WPM萌發(fā)培養(yǎng)基中萌發(fā)率，1/2MS作為‘紅寶石無核’ב玫瑰香’的萌發(fā)培養(yǎng)基更好。

表2 不同親本基因型下幼胚的生長發(fā)育狀況Table 2 Growth and development of immature embryos from different parental genotypes

表3 不同培養(yǎng)基對胚珠發(fā)育的影響Table 3 Effect of different media on ovule development

表4 不同萌發(fā)培養(yǎng)基對胚萌發(fā)的影響Table 4 Effect of different germination medium on embryo germination