張玉梅 楊琳 戴培東 張騰藝

1991年，美國麻省理工學院的Huang等[1]首次提出了光學相干層析成像技術(optical coherence tomography，OCT)，并應用OCT完成了視盤的離體成像；1995年，奧地利維也納大學的Fetcher等[2]提出了基于頻譜干涉測量法的譜域OCT；1997 年，美國麻省理工學院的Chinn等[3]報道了基于掃頻光源的OCT。近年來，OCT經(jīng)過不斷改進，開發(fā)了新的光束傳輸通道和探頭，在生物醫(yī)學領域具有較大的應用潛力。目前，OCT不僅能快速實時成像，獲得微米(μm)級的高分辨率圖像，還可以對活體表面下深2～3 mm的組織微觀結(jié)構(gòu)進行三維成像，具有較大的層析能力；此外，OCT還可以與一些功能性檢查技術結(jié)合，如和多普勒測振技術相結(jié)合，可實現(xiàn)納米(nm)級的振動測量。我國OCT在醫(yī)學中的應用研究起步較晚，在耳科學的應用研究鮮有報道。

1 OCT的技術原理

OCT是一種基于光學干涉原理的新型成像儀器，其測量的是入射光在材料或組織內(nèi)部不同深度的散射和反射光強度，主要包含5個模塊：入射光源、參考光路、測量光路、探測器和數(shù)據(jù)處理。OCT分為時域OCT(time domain OCT，TD-OCT)和傅里葉域OCT(Fourier domain OTC，F(xiàn)D-OCT)，其中，TD-OCT出現(xiàn)較早，是第1～3代OCT的工作方式。TD-OCT是基于寬帶光源(SLD，超亮發(fā)光二極管)照明的邁克爾遜干涉儀，利用分光器將入射光分為參考光和測量光，被檢樣品的后向散射光和參考光路反射回來的參考光產(chǎn)生干涉，干涉信號輸出到光電探測器[電荷耦合器件(charge-coupled device, CCD)]，CCD將光信號轉(zhuǎn)換成電信號，并經(jīng)過信號采集、放大、濾波等數(shù)據(jù)處理，最后由計算機合成圖像。干涉信號強度對應樣品的反射強度，通過軸向移動參考鏡，得到樣品不同深度的反射率分布圖像，再通過樣品表面的橫向掃描，即可得到二維圖像，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。

圖1. TD-OCT的結(jié)構(gòu)示意圖 a. 寬帶SLD光源；b. 分光器；c. 組織；d. 參考鏡；e. 光電探測器；f. 數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)；g. 計算機

根據(jù)獲得光譜的方法不同，F(xiàn)D-OCT又分為掃頻源OCT(swept-source OCT，SS-OCT)和光譜OCT(spectral domain OCT，SD-OCT)。SS-OCT是基于掃頻光源，通過在寬帶光源后連接一個波長隨時間高速掃描的單色儀，再通過探測器記錄每一波長的信號進而得到干涉光譜，其參考光路中的參考鏡是固定的，在探測模塊中采用分光譜技術通過對干涉光譜進行快速傅立葉逆變換得到深度信息，從而將樣品不同深度的干涉信號進行一次性測量，相當于在時間上分頻譜；SD-OCT是基于光柵和透鏡的干涉成像光譜儀，光柵將干涉信號按照不同波長進行分光，再聚焦到線陣CCD同時測量，相當于在空間上分頻譜。與TD-OCT相比，盡管多了光譜探測裝置和額外的信號處理步驟，由于不需要移動參考鏡，逐點的深入掃描，先后探測樣品的各個深度信息，F(xiàn)D-OCT在成像速度和靈敏度上有了顯著的提高。與CT、MR、超聲等其他成像技術比較，OCT提供了前所未有的高分辨率圖像，其軸向(深度)分辨率達到10 μm，橫向分辨率達20 μm，可以進行病理組織學水平的成像和測量。OCT的軸向分辨率與中心波長成正比，與光源帶寬成反比，橫向分辨率與聚焦物鏡相關。

2 OCT在中內(nèi)耳的成像

2.1 TD-OCT的成像 2000年，美國加州大學的Zhao等[4]首次采用中心波長為856 nm、帶寬為25 nm的TD-OCT對固定大鼠顳骨的內(nèi)耳部分進行成像。該系統(tǒng)軸向分辨率為10～15 μm，成像速度為5～15 min，耳蝸內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)，如前庭膜、基底膜等可清晰成像，但精細的顯微解剖結(jié)構(gòu)，如毛細胞、Corti器和血管等無法成像，原因是缺少足夠的信號強度和分辨率。實驗還發(fā)現(xiàn)，采用其他光源(中心波長為1 310 nm)的TD-OCT系統(tǒng)無法對顯微解剖結(jié)構(gòu)成像。2001年，Pitris等[5]采用TD-OCT對人的離體顳骨，從鼓膜外對中耳腔進行成像，中耳的重要結(jié)構(gòu)均可成像，包括鼓膜、錘骨、砧骨和鼓膜張肌肌腱等。實驗發(fā)現(xiàn)，鼓膜的存在降低了圖像質(zhì)量，并且聽小骨的高散射性導致無法觀察到其后面的組織。上述研究表明,TD-OCT對更精細的中內(nèi)耳顯微結(jié)構(gòu)的顯示具有局限性。2002年，Heermann等[6]將TD-OCT和手術顯微鏡相結(jié)合，確定中耳重建手術中使用的聽骨鏈假體長度，并認為這是聽力恢復的關鍵。2009年，Just等[7-9]在耳科手術中先后利用TD-OCT對不同組織進行成像，例如卵圓窗壁和鐙骨足板。他們發(fā)現(xiàn)和正?；颊呦啾?，耳硬化癥和鼓室硬化癥患者的鐙骨足板存在不均勻和增厚現(xiàn)象。2010年，Djalilian等[10]采用手持TD-OCT對中耳膽脂瘤患者的膽脂瘤進行成像，并將患者中耳黏膜的OCT圖像與傳統(tǒng)組織學圖像進行對比，發(fā)現(xiàn)OCT圖像中高信號區(qū)域?qū)诮M織學圖像中有炎癥的中耳黏膜部分。

2.2 FD-OCT的成像 2004年，Wong等[11]采用SS-OCT分別從內(nèi)、外2個方向?qū)λ篮?～4 h大鼠的離體耳蝸進行了快速成像，獲得了具有代表性的前庭階、蝸管、鼓階、耳蝸軸和螺旋韌帶等結(jié)構(gòu)的OCT圖像。2007年，Pau等[12]采用與手術顯微鏡結(jié)合的SD-OCT對人的離體顳骨進行了成像研究。這個顳骨經(jīng)過手術處理保持了內(nèi)耳完整，實驗獲得了局部暴露卻依舊完整的耳蝸內(nèi)部組織，如鼓階和前庭階。該系統(tǒng)掃描時可實時觀察圖像，與B超相比，可實現(xiàn)非接觸成像。研究表明OCT具有用于引導耳蝸植入手術的潛力。2011年，Gao等[13]發(fā)現(xiàn)MRI和CT的分辨率不能滿足某些耳蝸軟組織形態(tài)的研究(MRI和CT成像分辨率分別為1 mm和0.5 mm，耳蝸尺寸約為1 cm，軟組織為10～100 μm)。他們采用SD-OCT進行了與聽力有關的耳蝸軟組織形態(tài)測量，實驗模型為自然生長的小鼠和存在聽力損傷并植入人工耳蝸的轉(zhuǎn)基因小鼠。研究發(fā)現(xiàn)SD-OCT可以檢測耳蝸發(fā)育過程中Corti器解剖結(jié)構(gòu)的細微變化，通過和石蠟切片對比，發(fā)現(xiàn)SD-OCT可以獲得常規(guī)組織學難以獲得的結(jié)構(gòu)信息，如不同基因型引起聽力損失所對應的軟組織變化。2012～2016年，報道了一系列FD-OCT在中耳炎癥疾病診斷中的應用，如Nguyen等[14]設計了一種手持OCT，可用于檢測中耳炎相關的細菌生物膜；Monroy等[15]發(fā)現(xiàn)OCT可以測量慢性和急性中耳炎中鼓膜和細菌生物膜的顯著差異；Hubler等[16]和Pande等[17]先后提出了不同的算法計算上述差異值的具體大小。

2.3 OCT的3D活體成像 2010年，Subhash等[18]采用SD-OCT對大鼠耳蝸進行3D活體成像。該系統(tǒng)采用近紅外寬帶光源，高速 InGaAs相機，通過在測量光路中引入X-Y方向2個相互垂直的掃描振鏡，獲得X、Y平面的掃描圖像，結(jié)合深度信息，使用計算機進行數(shù)據(jù)重構(gòu)，從而得到大鼠耳蝸的3D圖像。該系統(tǒng)具有較高的成像速度和分辨率，約0.45 s就可復原得到整個耳蝸的3D圖像，圖像大小為 512像素×128像素。該研究表明SD-OCT可應用于大鼠耳蝸結(jié)構(gòu)的3D活體成像，例如聽軟骨囊、前庭膜、基底膜、耳蝸蓋膜、Corti器、蝸軸頂部和第2轉(zhuǎn)等。2017年，Park等[19]研制了一種適合人體鼓膜3D活體成像的寬場SD-OCT探頭，其核心部件是測量光路中加入的中繼透鏡。該部件可保證橫向掃描范圍達7 mm，是原先的3.5倍，且采用對角線掃描的方式，減少了原先手持探頭掃描時運動產(chǎn)生的偽影。與光柵掃描相比，該系統(tǒng)僅通過掃描對角線即可構(gòu)造3D圖像，所需的二維圖像減少了一半。通過250～500個樣本量的掃描，證明該系統(tǒng)構(gòu)造同質(zhì)量3D圖像的時間比原先縮短了一半。該研究小組還應用上述OCT在人和動物進行了鼓膜活體實時成像實驗，發(fā)現(xiàn)每幅3D圖像均可在10 ms內(nèi)獲得，圖像大小為1 024像素×500像素。

3 與聽力有關的振動測量

多普勒OCT[20]是重要的功能成像模式之一，它將OCT與多普勒技術有機結(jié)合，可以在對被測樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)進行成像的同時，根據(jù)探測到的多普勒頻移來獲得樣品內(nèi)散射粒子的流速/振動信息，具有較高的臨床應用價值。在振動測量方面，多普勒OCT和激光多普勒測振儀(laser Doppler vibration，LDV)的功能類似，可實現(xiàn)高分辨率、非接觸和局部測量。二者的主要區(qū)別是，LDV采用的是激光光源，而OCT采用寬帶光源，后者相當于加了深度門控，因此一幅多普勒OCT圖像可獲取不同深度的位移信息，這是LDV無法實現(xiàn)的。2006年，Hong等[21]使用多普勒光學干涉顯微鏡(Doppler optical coherence microscope，DOCM)測量了哺乳動物離體耳蝸結(jié)構(gòu)中微米級組織的納米級振動，驗證了DOCM在與聽力相關振動測試中的可行性。他們的方法是采用2個聲光調(diào)制器產(chǎn)生500 kHz的穩(wěn)定差頻，對干涉信號的相位進行解析，從而得到位移信息，其本質(zhì)是具有外差檢測功能的SS-OCT。實驗結(jié)果表明，DOCM可用于哺乳動物耳蝸的體外培養(yǎng)研究，包括基底膜、網(wǎng)狀板、耳蝸蓋膜、外毛細胞。實驗中相位噪聲不僅受系統(tǒng)信噪比影響，還來源于其他途徑，例如不同光路引入的機械振動，或者環(huán)境隨機噪聲，可通過采用固定的機械設計，隔音和共光路干涉來降低。由于SS-OCT采用掃頻技術，其采集的相位數(shù)據(jù)無法與波長信號同步，故機械抖動以及環(huán)境噪聲無法排除，因而一些研究人員更傾向于采用SD-OCT進行振動測量。目前最新的偏振敏感OCT(phase-sensitive OCT，PS-OCT)能夠?qū)⒐庑盘枠O化，產(chǎn)生對比度更高的影像。2010年，Wang等[22]提出了一種PS-OCT，用來測量細胞器在Corti器內(nèi)納米級的振動，提高了<1 nm位移的微小振動測量靈敏度，且將能檢測的振動位移精確到0.5 mm。2012年，Subhash等[23]嘗試應用OCT對聽骨鏈的振動進行了研究。2013年，Chang等[24]對栗鼠整個中耳腔的振動進行了3D測量。近年來，該技術在臨床應用方面也有諸多研究，如2015年，Burkhardt 等[25]用OCT測量了模擬患有咽鼓管炎人耳鼓膜的振動，還測量了模擬患有中耳炎，存在中耳積液的人耳鼓膜振動[26]。2016年，Park等[27]和Dan等[28]分別設計了合適的成像探頭，對一系列患者進行了類似測量。

4 結(jié)語

一般而言，對于中耳成像，技術關鍵不在于OCT本身，而在于選用合適的成像探頭，大部分公司將OCT與耳鏡相結(jié)合設計成手持式探頭或安裝手術顯微鏡頭等。對于內(nèi)耳成像，OCT的缺點是只能觀察較淺層的組織結(jié)構(gòu)，對于較深層的組織，需要打開耳蝸壁進行成像，因而必須精確定位和鉆孔，確?；啄さ耐暾ujita等[29]曾設想采用小的探頭通過圓窗實現(xiàn)。為了研究內(nèi)耳的某些微觀結(jié)構(gòu)，如毛細胞，OCT的系統(tǒng)分辨率有待進一步提高，而OCT的軸向分辨率主要取決于光源的相干長度，相干長度越小，分辨率越高，受光源頻譜范圍的限制，軸向分辨率不可能無限提高；OCT的橫向分辨率和普通光學顯微鏡一樣，取決于物鏡的數(shù)值孔徑(numerical aperture， NA)，NA越大，橫向分辨率越高，然而當NA變大時，成像的深度范圍會縮小。實際設計時需綜合考慮分辨率和成像范圍，選擇合適的物鏡。多普勒OCT中，采用相位分辨方法計算相鄰行掃描之間的相位變化來提取測量值，但相位分辨法在低信噪比環(huán)境下存在較大的偏差，并且對環(huán)境的擾動非常敏感，為此學者們發(fā)展了一些改進算法，但仍具有局限性；另外，它只能測振動方向與光傳播方向平行的相對位移，無法得到絕對位移，其他方向的相對位移必須知道振動方向和光路的夾角，或者采用多光路檢測?？傊?，OCT的發(fā)展趨勢是向高成像速度、高成像分辨率、高探測深度、小體積和低成本方向發(fā)展。