丁金國 李曉倩 黃臻輝

摘 要 目的：建立一種測定血管緊張素氨基酸組成的柱前衍生高效液相色譜法。方法：血管緊張素經(jīng)酸水解產(chǎn)生的游離氨基酸，用AQC衍生后，以醋酸鈉溶液和乙腈作為流動相，流速為1.0 ml/min，經(jīng)AccQ·Tag色譜柱梯度洗脫，于波長254 nm處測定。通過外標法計算樣品中氨基酸組成。結果：His、Arg、Pro、Tyr、Val、Phe在濃度范圍0.02～1.00 mmol/ml內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系，Asp在0.02～0.75 mmol/ml濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系。結論：本實驗建立的分析方法分離效果較好，可用于血管緊張素氨基酸組成測定和肽含量測定。

關鍵詞 血管緊張素 氨基酸組成 肽含量 HPLC

中圖分類號：O657.72； TQ460.72 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2018）11-0098-05

Determination of amino acid composition of angiotensin amide by HPLC with precolumn derivation

DING Jinguo*， LI Xiaoqian， HUANG Zhenhui（SPH NO.1 Biochemical & Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200240， China）

ABSTRACT Objective： To establish an HPLC method with precolumn derivation to determine amino acid composition and peptide content of angiotensin amide. Methods： The free amino acids were derivatized with AQC after angiotensin amide was hydrolyzed by hydrochloric acid. The derivatives were eluted by gradient solutions composed of sodium acetate solution and acetonitrile on HPLC at flow rate of 1.0 ml/min and detective wavelength of 254 nm. The contents of amino acids in angiotensin amide were calculated based on external standard. Results： The standard curves were linear over the concentration range of 0.02～1.00 mmol/ml for His， Arg， Pro， Tyr， Val， and 0.02～0.75 mmol/ml for Asp. Conclusion： The method is suitable for the analysis of amino acid composition and peptide content of angiotensin amide.

KEy WORDS angiotensin amide； amino acid composition； peptide content； HPLC

氨基酸是多肽藥物最基本的組成單位，氨基酸組成分析可以測定多肽藥物的氨基酸組成，確定多肽的肽含量，初步確定多肽藥物的化學結構，對評價多肽藥物質(zhì)量具有重要意義[1]。進行多肽類藥物的氨基酸組成分析，需先將樣品水解成游離氨基酸，但大多數(shù)氨基酸不含有生色基團，無法用常規(guī)的紫外檢測器直接檢測。在此情況下，通?？刹捎酶咝ш庪x子交換色譜-積分脈沖安培法直接分離、測定[2]，或?qū)⒂坞x氨基酸轉(zhuǎn)化為具有較強紫外或熒光吸收的衍生物，使其有利于測定或分離。AQC（6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺碳酸鹽）能與一、二級氨基酸在柱前進行衍生化，反應迅速、產(chǎn)物穩(wěn)定，并可通過紫外檢測器檢測。

血管緊張素能直接作用于動脈血管平滑肌上的特異性受體，使小動脈強力收縮，升壓活性高于去甲腎上腺素[3-6]；它也是一種超短效的靜脈注射用血管收縮劑，起效快，作用消除也快?？煽焖倬_地控制血壓，而治療劑量無快速耐受性，注射部位滲漏不會引起組織壞死，給藥期間無心悸、心律失常、尿量減少等不良反應。因此，它在手術麻醉，特別是產(chǎn)科麻醉、高血壓患者麻醉、心臟手術、敗血性休克急救及血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑中毒治療中有重要作用[7-11]。我們對血管緊張素進行了質(zhì)量研究，建立了基于多肽工作對照品的HPLC含量測定方法，但不能測定氨基酸組分[12]。氨基酸組成分析研究是評價多肽藥物結構的重要手段，血管緊張素是由7種氨基酸組成的8肽藥物，鑒于其不含Cys（半胱氨酸）和Try（色氨酸），可采用酸水解法進行水解，并以AQC為柱前衍生化試劑，應用HPLC-UV法建立血管緊張素的氨基酸組成分析方法。氨基酸組成分析方法也可用于含量測定，無需多肽工作對照品，可豐富血管緊張素含量測定手段。

1 材料和方法

1.1 材料

血管緊張素（自制）；混合氨基酸標準溶液（各氨基酸含量除Cys為1.25 mmol/ml外，余均為2.5 mmol/ml）、AccQ·Tag色譜流動相A、B和衍生試劑盒（包括AQC衍生試劑粉末及稀釋劑、硼酸緩沖液）均購自Waters科技有限公司。

1.2 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀、自動進樣器、Waters 2489型UV/Vis檢測器和Empower 2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（Waters科技有限公司）；XS-205 DU十萬分之一天平（梅特勒-托利多公司）；TYXH-1旋渦混合器（上海比朗儀器有限公司）；CS101-2E鼓風干燥烘箱（重慶四達科學儀器有限公司）；真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：AccQ·Tag（3.9 mm×150 mm， 5 mm）；檢測波長254 nm；柱溫34 ℃；進樣量10 ml。流動相A：140 mmol/L醋酸鈉水溶液（磷酸和三乙胺調(diào)節(jié)pH為5.0）；流動相B：乙腈。線性梯度洗（v/v）脫程序為：0 min，0% B；16 min，8% B；18 min，9% B；24 min，18% B；32 min，33% B；34 min，33% B；35 min，100% B；37 min，100% B；38 min，0% B；45 min，0% B。流速：1 ml/min。

1.3.2 樣品水解

精密稱取血管緊張素樣品15.0 mg，置試管中，加6 mol/L鹽酸溶液（含0.1%苯酚[2]）6 ml，并在冰鹽浴中放置，反復充氮氣后抽真空將試管熔封，于110 ℃水解24 h后，取出放冷，加高純水定容至50 ml。精密量取1 ml水解液，真空干燥并清洗除去殘余的酸液后，用高純水溶解定容至10 ml。

1.3.3 氨基酸衍生方法

1）衍生劑溶液 將烘箱預熱至55 ℃。輕彈衍生試劑盒中2A瓶，確保所有的AQC衍生試劑粉末完全落在瓶底，移取2B瓶中衍生試劑稀釋劑1 ml加入2A瓶中，加蓋密封，振搖10 s，置烘箱中加熱，直至衍生試劑粉末完全溶解，備用。取清潔衍生管1根，加硼酸鹽緩沖液80 ml，再加上述制備的衍生劑溶液20 ml，渦旋混合10 s即得。

2）氨基酸標準溶液衍生 吸取100 ml混合氨基酸標準溶液，加0.9 ml高純水稀釋，混勻備用。取清潔衍生管，加入已稀釋的混合氨基酸標準溶液10 ml，再加硼酸鹽緩沖液70 ml，渦旋混合，在渦旋狀態(tài)下加入衍生劑溶液20 ml，并保持渦旋混合10 s，在室溫放置1 min，將衍生管封口置55 ℃烘箱中10 min，取出備用。

3）樣品水解溶液衍生 取清潔衍生管，加入樣品水解溶液20 ml、硼酸鹽緩沖液60 ml，渦旋混合，在渦旋狀態(tài)下加入衍生劑溶液20 ml，并保持渦旋混合10 s，在室溫放置1 min，將衍生管封口置55 ℃烘箱中10 min，取出備用。

2 結果

2.1 色譜條件優(yōu)化及適用性評價

對混合氨基酸標準液和空白進行衍生處理后，分別進樣，如圖1所示，從從左至右依次為衍生劑水解的AMQ峰、Asp、Ser、Glu、Gly、His、NH3、Arg、Thr、Ala、Pro、Cys、Tyr、Val、Met、Lys、Ile、Leu、Phe。依1.3.1項下色譜條件，各氨基酸峰的理論塔板數(shù)均不低于20 000，分離度均大于1.5。在該色譜系統(tǒng)條件中除流動相配比的變化外，柱溫對各氨基酸色譜峰之間的分離度有很大的影響。在研究中發(fā)現(xiàn)，柱溫37 ℃條件下，Cys和Tyr色譜峰完全重合。通過柱溫的改變發(fā)現(xiàn)柱溫較高時，Gly/His的分離度有所增加，但Cys/Tyr間的分離度變差，甚至完全不能分離，溫度降低，Gly/His的分離度降低，但Cys/Tyr的分離度增加，通過不斷的摸索發(fā)現(xiàn)在34 ℃條件下，各氨基酸色譜峰的分離度均能達到要求（表1）。

2.2 線性關系、重復性與樣品溶液穩(wěn)定性試驗

配制濃度為0.02、0.25、0.50、0.75、1.00 mmol/ml的系列混合氨基酸標準溶液。對各濃度溶液進行衍生化處理后，進樣測定峰面積。以氨基酸濃度對峰面積繪制標準曲線（表2）。結果表明，除天冬氨酸（Asp）之外，其余6種氨基酸在0.02～1.00 mmol/ml濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系；天冬氨酸在濃度較高的時候線性關系較差，而在0.02～0.75 mmol/ml濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系。

取供試品溶液，衍生，重復進樣6針，測定峰面積，以Asp、His、Arg、Pro、Tyr、Val、Phe氨基酸的峰面積計算RSD，分別為1.09%、1.11%、1.17%、1.07%、1.10%、1.10%、1.07%。結果表明本法對同一樣品重復測定的精密度良好。將衍生后的同一混合氨基酸標準溶液分別于0、3、6、9、12、15 h進樣，測定峰面積，計算得各氨基酸的RSD分別為1.09%、1.11%、1.17%、1.07%、1.10%、1.10%、1.07%。結果顯示衍生后的混合氨基酸標準溶液在15 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3 樣品水解條件優(yōu)化與氨基酸組成測定

多肽水解的目的是破壞肽鍵，產(chǎn)生游離的氨基酸。在試驗過程中考察16 h和24 h時各氨基酸的水解情況（表3）。結果表明，在16 h時，His和Val水解程度較低，達不到理論值。因此仍采用24 h。分別取各批次血管緊張素樣品衍生溶液10 ml注入液相色譜儀，記錄色譜圖（圖2），按外標法以峰面積計算各氨基酸的摩爾數(shù)。血管緊張素以Asp、Arg、His、Pro和Phe的摩爾數(shù)之和除以5作為1，計算各氨基酸的相對比值（表4）。

2.4 樣品肽含量測定

根據(jù)上述氨基酸比值的數(shù)據(jù)以及美國藥典氨基酸組成分析方法中所述，其中Asp、Arg、Phe這三個氨基酸水解情況更好，以這三個氨基酸摩爾數(shù)之和的平均數(shù)，計算肽含量。按美國藥典氨基酸組成分析方法[13]中的公式100 × m/ms（其中m為測得值，ms為稱量值），結果如表5所示。

3 討論

氨基酸組成分析中干擾性因素較多，在試驗之前應充分清洗鈍化液相色譜，盡量減少液相系統(tǒng)對測定的干擾。取下色譜柱，將各管路中的有機相用高純水進行過渡沖洗，用30%磷酸清洗1 h左右，再換高純水沖洗至出水管路口pH為6～7。將清洗好的管路進行鈍化，用6 mol/L硝酸溶液沖洗1 h左右，再換高純水沖洗至出水管路口pH為6～7，完成鈍化。除色譜儀器的準備之外，試驗中所用玻璃器具如樣品水解管、衍生管等，應在試驗前用1 mol/L鹽酸溶液煮1 h或在濃硝酸中浸泡后，用高純水沖洗數(shù)次，烘干放置于密閉器具中備用。試驗過程應盡量無塵，并戴無塵手套和口罩，防止雜蛋白的影響。

氨基酸分析中常見的柱前衍生試劑主要有OPA（鄰苯二甲醛）、FMOC-Cl（氯甲酸芴甲酯）、FITC（異硫氰酸熒光素）、AQC（6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺碳酸鹽），其中OPA不能與仲氨酸反應；FMOC-Cl衍生產(chǎn)物干擾測定，需用戊烷將反應過程中剩余的衍生試劑萃取出，以終止衍生反應并避免衍生物的水解；FITC要求高溫和較長時間的反應；因此選用AQC，其能與一、二級氨基酸進行快速衍生化反應，且衍生產(chǎn)物穩(wěn)定，可通過UV檢測，剩余試劑在衍生化反應過程中水解，不干擾測定[1]。研究結果表明，采用AQC作衍生化試劑的柱前衍生化高效液相色譜法具有分離度良好、重復性好等優(yōu)點，能較好地測定多肽藥物中氨基酸的相對比值，對多肽藥物的質(zhì)量控制和結構確定都有一定的意義。

在氨基酸組成測定結果已知時，如已知多肽的分子量，可通過氨基酸分析的方法進行肽含量標定。通常在氨基酸水解過程中，Trp、Cys、Thr、Ser、Met容易完全或部分破壞，Ile、Val不容易完全裂解，而有些氨基酸如Gly、Ser容易被污染而使結果發(fā)生偏差。其中能較好、穩(wěn)定水解的氨基酸主要有Asp、Glu、Ala、Leu、Phe、Lys、Arg，可以用這些穩(wěn)定水解的氨基酸的摩爾數(shù)計算肽含量。在研究中發(fā)現(xiàn)，通過液相法[12]測定血管緊張素的肽含量與氨基酸組成測定的結果稍有不同，其中通過氨基酸組成測定得到的肽含量相對較低，分析原因認為，樣品在酸水解過程，以及清洗去除酸液和殘渣的過程中，發(fā)生了一定程度的損失，而混合氨基酸標準液因本身由游離氨基酸組成，未經(jīng)過酸水解和后處理清洗過程，故使樣品測得的值較低。在之后的研究中，預采取將混合氨基酸標準液經(jīng)過酸水解過程，來校正樣品的損失，或通過已知肽含量的標準肽，經(jīng)酸水解處理做回收率試驗，以校正樣品的損失。

在多肽藥物質(zhì)量研究的過程中，液相法測定藥物含量需要對照品，有些藥物含量測定用對照品不能獲得，肽含量的確定存在困難。而氨基酸組成分析的方法，能很好地用于多肽藥物肽含量的測定，因此在多肽藥物的質(zhì)量控制中有十分重要的作用。

致謝：感謝霍建麗、耿敏對本文的貢獻。

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