王 飛， 秦方錦， 王先挺， 翁 穎， 林 輝

(1.寧波市種植業(yè)管理總站， 浙江 寧波 315000； 2.鄞州區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)站， 浙江 寧波 315100； 3.慈溪市農(nóng)業(yè)監(jiān)測中心， 浙江 寧波 315300； 4.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境資源與土壤肥料研究所， 浙江 杭州 310021)

土壤微生物群落是土壤生態(tài)系統(tǒng)最為重要和活躍的功能組分，在驅(qū)動(dòng)土壤有機(jī)質(zhì)分解、養(yǎng)分循環(huán)等方面有著重要作用[1]。由于對土壤環(huán)境條件變化敏感，土壤微生物群落功能多樣性也常被用作評價(jià)土壤質(zhì)量和健康狀況的重要生物學(xué)指標(biāo)[2-4]。隨著土壤微生物研究方法的發(fā)展，許多新技術(shù)被引入土壤微生物群落功能多樣性研究中，其中MicroRespTM技術(shù)是一種基于土壤微生物代謝功能研究土壤微生物生態(tài)的方法，因其測定具有簡單、靈敏和快捷等優(yōu)點(diǎn)而被越來越多地應(yīng)用于土壤微生物群落功能多樣性研究[5-6]。

施肥是農(nóng)業(yè)中最為重要和普遍的增產(chǎn)手段，不同施肥方式不僅影響土壤養(yǎng)分循環(huán)和土壤肥力，對土壤微生物活性、群落結(jié)構(gòu)及功能多樣性也會(huì)產(chǎn)生影響。有研究表明不同施肥條件下土壤酶活性和微生物群落功能多樣性的差異較大，土壤脲酶和脫氫酶活性可作為土壤肥力的指標(biāo)[7]。羅希茜等[8]研究結(jié)果表明，不同施肥對土壤微生物功能多樣性產(chǎn)生不同影響，從而影響土壤有機(jī)質(zhì)中碳、氮含量。雖然土壤生態(tài)功能變化和微生物群落響應(yīng)正逐漸成為施肥方式研究的熱點(diǎn)，但以往研究主要集中在土壤生物碳、土壤酶和土壤理化性質(zhì)等方面[9-11]，對于長期定位觀測不同施肥方式對土壤微生物群落功能特性的影響關(guān)注較少。筆者基于5 a定位試驗(yàn)，采用MicroRespTM技術(shù)研究長期施用有機(jī)肥、沼液肥和化肥配施有機(jī)肥或沼液肥等不同施肥方式下土壤微生物代謝功能差異，旨在探索不同施肥方式對土壤微生物群落功能的影響，為當(dāng)?shù)剡x擇適宜的施肥模式來提高耕地土壤質(zhì)量和實(shí)現(xiàn)耕地永續(xù)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)區(qū)設(shè)在東吳鎮(zhèn)生態(tài)農(nóng)業(yè)園(29°49′48.8″ N，121°43′53.5″ E)，位于鄞州區(qū)東部水網(wǎng)平原，屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候區(qū)，因?yàn)l臨東海而且有海洋性氣候特征。該地區(qū)年均日照2 070 h，年均太陽輻射461.4 kJ·cm-2，年均溫度16.2 ℃。該地區(qū)年均降水量1 538.8 mm，年均雨日174 d，年均相對濕度82.4%[12]。試驗(yàn)點(diǎn)地勢平坦，常年種植單季水稻。供試田塊土壤類型為脫潛水稻土，黃黏田亞類，青紫泥田土種，質(zhì)地為壤土。試驗(yàn)前耕層土壤pH值為5.33，w(有機(jī)質(zhì))為11.2 g·kg-1，w(堿解氮)、w(有效磷)和w(速效鉀)分別為13.8、2.27和48.6 mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

于2011年在園區(qū)設(shè)置不同施肥方式的5 a連續(xù)定位試驗(yàn)點(diǎn)，共設(shè)6個(gè)處理：不施肥對照(CK)、純化肥(NPK)、純有機(jī)肥(HOM)、中量有機(jī)肥+化肥(MOM)、純沼液肥(HBS)和中量沼液肥+化肥(MBS)。各處理施肥方式見表1，其中純化肥區(qū)施肥量(N、P2O5和K2O用量分別為249、63和13 kg·hm-2·a-1)按測土配方施肥法確定，純有機(jī)肥區(qū)和純沼液肥區(qū)施肥量按當(dāng)?shù)亓?xí)慣施肥確定，中量肥區(qū)施肥用量減半。各處理面積為666.7 m2，不設(shè)重復(fù)。

表1各處理施肥方式

Table1Designoffertilizationsystemkg·hm-2·a-1

“—”表示無數(shù)據(jù)。CK為對照處理，NPK為純化肥處理，HOM為純有機(jī)肥處理，MOM為中量有機(jī)肥+化肥處理，HBS為純沼液肥處理，MBS為中量沼液肥+化肥處理。

供試化肥為當(dāng)?shù)剞r(nóng)資市場優(yōu)品肥料，有機(jī)肥為當(dāng)?shù)厣a(chǎn)的豬糞源商品有機(jī)肥，沼液肥由附近豬糞源沼氣工程物流配送。所投入有機(jī)肥和沼液肥氮磷鉀養(yǎng)分和重金屬含量及其年帶入量見表2～3，商品有機(jī)肥料符合NY 525—2012《有機(jī)肥料》的重金屬限量，沼液肥在國內(nèi)尚無相應(yīng)重金屬限量標(biāo)準(zhǔn)。參照GB 5084—2005《農(nóng)田灌溉水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》，部分年份沼液肥鎘、銅和鋅含量超標(biāo)。

表2有機(jī)肥和沼液肥的pH值和氮磷鉀養(yǎng)分含量

Table2pHvalueandnitrogen,phosphorusandpotassiumcontentoforganicmanureandbiogasslurrymanure

肥料種類pH值w(N)/(g·kg-1)w(P205)/(g·kg-1)w(K2O)/(g·kg-1)有機(jī)肥7.28～8.091.930～2.7802.240～6.0101.680～2.820沼液肥7.65～8.140.040～0.0510.008～0.0170.024～0.046

1.3 土樣采集與處理

于2015年12月單季稻收獲后按“S”形分別使用約5 cm孔徑取土器采集各處理0～20 cm耕層土樣，采集時(shí)每10點(diǎn)混合組成一個(gè)代表土樣，每個(gè)處理采集3個(gè)代表土樣，6個(gè)處理共采集18個(gè)代表土樣裝入塑封袋并置于冰塊上帶回實(shí)驗(yàn)室。新鮮土樣剔除動(dòng)植物殘?bào)w后，過2 mm孔徑篩，4 ℃條件下冷藏保存，1周內(nèi)完成MicroRespTM分析。具體取樣方法執(zhí)行NY/T 1121.1—2006《土壤檢測第1部分：土壤樣品的采集、處理和貯存》[13]。

1.4 分析方法

采用MicroRespTM方法進(jìn)行土壤微生物群落功能分析。MicroRespTM是一種基于土壤微生物代謝功能反映土壤微生物群落的測定方法，利用土壤在不同碳源誘導(dǎo)下的CO2產(chǎn)生情況來表征原位土壤微生物群落水平的生理特征[14]。操作步驟如下：

(1)預(yù)培養(yǎng)活化微生物：根據(jù)土壤含水率，將4 ℃ 條件下冷藏保存的土壤樣品濕度調(diào)至20%～30%，均勻稱取50 g至燒杯中，25 ℃條件下密封預(yù)培養(yǎng)4 d。

(2)檢測微孔板制備：將甲酚紅(12.5 mg·L-1)、氯化鉀(150 mmol·L-1)和碳酸氫鈉(2.5 mmol·L-1)混合形成的指示劑，溶解在0.03 g·mL-1純化瓊脂(sigma)中，混合均勻后取150 μL指示瓊脂填加到檢測板微孔中，配制好的檢測板存放在含有濕巾和堿石灰的避光干燥器皿中待用，以防變干或與空氣中的CO2反應(yīng)。

(3)檢測：將待測土樣均勻填加到96孔深孔板中，并在每個(gè)深孔板中按照一定順序添加16種碳源底物：水、L-丙氨酸、L-阿拉伯糖、精氨酸、半胱氨酸鹽酸鹽、檸檬酸、D-果糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、γ-氨基丁酸、L-賴氨酸、L-蘋果酸、N-乙酰葡糖胺、草酸、原兒茶酸和海藻糖分別為0、30、30、30、30、30、30、30、30、30、30、30、7.5、30、7.5和30 mg·g-1。將檢測板倒扣在深孔板上，用專用夾子固定，在25 ℃條件下培養(yǎng)6 h。在酶標(biāo)儀570 nm波長下測定檢測板在土樣培養(yǎng)前及培養(yǎng)6 h后的吸光值，利用吸光值變化計(jì)算CO2產(chǎn)生率(%)。

CO2產(chǎn)生率和吸光值通用標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算公式[15]為

(1)

ρCO2=a+b/(1+d×Ai) ，

(2)

WCO2=(ρCO2/100)×L×(44/22.4)×

(12/44)×[273/(273+T)]/(W×U)/t。

(3)

表3有機(jī)肥和沼液肥重金屬殘留量及年帶入量

Table3Theresidualconcentrationofheavymetalsinorganicmanureandbiogasslurrymanureandtheannualinputofheavymetalsintosoil

重金屬商品有機(jī)肥沼液肥殘留含量1)/(mg·kg-1)HOM年帶入量/(mg·hm-2·a-1)MOM年帶入量/(mg·hm-2·a-1)殘留含量/(mg·L-1)HBS年帶入量/(mg·hm-2·a-1)MBS年帶入量/(mg·hm-2·a-1)總鎘(Cd)0.62～1.36 13 950 15 300.00.004 5～0.012 1 101.25 136.125總鉻(Cr)2.29～16.6351 525187 087.50.038 4～0.098 4864.001 107.000總汞(Hg)0.22～0.754 9508 437.5未檢出00總鉛(Pb)5.26～8.95118 350100 687.50.001 0～0.012 322.50138.375總砷(As)0～15.040169 200.0未檢出00總銅(Cu)652.46～786.7314 680 3508 850 712.50.211 9～1.254 64 767.7514 114.250總鋅(Zn)2 102.33～2 377.184 730 242526 743 275.01.105 7～2.363 424 878.2526 588.250

HOM為純有機(jī)肥處理，MOM為中量有機(jī)肥+化肥處理，HBS為純沼液肥處理，MBS為中量沼液肥+化肥處理。1)以烘干基計(jì)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

Shannon-Wiener多樣性指數(shù)、Shannon-Wiener均勻度指數(shù)和Simpson多樣性指數(shù)是表征土壤微生物群落多樣性常用指數(shù)，不同的多樣性指數(shù)可以表征土壤微生物多樣性的不同方面。Shannon-Wiener多樣性指數(shù)能反映土壤微生物群落利用碳源類型的多與少，即功能多樣性，指數(shù)值越高，表明該系統(tǒng)土壤微生物群落功能多樣性越高。Shannon-Wiener均勻度指數(shù)可度量群落物種均一性，均勻度指數(shù)越大，種類之間個(gè)體分配越均勻，生物多樣性就越高[16]。Simpson多樣性指數(shù)也可用于判斷群落多樣性，群落中物種越多,各個(gè)體分配越均勻，Simpson指數(shù)就越高，群落多樣性也越高[17]。Shannon-Wiener物種豐富度指數(shù)、Shannon-Wiener均勻度指數(shù)和Simpson多樣性指數(shù)計(jì)算方法參照文獻(xiàn)[18]。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2004和SPSS 15.0軟件處理，差異顯著性分析采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和最小顯著差法(LSD)，作圖采用SigmaPlot 10.0軟件，聚類分析采用SPSS 15.0軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同施肥方式下土壤理化性質(zhì)和重金屬累積

5 a不同施肥方式下土壤理化性質(zhì)和重金屬殘留情況見表4。從土壤理化性質(zhì)上看，有機(jī)肥處理(HOM和MOM)和沼液處理(HBS和MBS)土壤pH值、有機(jī)質(zhì)含量和氮磷養(yǎng)分含量有明顯提高，但沼液提高效果不如有機(jī)肥，此與以往研究報(bào)道[17]基本一致。從重金屬殘留上看，與CK土壤相比，沼液處理(HBS和MBS)土壤重金屬含量無明顯變化，表明該施肥方式?jīng)]有明顯造成土壤重金屬累積；而有機(jī)肥處理(HOM和MOM)除土壤Hg、As、Pb、Cd、Cr和Ni含量較CK無明顯變化外，Cu和Zn含量有顯著增加(P<0.05)，且HOM處理少量土樣Zn含量少量超標(biāo)(標(biāo)準(zhǔn)限值為200 mg·kg-1)[19]。這與各施肥方式的重金屬年帶入量有關(guān)，有機(jī)肥處理重金屬年帶入量明顯較沼液處理高，但各處理土壤重金屬累積量基本在限值內(nèi)。

表4不同施肥方式下土壤理化性質(zhì)和重金屬殘留量

Table4Soilpropertiesandheavymetalresiduesunderdifferentfertilizationregimes

處理w(有機(jī)質(zhì))/(g·kg-1)w(全氮)/(g·kg-1)w(堿解氮)/(mg·kg-1)w(有效磷)/(mg·kg-1)w(速效鉀)/(mg·kg-1)w(全磷)/(g·kg-1)w(全鉀)/(g·kg-1)pH值w(全鹽量)/(g·kg-1)CK4.41±0.10d0.29±0.04b229±4bc18.3±2.4d103±14b0.71±0.08c17.0±0.7a5.2±0.2de0.66±0.08bcHOM5.63±0.15a0.38±0.01a273±16a91.8±13.5a187±61a1.54±0.25a17.1±1.2a5.9±0.0a0.94±0.15aMOM5.20±0.43b0.35±0.02a249±26ab58.3±2.5b127±25b1.13±0.16b16.2±0.3a5.6±0.1b0.78±0.05bNPK4.59±0.23cd0.31±0.02b219±9c8.8±2.7d106±16b0.68±0.13c16.4±1.2a5.1±0.1e0.41±0.04dHBS4.95±0.18bc0.38±0.01a243±4bc44.4±12.3bc125±24b0.85±0.14c16.0±0.8a5.4±0.1bc0.63±0.07cMBS5.05±0.16b0.37±0.01a248±12ab37.8±9.5c122±23b0.84±0.07c16.0±0.7a5.3±0.1cd0.53±0.07cd處理w(總重金屬)/(mg·kg-1)w(Hg)/(mg·kg-1)w(As)/(mg·kg-1)w(Pb)/(mg·kg-1)w(Cd)/(mg·kg-1)w(Cr)/(mg·kg-1)w(Cu)/(mg·kg-1)w(Zn)/(mg·kg-1)w(Ni)/(mg·kg-1)CK279±4c0.26±0.04a4.80±0.11ab53.3±1.4a0.27±0.02a56.6±0.3ab32.7±1.0de111±4cd20.2±0.5abHOM406±12a0.26±0.06a4.51±1.23ab48.6±2.9b0.28±0.02a59.8±2.6ab63.2±1.9a208±10a21.3±1.1aMOM339±8b0.25±0.03a3.97±0.94b48.1±3.6b0.32±0.03a64.0±2.7a48.6±1.6b154±7b20.1±0.9abNPK267±13c0.28±0.04a5.32±0.44a48.8±0.8b0.27±0.00a58.9±11.4ab31.2±0.9e100±2d21.8±1.0aHBS279±19c0.28±0.03a4.93±0.26ab51.1±1.0ab0.28±0.03a47.7±11.9b38.2±1.7c115±5c20.7±0.4abMBS279±8c0.30±0.03a4.57±0.21ab50.4±3.0ab0.29±0.06a50.4±7.4b34.3±2.2d119±9c19.1±2.0b

CK為對照處理，NPK為純化肥處理，HOM為純有機(jī)肥處理，MOM為中量有機(jī)肥+化肥處理，HBS為純沼液肥處理，MBS為中量沼液肥+化肥處理。同列數(shù)據(jù)后英文小寫字母不同表示不同處理間某指標(biāo)差異顯著(P<0.05)。

2.2 不同施肥方式對土壤微生物代謝活性及其群落功能多樣性的影響

土壤微生物基礎(chǔ)呼吸CO2產(chǎn)生率表征土壤微生物群落對碳源底物的利用能力，是反映土壤微生物代謝活性的有效指標(biāo)。MicroRespTM測定結(jié)果顯示，CK、HOM、MOM、NPK、MBS和HBS處理CO2產(chǎn)生率分別為0.51、0.79、0.75、0.4、0.61和0.36 μg·g-1·h-1(圖1)。除HBS處理外，其他處理土壤呼吸強(qiáng)度均高于或顯著高于CK和NPK?？梢?，不同施肥方式對土壤微生物代謝活性產(chǎn)生明顯差異。其中，施用有機(jī)肥或有機(jī)肥、沼液肥配施化肥可促進(jìn)土壤呼吸作用。這與文獻(xiàn)[9-11]的研究結(jié)果相近。分析認(rèn)為，適量施用有機(jī)肥或沼液肥能增加土壤有機(jī)碳含量，進(jìn)而通過提高土壤微生物生物量及活性增強(qiáng)土壤呼吸強(qiáng)度。也有研究[20]指出，重金屬對土壤基礎(chǔ)呼吸作用存在濃度效應(yīng)，重金屬脅迫可刺激土壤CO2釋放，尤其是Cu和Zn。該研究中有機(jī)肥施用后土壤Cu和Zn含量明顯增加也支持了這一論點(diǎn)。此外，長期高量施用沼液肥導(dǎo)致土壤呼吸降低，表明該施肥方式對土壤微生物代謝活動(dòng)具有抑制作用，這可能是由于長期施用大量單一沼液使土壤微域環(huán)境發(fā)生改變，從而對土壤微生物適宜性造成影響，致使土壤微生物代謝活性下降。

CK為對照處理，NPK為純化肥處理，HOM為純有機(jī)肥處理，MOM為中量有機(jī)肥+化肥處理，HBS為純沼液肥處理，MBS為中量沼液肥+化肥處理。直方柱上方英文小寫字母不同表示不同處理間CO2產(chǎn)生率差異顯著(P<0.05)。圖1 不同施肥處理對土壤平均CO2產(chǎn)生率的影響Fig.1 Effects of different fertilization treatments on the average production rate of soil CO2

不同施肥方式下Shannon-Wiener多樣性指數(shù)、Shannon-Wiener均勻度指數(shù)和Simpson多樣性指數(shù)見表5。各處理Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)變化趨勢表現(xiàn)一致，由大到小依次均為MOM、NPK、CK、HOM、MBS和HBS處理。經(jīng)差異顯著性分析，HOM、MOM和NPK處理與CK無顯著差異(P>0.05)，而HBS處理顯著低于CK(P<0.05)。此外，從Simpson多樣性指數(shù)上看，HBS處理也顯著

低于CK及其他處理(P<0.05)。可見，不同施肥方式對土壤微生物群落功能多樣性影響也有所不同。首先，MOM和NPK處理3種指數(shù)均較大，表明有機(jī)肥配施化肥和氮磷鉀配合施肥的土壤微生物種類較多，分布較均勻，且對碳源利用程度也較高。這與張逸飛等[7]和孫瑞等[21]的研究結(jié)果類似。分析認(rèn)為這是由于有機(jī)肥和礦物質(zhì)肥料本身為土壤微生物提供了較多營養(yǎng)物質(zhì)，有利于土壤微生物均衡生長，提高物種豐富度和優(yōu)勢度[22]。其次，該研究中HBS處理各指數(shù)均最低，這與李軼等[23]研究發(fā)現(xiàn)單施沼液會(huì)降低土壤微生物群落多樣性的結(jié)果吻合，這可能是由于長期單一施用沼液會(huì)促進(jìn)某些微生物種群生長代謝，但對其他微生物種群生長代謝產(chǎn)生抑制作用，致使土壤微生物群落多樣性下降。

表5不同施肥方式下土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)

Table5Functionaldiversityindicesofthesoilmicrobialcommunitiesunderdifferentfertilizationregimes

處理Shannon-Wiener多樣性指數(shù)Shannon-Wiener均勻度指數(shù)Simpson多樣性指數(shù)CK2.556±0.003a0.922±0.001a0.912±0.003aHOM2.547±0.006a0.919±0.002a0.914±0.001aMOM2.592±0.019a0.935±0.007a0.920±0.003aNPK2.564±0.018a0.925±0.007a0.914±0.004aMBS2.541±0.017ab0.916±0.006ab0.912±0.003aHBS2.483±0.079b0.896±0.028b0.900±0.012b

CK為對照處理，NPK為純化肥處理，HOM為純有機(jī)肥處理，MOM為中量有機(jī)肥+化肥處理，HBS為純沼液肥處理，MBS為中量沼液肥+化肥處理。同列數(shù)據(jù)后英文小寫字母不同表示不同處理間某指標(biāo)差異顯著(P<0.05)。

2.3 不同施肥方式對土壤微生物群落代謝結(jié)構(gòu)的影響

為探討不同施肥方式土壤微生物群落代謝結(jié)構(gòu)變化，對不同碳源底物呼吸速率數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。如圖2所示，6個(gè)處理可分為2個(gè)聚類簇，HOM和MOM處理土壤微生物群落代謝結(jié)構(gòu)相似度較高，聚為一簇(聚類簇1)，其余處理聚為另一簇(聚類簇2)。進(jìn)一步分析聚類簇2中各處理發(fā)現(xiàn)，MBS處理與其他處理的距離較大，表現(xiàn)出較不同的土壤微生物群落代謝結(jié)構(gòu)特征；而HBS和NPK處理土壤微生物群落代謝結(jié)構(gòu)相似度較高，可以推測沼液肥和化肥對土壤微生物群落代謝存在交互影響。綜上可知，相較于化肥和沼液肥，有機(jī)肥對土壤微生物群落代謝結(jié)構(gòu)的影響更大，這可能與施用有機(jī)肥后土壤養(yǎng)分發(fā)生變化有關(guān)。BAUSENWEIN等[24]認(rèn)為微生物群落結(jié)構(gòu)主要受有機(jī)質(zhì)調(diào)控。WAKELIN等[25]研究也發(fā)現(xiàn)微生物群落結(jié)構(gòu)改變與碳、氮、鉀和鈉有關(guān)。該研究中施用有機(jī)肥后土壤有機(jī)質(zhì)和氮鉀養(yǎng)分含量明顯提高也支持了這一論點(diǎn)。

CK1～3為對照處理3個(gè)樣本，NPK1～3為純化肥處理3個(gè)樣本，HOM1～3為純有機(jī)肥處理3個(gè)樣本，MOM1～3為中量有機(jī)肥+化肥處理3個(gè)樣本，HBS1～3為純沼液肥處理3個(gè)樣本，MBS1～3為中量沼液肥+化肥處理3個(gè)樣本。圖2 不同施肥方式下土壤微生物群落代謝結(jié)構(gòu)的分層聚類分析Fig.2 Hierarchical cluster analysis of the metabolic structure of soil microbial community under different fertilization regimes

2.4 土壤理化性質(zhì)及重金屬累積與土壤微生物群落代謝的關(guān)聯(lián)分析

通過將土壤理化性質(zhì)及重金屬因子與土壤微生物代謝活性及群落多樣性進(jìn)行相關(guān)分析(表6)發(fā)現(xiàn)，土壤理化性質(zhì)(除全氮、全鉀外)和重金屬總殘留量分別與土壤微生物呼吸速率呈極顯著或顯著正相關(guān)，其中以土壤pH值及全鹽量、全磷、Cu和Zn含量與土壤微生物呼吸作用的關(guān)系最密切，相關(guān)性較高(R2>0.7)。此外，各土壤理化因素和重金屬因子中，僅有土壤Cr含量與Shannon-Wiener多樣性指數(shù)呈顯著正相關(guān)，但相關(guān)性不高(R2=0.569)，表明在較低濃度范圍內(nèi)提高土壤Cr含量水平可能增加土壤微生物群落類型。

綜上，HOM和MOM處理使土壤微生物呼吸強(qiáng)度增加可歸結(jié)于土壤pH值提高及全磷、Cu和Zn含量增加，其中土壤Cu含量是主要影響因子，表明土壤中Cu含量變化會(huì)改變土壤微生物群落代謝利用行為。這與郭星亮[26]研究結(jié)果一致，Cu可提高微生物群落對高聚物類碳源的轉(zhuǎn)化利用，但也證實(shí)高劑量Cu則會(huì)產(chǎn)生一定抑制作用。另外，由于土壤微生物群落代謝多樣性僅與土壤Cr含量呈顯著相關(guān)(P<0.05)，可知MOM與HBS處理土壤代謝群落多樣性存在較大差異可能是由于兩者Cr含量不同所致，但相關(guān)性不高，這可能是因?yàn)橥寥牢⑸锶郝浯x多樣性受土壤微生物生物量碳等其他重要因素影響，尚有待進(jìn)一步研究。

表6土壤微生物生物量與土壤理化性質(zhì)及重金屬因子的相關(guān)系數(shù)

Table6Correlativecoefficientsbetweensoilmicrobialbiomassandsoilpropertiesorheavymetalfactors

微生物群落代謝指標(biāo)w(有機(jī)質(zhì))w(全氮)w(堿解氮)w(全磷)w(有效磷)w(全鉀)w(速效鉀)pH值全鹽量CO2產(chǎn)生率0.548*0.3850.568*0.752**0.773**0.2050.534*0.794**0.789**Shannon指數(shù)-0.008-0.272-0.1340.1150.0440.3360.0870.0970.241微生物群落代謝指標(biāo)w(Hg)w(As)w(Pb)w(Cd)w(Cr)w(Cu)w(Zn)w(Ni)w(總重金屬)CO2產(chǎn)生率-0.368-0.448-0.1580.3600.2940.855**0.791**0.2220.812**Shannon指數(shù)-0.245-0.001-0.279-0.1370.569*0.2250.1490.2060.244

n=18。*表示相關(guān)顯著 (P<0.05)，* *表示相關(guān)極顯著(P<0.01)。

采用基于距離的線性模型(distance-based linear modelling，DistLM)研究土壤微生物群落代謝結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)及重金屬分布相關(guān)性(表7)。

表7土壤微生物群落代謝結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)及重金屬的DistLM分析

Table7Distance-basedlinearmodelling(DistLM)analysisofsoilmicrobialcommunitymetabolismstructurewithsoilpropertiesandheavymetals

影響因子SSP影響因子SS Pw(有機(jī)質(zhì))1 190.80.037w(Hg) 766.30.093w(全氮)888.00.069w(As)595.70.195w(堿解氮)997.20.052w(Pb)440.20.308w(全磷)1 993.80.001w(Cd)442.90.308w(有效磷)1 995.70.001w(Cr)664.40.145w(全鉀)251.10.630w(Cu)2 583.00.001w(速效鉀)951.40.039w(Zn)2 177.30.001pH值2 193.20.001w(Ni)486.90.261全鹽量2 100.80.001

SS為離均差平方和。

各土壤重金屬因子中，僅有Cu和Zn含量對土壤微生物群落代謝結(jié)構(gòu)變化產(chǎn)生極顯著影響(P<0.01)，其中土壤Cu含量是造成微生物群落代謝結(jié)構(gòu)差異最根本影響因子〔離均差平方和(sum of squared deviations from mean，SS)為2 583.0〕。各土壤理化指標(biāo)中，pH值、全鹽量、有機(jī)質(zhì)、有效磷和全磷含量等可極顯著解釋土壤微生物群落代謝結(jié)構(gòu)變化(P<0.01)，其中土壤pH值(SS為2 193.2)、全鹽量(SS為2 100.8)、有效磷含量(SS為1 995.7)、全磷含量(SS為1 993.8)和有機(jī)質(zhì)含量(SS為1 190.8)對微生物群落代謝結(jié)構(gòu)產(chǎn)生差異的貢獻(xiàn)較大。

通過基于距離的冗余分析(distance-based redundancy analysis，dbRDA)方法進(jìn)一步分析土壤理化性質(zhì)及重金屬因子對微生物群落代謝功能多樣性影響發(fā)現(xiàn)，不同施肥方式下土壤微生物群落功能多樣性呈現(xiàn)不同空間分布特征，各影響因子中最主要的為土壤Cu含量，其次是土壤pH值、全鹽量和全磷含量(圖3～4)，這與DistLM分析結(jié)果基本一致。

CK為對照處理，NPK為純化肥處理，HOM為純有機(jī)肥處理，MOM為中量有機(jī)肥+化肥處理，HBS為純沼液肥處理，MBS為中量沼液肥+化肥處理。圓圈內(nèi)處理相似性較高。圖3 不同施肥方式下土壤微生物代謝功能與重金屬含量的dbRDA分析排序Fig.3 dbRDA analysis of microbial metabolic function and heavy metals with different fertilization regimes

CK為對照處理，NPK為純化肥處理，HOM為純有機(jī)肥處理，MOM為中量有機(jī)肥+化肥處理，HBS為純沼液肥處理，MBS為中量沼液肥+化肥處理。TK、TN、TP、TOM、AN、AP和AK分別為全鉀、全氮、全磷、有機(jī)質(zhì)、堿解氮、有效磷和速效鉀，TS為全鹽量。圓圈內(nèi)處理相似性較高。圖4 不同施肥方式下土壤微生物代謝功能與土壤理化因素dbRDA分析排序Fig.4 dbRDA analysis of the microbial metabolic function and soil properties with different fertilization regimes

3 結(jié)論

連續(xù)5 a施用高量(22 500 kg·hm-2·a-1)商品有機(jī)肥、中量(11 250 kg·hm-2·a-1)商品有機(jī)肥或中量(450 000 kg·hm-2·a-1)沼液肥顯著提高土壤微生物代謝活性，且僅有施用高量(22 500 kg·hm-2·a-1)商品有機(jī)肥、中量(11 250 kg·hm-2·a-1)商品有機(jī)肥對土壤微生物群落代謝結(jié)構(gòu)具有明顯影響，而施用高量(450 000 kg·hm-2·a-1)沼液肥顯著降低土壤微生物代謝活性和群落多樣性。據(jù)相關(guān)性分析表明，土壤微生物群落代謝功能與土壤理化性質(zhì)及重金屬累積有關(guān)，土壤pH值、全磷和Cu含量與土壤微生物代謝活性及其結(jié)構(gòu)關(guān)系最密切，其中土壤Cu含量為主要影響因子。綜上，適量施用有機(jī)肥、沼液肥對土壤微生物群落代謝功能有積極作用，且有機(jī)肥較沼液肥效果更明顯；而長期高量施用沼液肥不利于土壤微生物代謝活性和群落多樣性的維持。可見，在當(dāng)前發(fā)展生態(tài)循環(huán)農(nóng)業(yè)，大力推廣有機(jī)肥、沼液肥時(shí)，必須在監(jiān)測重金屬等污染殘留的基礎(chǔ)上，關(guān)注安全投入用量，形成沼液肥和有機(jī)肥的安全使用技術(shù)。