高 峰，盧偉龍，王華林，吳媛媛，王 斌，李 敏

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 西安 712000)

瞬時(shí)受體電位通道(transient receptor potential canonical，TRP)是一類重要的陽離子通道。辣椒素受體(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)是TRP家族通道蛋白之一，為熱敏感蛋白，可被高于42℃的溫度、炎癥、疼痛、辣椒素等體內(nèi)多種因素激活[1-2]，主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及末梢神經(jīng)系統(tǒng)上。TRPV1目前在疼痛、炎癥、中醫(yī)寒熱病證、中藥寒熱藥性等方面有重要意義[3-4]。TRPV1蛋白后期的磷酸化對(duì)其功能的發(fā)揮至關(guān)重要，有研究表明，cAMP/PKA通路可促進(jìn)TRPV1的磷酸化，使其激活[5-6]。另有研究發(fā)現(xiàn)，TRPV1活化后，促進(jìn)cAMP含量升高[3]，兩者之間的調(diào)控作用尚不明確。課題組前期研究表明，體內(nèi)cAMP/PKA信號(hào)通路的磷酸化水平與TRPV1的蛋白表達(dá)有一定相關(guān)性[7]。因此，本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，分別應(yīng)用兩者的激動(dòng)劑和抑制劑干預(yù)，進(jìn)一步探討TRPV1與cAMP/PKA信號(hào)通路之間的調(diào)控作用。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新生大鼠購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(軍)2012-0007。

1.2試劑胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone；TRIzol(貨號(hào)15596-026)購(gòu)自無錫菩禾；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)#K1622)購(gòu)自Thermo公司；cAMP/PKA信號(hào)通路激動(dòng)劑8-Br-cAMP(貨號(hào)ab141449)、抑制劑H-89(貨號(hào)ab143787)、TRPV1激動(dòng)劑辣椒素capsaicin(貨號(hào)ab140100)、抑制劑i RTX(貨號(hào)ab146031)，均購(gòu)自Abcam公司。

1.3儀器Thermo Scientific 8000細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)賽默飛世爾公司)；XDS-1A光學(xué)顯微鏡(上海精密儀器儀表有限公司)；DMI3000B倒置拍照顯微鏡、TCS SP5 II共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；ABI-7500 Real-time檢測(cè)儀(ABI公司)；Mini protean 3 cell電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；ChemiScope一體式化學(xué)發(fā)光成像儀(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法

2.1大鼠背根神經(jīng)節(jié)(dorsalrootganglion，DRG)細(xì)胞的分離與鑒定參考文獻(xiàn)[8]，新生大鼠注射15%水合氯醛處死，放入低溫的DMEM不完全培養(yǎng)液，大鼠死后，快速分離脊髓，摘取DRG并剪碎，放入含膠原酶的DMEM/F12培養(yǎng)基中60～90 min。再置于含0.125%胰蛋白酶的磷酸緩沖鹽 (phosphate buffer saline，PBS)溶液中15 min。用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，獲取的細(xì)胞接種于神經(jīng)細(xì)胞完全培養(yǎng)基中，d 2換液繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞傳代24 h，4%多聚甲醛固定，加入神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)，室溫封閉15 min。加入對(duì)應(yīng)二抗，37℃孵育1 h，洗滌，Hoechst 33258染液，室溫避光孵育30 min。細(xì)胞于熒光顯微鏡下觀察，隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野中細(xì)胞總數(shù)和β-tubulin Ⅲ的染色陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算百分比，表示細(xì)胞純度。

2.2MTT法檢測(cè)8-Br-cAMP、H-89、capsaicin、iRTX對(duì)大鼠DRG細(xì)胞的影響大鼠DRG細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以5×107·L-1濃度接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。分為正常對(duì)照組、8-Br-cAMP組(200、100、50、25、12.5、6.25 μmol·L-1)、H-89組(160、80、40、20、10、5 μmol·L-1)、capsaicin組(80、40、20、10、5、2.5 μmol·L-1)、i RTX組(16、8、4、2、1、0.5 μmol·L-1)，分別加入含藥的無血清培養(yǎng)基，每孔加100 μL，設(shè)4個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h，每孔加MTT溶液 20 μL，孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150 μL DMSO，微量振蕩器振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，選擇570 nm波長(zhǎng)，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔光吸收值。

2.38-Br-cAMP、H-89、capsaicin、iRTX對(duì)大鼠DRG細(xì)胞TRPV1、p-PKA作用研究大鼠DRG細(xì)胞以5×107·L-1濃度，接種于12孔板，分正常對(duì)照組(control)、8-Br-cAMP 50 μmol·L-1組、H-89 20 μmol·L-1組、capsaicin 25 μmol·L-1組、i RTX 2 μmol·L-1組，每組設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，培養(yǎng)48 h 后收集細(xì)胞，檢測(cè)TRPV1、p-PKA基因、蛋白表達(dá)。

2.48-Br-cAMP、H-89、capsaicin、iRTX對(duì)大鼠DRG細(xì)胞TRPV1、p-PKAmRNA表達(dá)的影響定量PCR檢測(cè)TRPV1、p-PKA mRNA，所需的引物序列見Tab 1。①RNA的抽提；②逆轉(zhuǎn)錄cDNA：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的配制；將試劑盒從-80℃冰箱取出，復(fù)溶，將5×逆轉(zhuǎn)錄buffer、dNTPs、 oligo(d T) 10 000 r·min-1，數(shù)秒。將經(jīng)過稀釋后的RNA樣本進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。mRNA表達(dá)的數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件ABI Prism 7500 SDS Software分析。PCR擴(kuò)增后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自動(dòng)分析結(jié)果，根據(jù)陰性對(duì)照調(diào)整閾值和基線以確定各標(biāo)本的Ct值，并根據(jù)熔解曲線確定該Ct值是否有效。將結(jié)果導(dǎo)出，采用2-△△CT法分析目的基因在對(duì)照組和各濃度組之間的表達(dá)差異，計(jì)算公式如下：△Ct= Ct目的基因-Ct內(nèi)參，再求得對(duì)照組△Ct的平均值，記為△Ct對(duì)照平均，用各組的△Ct分別減去△Ct對(duì)照平均，求得△△Ct值，即△△Ct=△Ct樣本-△Ct對(duì)照平均，再計(jì)算各組2-△△CT值，即為各組中基因的相對(duì)表達(dá)量。

Tab 1 Required primer sequence

2.58-Br-cAMP、H-89、capsaicin、iRTX對(duì)大鼠DRG細(xì)胞TRPV1、p-PKA蛋白表達(dá)的影響收集細(xì)胞，每組分別加入500 μL的RIPA裂解液，并加入適量的PMSF，置冰上裂解2 h；4℃、12 000 r·min-1離心10 min；移上清于新的EP管中，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后貯存于-20℃冰箱。蛋白定量后，SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜。膜用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h?？贵w加入封閉液中稀釋到所需濃度，4℃孵育過夜。TBST洗滌3次，每次10 min。加入相應(yīng)二抗，與膜37℃孵育1 h。用TBST洗滌3次，每次10 min。顯色，一體式化學(xué)發(fā)光儀拍攝照片。蛋白表達(dá)水平用目的條帶積分吸光度值(integrated absorbance，IA) 與內(nèi)參 β-actin條帶的 IA 比值表示。

3 結(jié)果

3.1DRG神經(jīng)元形態(tài)學(xué)特征Fig 1相差顯微鏡觀察，可見DRG細(xì)胞神經(jīng)元胞體有一定透亮度和折光性，突起分支十分茂密，可見少量神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞碎片，少量非神經(jīng)元細(xì)胞核。DRG神經(jīng)元純度結(jié)果顯示，DRG神經(jīng)元β-tubulin Ⅲ陽性細(xì)胞比例達(dá)到81%，細(xì)胞分離培養(yǎng)效果良好。

3.28-Br-cAMP、H-89、capsaicin、iRTX對(duì)大鼠DRG細(xì)胞的影響由Tab 2可知，與正常對(duì)照組比較，8-Br-cAMP 200 μmol·L-1、H-89 160 μmol·L-1、capsaicin 200 μmol·L-1、i RTX 16、8 μmol·L-1使細(xì)胞增殖明顯降低(P<0.05，P<0.01)，故選擇8-Br-cAMP 50 μmol·L-1、H-89 20 μmol·L-1、capsaicin 25 μmol·L-1、i RTX 2 μmol·L-1對(duì)細(xì)胞沒有損害的濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。

3.38-Br-cAMP、H-89、capsaicin、iRTX對(duì)TRPV1、p-PKAmRNA表達(dá)的影響Tab 3結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，8-Br-cAMP、capsaicin可明顯促進(jìn)TRPV1 mRNA的表達(dá)(P<0.01)，i RTX可明顯降低TRPV1 mRNA表達(dá)(P<0.01)，H-89對(duì)TRPV1 mRNA表達(dá)的影響不明顯；8-Br-cAMP可促進(jìn)p-PKA mRNA的表達(dá)，H-89可降低p-PKA mRNA表達(dá)(P<0.05)；capsaicin、i RTX對(duì)p-PKA mRNA表達(dá)的影響不明顯。

Fig 1 Dorsal root ganglion cells of rats(scale bar=50 μm)

Tab 2 Cell proliferation rate in each

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Tab 3 Expression of TRPV1 and p-PKA mRNA

GroupDose/μmol·L-1TRPV1p-PKAControl-1.00±0.021.00±0.038-Br-cAMP501.17±0.03**1.21±0.01**H-89200.99±0.030.81±0.01*Capsaicin251.17±0.02**1.02±0.03i RTX20.80±0.02**1.01±0.02

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3.48-Br-cAMP、H-89、capsaicin、iRTX對(duì)p-PKA、TRPV1蛋白表達(dá)的影響與正常對(duì)照組比較，8-Br-cAMP、capsaicin可明顯促進(jìn)TRPV1蛋白的表達(dá)(P<0.01)，i RTX可明顯降低TRPV1蛋白表達(dá)(P<0.05)，H-89對(duì)TRPV1蛋白表達(dá)的影響不明顯；8-Br-cAMP可促進(jìn)p-PKA蛋白的表達(dá)，H-89可降低p-PKA蛋白表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；capsaicin、i RTX對(duì)p-PKA蛋白表達(dá)的影響不明顯(Fig 2)。

4 討論

TRP是一類重要的陽離子通道，在TRP通道中，感受溫度變化及參與體溫調(diào)節(jié)的有多個(gè)家族和通道蛋白，其中熱敏感通道蛋白TRPV1分布廣泛，是具有多功能的細(xì)胞感受器。TRPV1可被體內(nèi)外多種物理化學(xué)因素激活，如傷害性熱刺激、低pH值(酸性環(huán)境)、炎癥、疼痛、辣椒素等。在疼痛的感知與調(diào)節(jié)、體溫感知與調(diào)節(jié)、炎癥的發(fā)生及中醫(yī)寒熱病證、中藥寒熱藥性等方面研究中，TRPV1起著重要作用[7]。因此，探討TRPV1體內(nèi)的調(diào)控機(jī)制，有非常重要的意義。在TRPV1的活化中，磷酸化起著重要作用。Schnizler等[9]證實(shí)，PKA磷酸化作用增敏TRPV1通道由A激酶錨定蛋白AKAP150 所介導(dǎo)。Bhave等[10]在轉(zhuǎn)染TRPV1的cos7細(xì)胞中，給予辣椒素連續(xù)刺激后，產(chǎn)生急性脫敏現(xiàn)象；用8-Br-cAMP溫育cos7細(xì)胞后，再給予辣椒素刺激，無急性脫敏現(xiàn)象；將PKA抑制劑與8-Br-cAMP一起溫育cos7細(xì)胞，辣椒素刺激后，脫敏現(xiàn)象重新出現(xiàn)。還有研究表明，TRPV1的增強(qiáng)可促進(jìn)cAMP的含量?？梢奵AMP/PKA信號(hào)通路引發(fā)的細(xì)胞磷酸化與TRPV1活化之間關(guān)系密切，TRPV1生理病理功能與cAMP/PKA通路的調(diào)控相關(guān)聯(lián)。課題組前期研究表明，辛熱藥提高虛寒機(jī)體TRPV1活性同時(shí)，可上調(diào)機(jī)體cAMP/PKA信號(hào)通路。本實(shí)驗(yàn)從體外進(jìn)一步探討體內(nèi)cAMP/PKA信號(hào)通路與TRPV1的調(diào)控關(guān)系，對(duì)TRPV1相關(guān)病癥的研究有重要作用。

Fig 2 Expression of p-PKA, TRPV1 in different groups

1: Control;2: 8-Br-cAMP(50 μmol·L-1);3: H-89(20 μmol·L-1);4: Capsaicin(25 μmol·L-1);5: i RTX(2 μmol·L-1).*P<0.05，**P<0.01vscontrol.

實(shí)驗(yàn)中采取膠原酶、胰酶消化分離DRG細(xì)胞的方法較為成熟，分離出的細(xì)胞形態(tài)較為完整，活性較強(qiáng)，純度較高。應(yīng)用cAMP/PKA通路激動(dòng)劑8-Br-cAMP、抑制劑H-89和TRPV1的激動(dòng)劑辣椒素、抑制劑i RTX進(jìn)行干預(yù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，8-Br-cAMP 和H-89可明顯上調(diào)或降低p-PKA基因、蛋白表達(dá)；capsaicin、i RTX可明顯上調(diào)或降低TRPV1基因、蛋白表達(dá)；capsaicin、i RTX對(duì)p-PKA基因、蛋白的表達(dá)無明顯影響，8-Br-cAMP可促進(jìn)TRPV1的基因、蛋白的表達(dá)，H-89則對(duì)TRPV1的基因、蛋白的表達(dá)無明顯影響?？梢?，TRPV1的激活或抑制對(duì)cAMP/PKA信號(hào)通路無明顯影響，而cAMP/PKA信號(hào)通路激活可活化TRPV1，cAMP/PKA信號(hào)通路抑制時(shí)，對(duì)TRPV1基因、蛋白表達(dá)影響不大，可能除了cAMP-PKA信號(hào)通路可調(diào)控TRPV1的表達(dá)外，還存在其他信號(hào)通路對(duì)TRPV1也有一定調(diào)控作用，具體的調(diào)控機(jī)制還需在后期進(jìn)一步深入研究。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心完成，感謝參與完成實(shí)驗(yàn)的課題組成員。)