汪小英，余艷榮，王美玲，彭維杰,，羅 丹

(南昌大學(xué)1. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系、2. 藥學(xué)院藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、3. 江西省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，江西 南昌 330006)

血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)異常增殖和表型轉(zhuǎn)化是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后狹窄等血管重構(gòu)病變發(fā)生、發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)。 縫隙連接蛋白43(connexin43，Cx43)是構(gòu)成VSMCs間縫隙連接的主要連接蛋白，參與調(diào)節(jié)VSMCs功能。近年來(lái)的大量研究發(fā)現(xiàn)，Cx43表達(dá)異常增高是多種病理因素誘導(dǎo)VSMCs增殖的重要機(jī)制，而靶向抑制Cx43成為藥物和基因手段改善血管重構(gòu)的研究熱點(diǎn)[1]。血管壁局部腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)亢進(jìn)導(dǎo)致的血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)增高，是誘導(dǎo)VSMCs增殖和表型轉(zhuǎn)換的重要病理因素。研究表明，AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs功能改變與Cx43表達(dá)增高有關(guān)。在大鼠胸主動(dòng)脈和人隱靜脈平滑肌的研究均發(fā)現(xiàn)，Ang II可劑量依賴(lài)性地上調(diào)Cx43表達(dá)。Alonso等[2]的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，AngⅡ可激活NF-κB途徑，導(dǎo)致p65-NF-κB核轉(zhuǎn)位，后者可與編碼Cx43的Gja1基因啟動(dòng)子結(jié)合，從而促進(jìn)Cx43表達(dá)。

吳茱萸作為傳統(tǒng)中藥，在臨床上被應(yīng)用了數(shù)千年，其主要有效成分吳茱萸次堿(rutaecarpine,Rut)具有廣泛的心血管保護(hù)效應(yīng)，如抗炎、抗血栓、舒血管等[3]。Rut作為一種天然產(chǎn)物提取物，可能通過(guò)多靶點(diǎn)發(fā)揮藥理學(xué)作用，其中辣椒素受體(transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1)被認(rèn)為是Rut發(fā)揮心血管保護(hù)作用的重要靶點(diǎn)[3]。TRPV1廣泛分布于血管組織中，血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞均有表達(dá)。我們實(shí)驗(yàn)室前期在血管內(nèi)皮的研究中發(fā)現(xiàn)，Rut可抑制溶血性磷脂酰膽堿[4]和Ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮Connexin表達(dá)模式的改變，從而改善內(nèi)皮功能[5]，其機(jī)制與激活TRPV1有關(guān)。因此，本研究以大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞為研究對(duì)象，探討Rut對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的Cx43表達(dá)改變及VSMCs功能變化的影響，并探討其機(jī)制是否涉及TRPV1/NF-κB途徑。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑Rut(純度>99%，上海君拓生物技術(shù)有限公司)；AngⅡ、TRPV1的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑辣椒卓平(Capsazepine，CAPZ)，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；CCK-8(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；EdU檢測(cè)試劑盒(廣州銳博生物技術(shù)有限公司)；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和調(diào)寧蛋白(Calponin)抗體(Proteintech公司)；Cx43和NF-κB p65抗體(CST公司)；免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒(SP-9001，北京中杉金橋有限公司)；抗Cyclin D1抗體、細(xì)胞周期試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒、胞質(zhì)/核蛋白提取試劑盒(北京普利萊生物技術(shù)有限公司)。

1.2儀器酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、電泳儀和自動(dòng)曝光儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dickinson公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組取大鼠胸主動(dòng)脈，組織貼塊法原代培養(yǎng)VSMCs，采用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，傳代后取3～8代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按實(shí)驗(yàn)?zāi)康募尤氩煌奶幚硪蛩兀孩僬?duì)照組(Control)；②AngⅡ損傷組：加入AngⅡ(終濃度為1 μmol·L-1)孵育VSMCs 24 h；③～⑤Rut(低、中、高)保護(hù)組：加入Rut(終濃度為0.3、1.0、3.0 μmol·L-1)孵育VSMCs后，再加入AngⅡ繼續(xù)孵育24 h；⑥CAPZ+Rut(H)組：用TRPV1受體阻斷劑CAPZ(10 μmol·L-1)預(yù)處理細(xì)胞10 min后，再加入Rut(3.0 μmol·L-1)孵育10 min，后加入AngⅡ繼續(xù)孵育24 h。

1.4Westernblot檢測(cè)Cx43、CyclinD1、α-SMA、Calponin蛋白表達(dá)水平裂解細(xì)胞并提取總蛋白樣品，經(jīng)BCA法蛋白定量，變性。制膠，上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜。5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h，與一抗(1 ∶1 000稀釋)結(jié)合，4℃孵育過(guò)夜。洗膜，與二抗結(jié)合(1 ∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h。洗膜，加入ECL化學(xué)發(fā)光液于自動(dòng)曝光儀下檢測(cè)。使用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，以β-actin或GAPDH的密度值為內(nèi)參，計(jì)算相對(duì)密度，作為蛋白表達(dá)水平進(jìn)行比較分析。

1.5Westernblot結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)NF-κBp65核轉(zhuǎn)位收集細(xì)胞至1.5 mL EP管，4℃、12 000 r·min-1離心5 min,棄去PBS，于沉淀中加入100 μL CEB-A，劇烈振蕩后冰浴15 min；于裂解物體積中加入5 μL CEB-B，冰浴1 min。4℃、12 000 r·min-1離心5 min，沉淀即是核粗提物，上清為粗制的胞質(zhì)蛋白組分。將上清轉(zhuǎn)入另一預(yù)冷的離心管，再次離心沉淀，取上清即是胞質(zhì)蛋白組分。取上述核粗提物沉淀，加入100 μL CEB-A和5 μL CEB-B振蕩，冰浴1 min，離心棄上清，重復(fù)此步驟。在離心沉淀中加入100 μL 預(yù)冷的NEB，冰浴30 min，離心，取上清即為核蛋白組分。其余步驟同“1.4”。

免疫細(xì)胞化學(xué)：4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS清洗3次；3%過(guò)氧化氫37℃孵育10 min，PBS清洗3次；正常羊血清工作液37℃孵育10 min；NF-κB p65(1 ∶100稀釋)一抗4℃孵育過(guò)夜。加入二抗于37℃孵育15 min；鏈霉素卵白素工作液37℃孵育15 min；加入新配制的DAB溶液2 min后，于顯微鏡下觀察細(xì)胞著色情況。

1.6CCK-8和EdU試劑盒檢測(cè)VSMCs增殖

1.6.1CCK-8法 將VSMCs消化后制成單細(xì)胞懸液，以每孔5×105個(gè)細(xì)胞均勻接種于96孔板，每孔200 μL，每組6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(只加等體積培養(yǎng)基，不加細(xì)胞)。24 h后向各孔加入20 μL的CCK-8試劑，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光繼續(xù)孵育1～4 h，終止培養(yǎng)，在450 nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度。細(xì)胞活力(OD)=樣品吸光度值-調(diào)零孔。

1.6.2EdU標(biāo)記法 用無(wú)血清培養(yǎng)基按1 000 ∶1稀釋EdU試劑A；各組加入100 μL 孵育2 h；4%多聚甲醛室溫固定30 min；于各孔加入2×10-3mg·L-1甘氨酸溶液，5 min后用PBS洗3次；加入1×Apollo染色液100 μL，避光孵育30 min，棄去，加入100 μL通透液，室溫10 min；加入甲醇100 μL，清洗2次；制備適量1×Hoechst 33342反應(yīng)液，各孔加入100 μL，避光孵育30 min，PBS洗3次；染色結(jié)束后，立刻于顯微鏡下拍照記錄。

1.7流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定VSMCs細(xì)胞周期變化胰酶消化并收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到離心管，2 000×g離心5 min沉淀細(xì)胞。PBS洗滌2次，離心除上清。用70%乙醇于4℃固定過(guò)夜。再次離心沉淀細(xì)胞，PBS清洗去上清，最后向各管加入0.5 mL PI，輕輕吹打細(xì)胞沉淀，使之與染料充分接觸，37℃水浴避光孵育30 min，轉(zhuǎn)移至流式管，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1AngⅡ?qū)ζ交〖?xì)胞Cx43蛋白表達(dá)的影響Fig 1的Western blot結(jié)果顯示，AngⅡ孵育VSMCs可時(shí)間依賴(lài)性上調(diào)Cx43的表達(dá)，8 h時(shí)Cx43水平明顯上調(diào)，24 h作用最為明顯(P<0.01)。

2.2Rut對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的Cx43表達(dá)的影響如Fig 2所示，不同濃度的Rut均能明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)的Cx43表達(dá)上調(diào)，預(yù)先給予TRPV1阻斷劑CAPZ可取消這一效應(yīng)(P<0.01)。

2.3Rut抑制NF-κBp65轉(zhuǎn)位Fig 3A的Western blot結(jié)果顯示，Ang Ⅱ孵育細(xì)胞4 h可明顯增加細(xì)胞核中NF-κB p65的水平，胞質(zhì)中NF-κB p65水平則下降。不同濃度的Rut能劑量依賴(lài)性抑制AngⅡ誘導(dǎo)的p65入核，CAPZ可取消Rut這一效應(yīng)(P<0.05)。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，AngⅡ孵育細(xì)胞4 h可明顯促進(jìn)NF-κB p65蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，Rut(3.0 μmol·L-1)能在一定程度上抑制其入核，該效應(yīng)可被CAPZ所阻斷(Fig 3B)。

2.4Rut對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs增殖的影響Fig 4的EdU結(jié)果顯示，AngⅡ可增加VSMCs的EdU陽(yáng)性細(xì)胞百分率(P<0.01)，不同濃度的Rut可抑制增殖期陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，該效應(yīng)可被TRPV1受體阻斷劑CAPZ(10 μmol·L-1)阻斷(P<0.01)。CCK-8結(jié)果顯示，AngⅡ孵育細(xì)胞24 h可明顯促進(jìn)VSMCs增殖(P<0.05)，不同濃度的Rut可劑量依賴(lài)性減少AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，預(yù)先給予CAPZ可取消Rut的這一效應(yīng)(P<0.01)。

Fig 1 Effect of AngⅡ treatment on expressionof Cx43 in

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Fig 2 Effect of Rut on expressionof Cx43 induced by AngⅡ

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsAngⅡ group;▲▲P<0.01vsAngⅡ+Rut (3 μmol·L-1) group

Fig 3 Possible mechanism of Rut in down-regulation of

Fig 4 Effects of Rut on proliferation of VSMCs induced by AngⅡ

2.5Rut對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs周期分布的影響Fig 5的流式細(xì)胞周期結(jié)果顯示，AngⅡ可增加增殖期細(xì)胞(S期+G2/M期)的比例(P<0.05)。Rut(3.0 μmol·L-1)可明顯降低AngⅡ誘導(dǎo)的增殖期VSMCs比例(P<0.01)，該效應(yīng)可被CAPZ所取消(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，AngⅡ可上調(diào)細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1的表達(dá)，Rut可明顯抑制Ang II誘導(dǎo)的Cyclin D1表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，CAPZ可取消Rut的這一作用(P<0.01)。

2.6Rut對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs表型的影響如Fig 6所示，加入AngⅡ孵育48 h后，VSMCs細(xì)胞表面收縮型標(biāo)志蛋白α-SMA和Calponin表達(dá)均降低，Rut可部分恢復(fù)二者的表達(dá)水平，該效應(yīng)可被CAPZ阻斷(P<0.01)。

3 討論

Rut是傳統(tǒng)降壓藥吳茱萸的主要有效成分，Qin等[6]在研究Rut的降壓機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，Rut可改善高血壓導(dǎo)致的阻力血管的重構(gòu)。最近有研究報(bào)道，Rut還可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs增殖[7]，但具體機(jī)制未明。Cx43是構(gòu)成VSMCs間縫隙連接的主要蛋白，參與調(diào)控VSMCs功能，被認(rèn)為是改善血管重構(gòu)的重要靶點(diǎn)[8-9]。國(guó)外學(xué)者在培養(yǎng)的人隱靜脈平滑肌細(xì)胞和大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞均發(fā)現(xiàn)，AngⅡ誘導(dǎo)的VMSCs功能改變與上調(diào)Cx43表達(dá)有關(guān)[2,10]。我們?cè)诖笫笮刂鲃?dòng)脈VSMCs也證實(shí)，AngⅡ(1.0 μmol·L-1)可明顯上調(diào)Cx43的表達(dá)，而不同濃度的Rut均可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的Cx43表達(dá)增加。這提示Rut可能通過(guò)抑制Cx43的表達(dá)，改善VSMCs功能。Rut是TRPV1的部分激動(dòng)劑[11]，其主要心血管效應(yīng)均與激活TRPV1有關(guān)[12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Rut抑制Cx43表達(dá)的作用可被TRPV1競(jìng)爭(zhēng)性阻斷劑CAPZ所阻斷，提示TRPV1介導(dǎo)了Rut調(diào)節(jié)Cx43的作用。

Fig 5 Effect of Rut on VSMCs cell cycle induced by AngⅡ

Fig 6 Effect of Rut on VSMCs phenotype transformation by AngⅡ using Western

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsAngⅡ group;▲▲P<0.01vsAngⅡ+Rut (3 μmol·L-1) group

Alonso等[2]在培養(yǎng)的大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs中發(fā)現(xiàn)，AngⅡ上調(diào)Cx43的表達(dá)與促進(jìn)NF-κB亞基 p65核轉(zhuǎn)位有關(guān)，主要證據(jù)如下：大鼠編碼Cx43的Gja1基因啟動(dòng)子的-312～-301 bp有NF-κB的結(jié)合區(qū)，熒光報(bào)告基因結(jié)果顯示，AngⅡ可促進(jìn)NF-κB和該啟動(dòng)區(qū)的結(jié)合，而ChIP結(jié)果證實(shí)，AngⅡ激活啟動(dòng)子的效應(yīng)可被NF-κB抗體所取消。本實(shí)驗(yàn)采用Western blot及免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果均顯示，AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs在4 h即可促進(jìn)p65由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，而不同濃度的Rut可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的p65核轉(zhuǎn)位，預(yù)先給予CAPZ可取消Rut的作用。以上結(jié)果提示，Rut激活TRPV1下調(diào)Cx43表達(dá)的作用，可能與抑制AngⅡ誘導(dǎo)的NF-κB的激活有關(guān)。

在人大隱靜脈VSMCs的研究中發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Cx43可明顯促進(jìn)人VSMCs的增殖能力，而敲除Cx43則抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs增殖和細(xì)胞周期蛋白Cyclin E的表達(dá)上調(diào)[10]，提示AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs增殖與Cx43表達(dá)上調(diào)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，Rut可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs增殖，表現(xiàn)為逆轉(zhuǎn)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs內(nèi)的DNA合成增加及細(xì)胞活力升高。細(xì)胞周期結(jié)果顯示，AngⅡ可導(dǎo)致增殖期(S+G2/M期)細(xì)胞的比例增加，伴隨細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1水平增加，后者作為細(xì)胞周期正性調(diào)節(jié)因子可促進(jìn)細(xì)胞增殖。而Rut可明顯抑制Cyclin D1的表達(dá)上調(diào)和AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換，預(yù)先給予CAPZ可阻斷Rut的這些抗增殖效應(yīng)。由此我們推論，Rut可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs增殖，其機(jī)制至少部分與激活TRPV1，抑制有促增殖效應(yīng)的Cx43的表達(dá)有關(guān)。

VSMCs表型轉(zhuǎn)換是導(dǎo)致VSMCs功能異常的重要原因，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加入AngⅡ孵育后，VSMCs的收縮型標(biāo)志蛋白α-SMA和Calponin表達(dá)降低，說(shuō)明AngⅡ促進(jìn)VSMCs由收縮表型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣杀硇?。而Rut可部分恢復(fù)兩種標(biāo)志蛋白的表達(dá)，其效應(yīng)被CAPZ所阻斷。Rut這種抑制VSMCs表型轉(zhuǎn)換的作用也可能與Cx43有關(guān)，已有研究表明Cx43參與調(diào)節(jié)VSMCs的表型轉(zhuǎn)換[13]。在豬冠狀動(dòng)脈平滑肌中也發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Cx43可下調(diào)收縮型標(biāo)志蛋白α-SMA和 Calponin的表達(dá)，敲除Cx43則產(chǎn)生相反的作用[14]。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，Rut通過(guò)下調(diào)Cx43的表達(dá)，抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs增殖和表型轉(zhuǎn)化，其機(jī)制涉及TRPV1/NF-κB信號(hào)途徑。