王 淼，母潤(rùn)紅，李明成，李洪杰

(1.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院免疫教研室，吉林 吉林 132013; 2.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，吉林 吉林 132013)

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康。中國(guó)是胃癌高發(fā)國(guó)家，胃癌發(fā)病率和死亡率均高于全球平均水平，在全球居第4位。目前，胃癌可通過放化療等多種方式治療，但缺少對(duì)早期胃癌的篩查及診斷，大多數(shù)胃癌患者確診時(shí)己進(jìn)入進(jìn)展期，導(dǎo)致術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)或喪失了手術(shù)的最佳機(jī)會(huì)[1-2]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，從分子水平研究胃癌的發(fā)病原因，尋找胃癌進(jìn)展的基因?qū)?duì)胃癌的綜合治療有重要的意義[3-4]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展并非單基因和單因素過程，而是多基因和多因素的復(fù)雜過程，抑制其基因的表達(dá)，可控制腫瘤的發(fā)生[4]。RNA干擾(RNA interference,RNAi)是進(jìn)行靶基因表達(dá)抑制的核酸操作技術(shù)，現(xiàn)已成為研究腫瘤基因治療的有效工具[5-6]。survivin基因是凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis protein,IAP)家族新成員之一，由于其僅在腫瘤和胚胎細(xì)胞中特異表達(dá)，因而成為腫瘤基因治療的特異性靶點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外研究[7-8]表明：靶向沉默survivin基因的表達(dá)能抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)是普遍存在于實(shí)體瘤組織中,抑制其表達(dá)對(duì)抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展也可能有重要的臨床指導(dǎo)意義[9]。本研究采用RNAi技術(shù)沉默胃癌BGC-823細(xì)胞中survivin和HIF-1α雙基因的表達(dá)，觀察其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為胃癌早期診斷和治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和主要儀器 人胃癌BGC-823細(xì)胞(北華大學(xué)藥學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室保存)，DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，真核轉(zhuǎn)染試劑HifectinⅡ(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)，TRIzol試劑和AnnexinⅤ/PI雙染試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒(日本TaKaRa公司)，RIPA裂解液、兔抗人survivin和HIF-1α多克隆抗體及BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(武漢博士德公司)，臺(tái)盼藍(lán)(美國(guó)Sigma公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 小干擾RNA(siRNA)設(shè)計(jì)策略 根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)選擇survivin和HIF-1α的mRNA序列(NM_001168.2；NM_001012270.1；NM_001012271.1；XR_243654.2)基因信息，確定符合siRNA特征的靶序列，分別命名為siRNA-survivin和siRNA-HIF-1α，同時(shí)合成錯(cuò)義RNA(scramble RNA,SCR)作為陰性對(duì)照(表1)。此外，設(shè)計(jì)熒光標(biāo)記的無靶向siRNA(FAM-siRNA)用于測(cè)定siRNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。siRNA合成和構(gòu)建由上海吉瑪生物技術(shù)制藥公司完成。

1.3 人胃癌BGC-823細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人胃癌BGC-823細(xì)胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每48 h傳代1次，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BGC-823細(xì)胞，以每孔1.2×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，24 h后待細(xì)胞鋪滿每孔約80%，將培養(yǎng)液換為無血清培養(yǎng)基，細(xì)胞轉(zhuǎn)染整個(gè)步驟完全按照HifectinⅡ真核轉(zhuǎn)染試劑提供的說明書操作。轉(zhuǎn)染siRNA-survivin、siRNA-HIF-1α和 SCR的各組細(xì)胞分別命名為sis組、siH組和非靶向特異性組(SCR組)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組(無血清培養(yǎng)基)。轉(zhuǎn)染效率=熒光陽性細(xì)胞數(shù)/篩選細(xì)胞總數(shù)×100%。

表1 人survivin和HIF-1α基因特異性干擾序列

1.4 RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中survivin和HIF-1α mRNA表達(dá)水平 用TRIzol試劑提取sis組、siH組、SCR組和空白對(duì)照組BGC-823細(xì)胞的總RNA,經(jīng)紫外分光儀測(cè)定RNA的濃度及純度。凝膠電泳觀察RNA的完整性。應(yīng)用RT-PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模版，進(jìn)行RCR擴(kuò)增，檢測(cè)各組細(xì)胞中survivin和HIF-1α mRNA表達(dá)情況。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外成像儀中應(yīng)用Tanon2500 Gel Imaging system 軟件獲取圖像，以GADPH作為內(nèi)參，根據(jù)2-△△Ct法計(jì)算mRNA表達(dá)水平，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BGC-823細(xì)胞接種于96孔板中，接種細(xì)胞數(shù)每孔3×103個(gè)，體積100 μL，每組設(shè)6復(fù)孔，終濃度均為100 nmol·L-1。實(shí)驗(yàn)分為單干擾組(survivin-siRNA,sis組)、聯(lián)合干擾組(survivin-siRNA+HIF1α-siRNA,sis+siH組)、非靶向特異性組(SCR組)和空白對(duì)照組(無血清培養(yǎng)基)。轉(zhuǎn)染24、48和72 h，終止培養(yǎng)，各孔加入5 g·L-1MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h，棄去上清，各孔加入DMSO 100 μL，繼續(xù)振搖10 min，充分溶解結(jié)晶，于酶標(biāo)儀上490 nm處測(cè)定吸光度[A(490)] 值，以A(490)值代表細(xì)胞增殖活性。

1.6 Western blotting 法檢測(cè)細(xì)胞中survivin和HIF-1α蛋白表達(dá)水平 分組方法同1.5 。轉(zhuǎn)染后48 h，用試劑盒提取各組BGC-823細(xì)胞總蛋白。采用BCA法檢測(cè)總蛋白濃度。采用SDS-PAGE電泳分離。一抗為兔抗人survivin單克隆抗體(稀釋濃度1∶200)、HIF-1α單克隆抗體(稀釋濃度1∶300)和GADPH單克隆抗體(稀釋濃度1∶500)，4℃過夜。再次用PBST洗膜，加入已稀釋的山羊抗兔二抗-HPR(稀釋濃度1∶2 000)，置于室溫?fù)u床孵育1 h。ECL顯影。以各實(shí)驗(yàn)組灰度值與對(duì)照組灰度值之比表示蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 分組方法同1.5 。轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞用胰酶消化，PBS洗滌2次，制備成細(xì)胞懸液，加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC 和5 μL PI染液，避光室溫孵育10 min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果應(yīng)用WinMDI 2.9分析軟件進(jìn)行分析。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/(凋亡細(xì)胞數(shù)+正常細(xì)胞數(shù))×100%。

2 結(jié) 果

2.1 siRNA轉(zhuǎn)染胃癌BGC-823細(xì)胞效率的鑒定 siRNA成功轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞6 h后，PBS洗滌3～4次，在激光共聚焦顯微鏡下觀察各組細(xì)胞siRNA轉(zhuǎn)染效率。siRNA主要集中在細(xì)胞質(zhì)中，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞有清晰的細(xì)胞輪廓，與背景形成明顯的反差 (圖1，見插頁三)。熒光標(biāo)記siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率大于70%,可以完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 各組細(xì)胞中survivin 和HIF-1α mRNA表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染48 h后各組細(xì)胞均有亮度相似的GADPH基因條帶表達(dá)，各組survivin/GADPH比值代表survivin基因的mRNA表達(dá)水平(圖2)，HIF-1α/GADPH比值代表HIF-1α基因的mRNA表達(dá)水平(圖3)。與SCR組和空白對(duì)照組比較，sis組細(xì)胞中survivin mRNA表達(dá)水平和siH組細(xì)胞中HIF-1α mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)；SCR組與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2和3。

Lane 1: Blank control group; Lane 2:SCR group; Lane 3:Sis group.

圖2 轉(zhuǎn)染48 h后各組細(xì)胞中survivin mRNA表達(dá)電泳圖

Fig.2 Electropheregram of expressions of survivin mRNA in cells in various groups 48 h after transfection

Lane 1:Blank control group; Lane 2: SCR group; Lane 3:SiH group.

圖3 轉(zhuǎn)染48 h后各組細(xì)胞中HIF-1α mRNA表達(dá)電泳圖

Fig.3 Expression levels of HIF-1α mRNA in cells in various groups 48 h after transfection

表2 轉(zhuǎn)染48 h后各組細(xì)胞中survivin mRNA表達(dá)水平

GroupSurvivin mRNABlank control 0.927 0±0.021 7SCR 0.947 5±0.032 6Sis 0.457 3±0.021 4?△

*P<0.01 compared with blank control group；△P<0.01 compared with SCR group.

2.3 各組細(xì)胞增殖活性 與空白對(duì)照組比較,SCR組細(xì)胞增殖活性無明顯變化(P>0.05),sis組和sis+siH組細(xì)胞增殖活性明顯降低(P<0.05)，生長(zhǎng)曲線低平，且sis+siH組細(xì)胞增殖活性明顯低于sis組(P<0.05)。見圖4和表4。

2.4 各組細(xì)胞中surviving和HIF-1α蛋白表達(dá)水平 與空白對(duì)照組比較， sis組surviving蛋白表達(dá)水平、sis+siH組surviving和HIF-1α蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；SCR組與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖5和表5。

表3 轉(zhuǎn)染48 h后各組細(xì)胞中HIF-1α mRNA表達(dá)水平

GroupHIF-1α mRNABlank control 0.826 3±0.032 6SCR 0.832 4±0.012 7SiH 0.351 6±0.011 6?△

*P<0.05 compared with blank control group；△P<0.05 compared with SCR group.

圖4 轉(zhuǎn)染不同時(shí)間各組BGC-823細(xì)胞增殖活性

Fig.4 Proliferation activities of BGC-823 cells in various groups at different time after transfection

表4 各組BGC-823細(xì)胞增殖活性

Group A(490)(t/h) 2448 72Blank control0.867 6±0.041 41.241 0±0.084 1 1.928 0±0.077 9SCR0.934 1±0.052 51.278 0±0.069 0 2.004 0±0.095 0Sis0.418 2±0.044 3?0.579 0±0.034 0? 1.349 0±0.156 5?Sis+siH0.313 7±0.032 2?△0.467 5±0.055 1?△ 0.941 0±0.096 1?△

*P<0.05 compared with blank control group；△P<0.05 compared with sis group.

2.5 各組細(xì)胞凋亡率 轉(zhuǎn)染48 h后，與空白對(duì)照組比較，sis組和sis+siH組細(xì)胞凋亡率明顯升高(F=109,P<0.01)；空白對(duì)照組與SCR組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；sis+siH組細(xì)胞凋亡率略高于sis組，但組間比較差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖6和表6。

Lane 1: Blank control group; Lane 2:SCR group; Lane 3:Sis group; Lane 4:Sis+siH group.

圖5 各組細(xì)胞中survivin和HIF-1α蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.5 Electrophoregram of expressions of survivin and HIF-1α proteins in cells in various groups

表5 各組細(xì)胞中survivin和HIF-1α蛋白表達(dá)水平

GroupSurvivin proteinHIF-1α proteinBlank control0.67±0.030.73±0.01SCR0.68±0.030.73±0.01Sis 0.20±0.02? 0.70±0.02Sis+siH 0.58±0.02? 0.31±0.02?

*P<0.05 compared with blank control group.

3 討 論

A: Blank control group; B:SCR group; C:Sis group; D:Sis+siH group.

表6 各組細(xì)胞凋亡率

GroupApoptotic rateBlank control11.54±2.67SCR13.00±2.32Sis16.70±2.03?Sis+siH16.74±3.03?

*P<0.01 compared with blank control group.

研究[10-11]顯示：特異性抑制腫瘤細(xì)胞中靶向基因的表達(dá)，可有效抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲，發(fā)揮腫瘤基因治療作用。研究[12-14]表明：survivin和HIF-1α在胃癌細(xì)胞內(nèi)均有一定程度的表達(dá)，阻斷 其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者成功地利用了RNAi技術(shù)沉默survivin，可明顯抑制胃癌SGC-7901和BGC-823細(xì)胞生長(zhǎng)增殖[15-17]，本研究結(jié)果也證實(shí)了該結(jié)論。本研究結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染48 h后，sis組和sis+siH組胃癌BGC-823細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯抑制，生長(zhǎng)曲線低平，且sis+siH組的生長(zhǎng)抑制作用明顯強(qiáng)于sis組。本研究結(jié)果表明：抑制胃癌BGC-823細(xì)胞中surviving和HIF-1α基因表達(dá)水平可降低胃癌細(xì)胞增殖能力。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)一方面由細(xì)胞周期的細(xì)胞數(shù)決定，另一方面也取決于細(xì)胞增殖與細(xì)胞死亡的比例[18-21]。因此，可通過檢測(cè)surviving和HIF-1α對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡的影響，來評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖與凋亡之間的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示：sis組和sis+siH組胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡率明顯高于空白對(duì)照組和SCR組,空白對(duì)照組與SCR組間比較無明顯差異；sis+siH組細(xì)胞凋亡率略高于sis組，但組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有研究[18]通過靶向誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡抑制腫瘤血管新生，結(jié)果顯示：促凋亡蛋白Bm和Bax表達(dá)及細(xì)胞色素C(CytC)的釋放明顯增加，而HIF-1α是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(VEGF-C)的上游基因。本研究將surviving和HIF-1α基因作為靶向沉默基因，主要是利用該基因由線粒體釋放入胞漿，通過內(nèi)源性凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本研究利用Hifectin Ⅱ真核轉(zhuǎn)染試劑，將預(yù)先合成的HIF-1α和survivin 特異性siRNA直接轉(zhuǎn)染胃癌BGC-823細(xì)胞，避免了構(gòu)建表達(dá)載體的過程。此外，為便于觀察，將熒光標(biāo)記的無靶向siRNA(FAM-siRNA)一同轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)，用于測(cè)定siRNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。本研究結(jié)果顯示：HifectinⅡ作為一種陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，與應(yīng)用最為廣泛的Lipo2000比較，具有轉(zhuǎn)化效率高和操作便捷的優(yōu)點(diǎn)。

綜上所述，RNAi沉默survivin和HIF-1α雙靶點(diǎn)基因，可抑制胃癌BGC-823細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。本研究結(jié)果初步提示：沉默survivin和HIF-1α基因有望成為胃癌基因治療的新方法，但其具體的分子作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。