張帆航，李 澤，譚曉風(fēng)，李文瑩，楊超臣，李艷麗

（中南林業(yè)科技大學(xué)a. 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b. 經(jīng)濟(jì)林培育與利用湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410004）

三年桐Vernicia fordii為大戟科Euphorbiaceae油桐屬落葉喬木，是我國特有的經(jīng)濟(jì)樹種，與油茶、核桃和烏桕并稱我國四大木本油料樹種，已有千年的栽培歷史[1-5]。千年桐Vernicia montana 為大戟科Euphorbiaceae油桐屬落葉喬木，又名皺桐，木油樹，抗病性較強(qiáng)[5]。桐油是制造優(yōu)質(zhì)油漆和油墨的基本原料，油桐果實(shí)還可開發(fā)利用為優(yōu)良的生物質(zhì)柴油及其他工業(yè)原料。油桐可能成為緩解我國能源短缺問題最有發(fā)展前途的生物質(zhì)能源樹種之一[6-9]。油桐是喜溫暖濕潤怕嚴(yán)寒氣候的植物，而近幾年頻發(fā)的極端高溫和極端低溫氣候十分不利于油桐的生長，因此，提高油桐的耐高溫性和耐低溫性已經(jīng)成為生產(chǎn)中一個(gè)急需解決的問題。

油菜素內(nèi)酯（BR）又稱蕓薹素內(nèi)酯，是一種新型的植物內(nèi)源激素，研究發(fā)現(xiàn)，BR可以激發(fā)植物內(nèi)在潛能，促進(jìn)植物生長，提高其耐冷性及抗病抗鹽能力。研究結(jié)果表明，BR能增強(qiáng)植物的抗熱性、抗寒性等對(duì)環(huán)境的抗逆性[10-11]；同時(shí)，BR還能促進(jìn)豌豆細(xì)胞的伸長和分裂，促進(jìn)導(dǎo)管的分化[12]。曹云英等[13]研究表明，高溫脅迫下BR能增加水稻幼苗保護(hù)酶（SOD、POD）活性，減少M(fèi)DA的生成。袁凌云等[14]研究表明，通過BR預(yù)處理，減輕了低溫對(duì)番茄幼苗葉片的傷害，減緩MDA的上升趨勢(shì)，提高可溶性糖的含量。張海麗等[15]研究表明，低濃度的BR促進(jìn)了水稻細(xì)胞的伸長。Chen等[16]研究表明，水分脅迫下，BR能減少高羊茅MDA生成，增加SOD、POD、葉綠素含量，提高高羊茅葉片的相對(duì)含水率（RWC），促進(jìn)高羊茅的光合作用。因此，探究BR是否能提高油桐耐高溫性和耐低溫性，促進(jìn)細(xì)胞的伸長和分裂，提高抗氧化酶活性，增強(qiáng)葉片光合作用具有重要意義。

目前，關(guān)于BR對(duì)木本植物生長狀況、生理影響等方面的機(jī)理研究較少，主要在水稻、甜瓜、黃瓜、番茄、羊草、葡萄、棉花等植物方面[17-22]，而BR對(duì)油桐生長狀況及生理、光合生理方面的研究還未見報(bào)道。本文以油桐屬三年桐和千年桐2個(gè)油桐物種為實(shí)驗(yàn)材料，采用混合基質(zhì)培養(yǎng)方法，探討B(tài)R處理下不同溫度脅迫對(duì)2個(gè)油桐物種幼苗的生長狀況、生理指標(biāo)和葉片細(xì)胞的影響情況，旨在揭示BR對(duì)油桐葉片的作用，以期為油桐栽培中緩解因受溫度脅迫而造成危害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料為三年桐和千年桐，2個(gè)物種均采自湖南湘西永順縣青坪鎮(zhèn)國家種質(zhì)資源保存庫，2016年10月采集4年生三年桐和千年桐成熟種子，陰干，于12月下旬沙藏備用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

試驗(yàn)于2017年4—8月在中南林業(yè)科技大學(xué)校內(nèi)進(jìn)行，選取沙藏長勢(shì)一致的油桐種子播種于裝有基質(zhì)的規(guī)格為20 cm×20 cm×18 cm的塑料盆中（基質(zhì)含有蛭石、珍珠巖、泥炭和黃土，體積比為1∶1∶1∶1），并于8月5日開始，于每日7:00氣孔剛打開時(shí)，在油桐葉片表面均勻噴灑濃度為0.1 mg/L的BR，當(dāng)葉尖有水滴滴下時(shí)即可，對(duì)照組在葉片表面均勻噴灑相同劑量的水，每日1次，持續(xù)1周，最后將油桐幼苗轉(zhuǎn)移進(jìn)人工氣候室中，分別設(shè)置3種溫度：8、28、38 ℃，進(jìn)行溫度脅迫。每個(gè)處理各9盆，共計(jì)108株苗。試驗(yàn)期間，各處理每2 d澆300 mL水，持續(xù)至試驗(yàn)結(jié)束。油桐幼苗在溫度脅迫3 d后開始測(cè)定生理指標(biāo)（POD、SOD、MDA、可溶性糖、可溶性蛋白、相對(duì)含水率、葉綠素含量）、生長指標(biāo)等各項(xiàng)指標(biāo)，并做冰凍切片對(duì)葉片細(xì)胞進(jìn)行研究。

1.3 生長指標(biāo)測(cè)定

株高、地徑分別用卷尺和游標(biāo)卡尺測(cè)量；地上部分干質(zhì)量及根系干質(zhì)量用精確度為0.01的電子天平稱量。

1.4 生理指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 相對(duì)含水率（RWC）的測(cè)定

稱取新鮮葉片5片，每個(gè)處理兩份，一份放于培養(yǎng)皿中，注滿蒸餾水，蓋上蓋子，在5 ℃黑暗處放置24 h后稱量，得飽和鮮質(zhì)量，另一份放入烘箱105 ℃殺青15 min后，65 ℃下烘48 h至恒質(zhì)量，稱量得干質(zhì)量（DW），均用精確度為0.000 1的電子天平稱量，計(jì)算相對(duì)含水率，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4.2 葉綠素含量測(cè)定

采用丙酮乙醇混合液法，進(jìn)行葉綠素提取，使用1∶1的丙酮乙醇混合液，在663和645 nm處測(cè)OD值，計(jì)算葉綠素總量。

臨走前，爸媽極力堅(jiān)持要送我到樓下。我上了出租車，眼淚止不住地流下來，最終在司機(jī)師傅的勸慰下嚎啕大哭起來。

1.4.3 SPAD值測(cè)定

采用SPAD儀測(cè)定。

1.4.4 可溶性蛋白含量測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法，在595 nm處測(cè)量OD值，計(jì)算可溶性蛋白含量。以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.5 可溶性糖含量測(cè)定

采用苯酚法，在485 nm處測(cè)定OD值，計(jì)算可溶性糖含量。以100 μg/L蔗糖標(biāo)液作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.6 丙二醛（MDA）含量測(cè)定

采用硫代巴比妥酸（TBA）法，在450、532、600 nm處測(cè)定OD值，計(jì)算出MDA濃度。

采用單一提取法，準(zhǔn)確稱取樣品加入預(yù)冷的提取液3 mL，冰浴研磨后，轉(zhuǎn)入離心管中，再用2 mL提取液洗研缽，合并提取液并于4 ℃下離心20 min，將上清液分裝，分別進(jìn)行酶活性測(cè)定。

1.5 冰凍切片

采用冰凍切片機(jī)（Leica CM1950，德國）對(duì)新鮮葉片進(jìn)行切片研究，并用顯微鏡（OLYMPUS DP73，日本）進(jìn)行觀察并測(cè)量葉片厚度和柵欄組織厚度。

1.6 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2013和Origin 9.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理作圖，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析（One-way ANOVA和雙因素分析）檢驗(yàn)其差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度下油菜素內(nèi)酯對(duì)油桐幼苗生長的影響

無論是三年桐還是千年桐，在8 ℃和38 ℃處理下，都會(huì)受到脅迫，導(dǎo)致2個(gè)油桐物種株高和地徑生長較28 ℃的變緩，地上干質(zhì)量和根系干質(zhì)量都低于28 ℃下的，見表1。由表1可知，三年桐在8 ℃下地上干質(zhì)量和根系干質(zhì)量分別比28 ℃降低了25.95%、81.12%，38 ℃下比28 ℃降低了12.66%、18.81%；千年桐在8 ℃下比28 ℃降低了12.23%、62.26%，38 ℃下比28 ℃降低了8.21%、27.09%。同時(shí)，BR處理過的油桐相較于CK，株高、地徑、地上干質(zhì)量和根系干質(zhì)量都有提高，其中，三年桐株高在3種溫度下BR處理比CK處理分別提高了32.72%、2.72%、4.05%，地徑分別提高了24.32%、30.30%、27.17%，差異顯著（P＜0.05），地上干質(zhì)量分別提高了4.59%、50.21%、36.86%，根系干質(zhì)量分別提高了12.59%、44.79%、46.33%，差異顯著（P＜0.05）；千年桐株高在三種溫度下BR處理比CK處理分別提高了2.71%、13.61%、3.24%，地徑分別提高23.00%、5.73%、18.78%，地上干質(zhì)量分別提高了18.44%、37.60%、24.79%，差異顯著（P＜0.05），根系干質(zhì)量分別提高了14.47%、51.55%、59.61%，差異顯著（P＜0.05）。

表1 不同溫度下油菜素內(nèi)酯對(duì)油桐幼苗生長的影響Table 1 Effects of BR application on the growth of Tung tree seedlings at different temperatures

2.2 不同溫度下油菜素內(nèi)酯對(duì)油桐幼苗葉片相對(duì)含水率（RWC）的影響

2個(gè)油桐物種BR處理的葉片相對(duì)含水率高于CK處理的油桐葉片，見圖1。由圖1可知，在同一溫度下，BR處理的三年桐葉片RWC比CK處理的葉片分別高31.31%、10.50%、13.48%；BR處理的千年桐葉片RWC比CK處理的葉片分別高了27.24%、16.73%、12.10%；說明BR能夠提升2個(gè)油桐物種葉片的相對(duì)含水率。同時(shí)，由于2個(gè)油桐物種在8 ℃和38 ℃下受到脅迫，其RWC較于28 ℃下的2個(gè)物種略有降低，其中，三年桐RWC降低幅度大于千年桐，8 ℃下油桐幼苗RWC降低幅度大于38 ℃下的油桐幼苗，說明就RWC而言，低溫較于高溫對(duì)于油桐葉片傷害更大。

2.3 不同溫度下油菜素內(nèi)酯對(duì)油桐幼苗葉片葉綠素含量及SPAD值的影響

圖1 不同溫度下油菜素內(nèi)酯對(duì)油桐幼苗葉片RWC的影響Fig. 1 Effects of BR application on leaf relative water content of Tung tree seedling leaves at different temperatures

無論是三年桐還是千年桐，在3種不同的溫度下，BR處理的幼苗葉綠素總量及SPAD值均大于CK處理的油桐幼苗，見圖2。由圖2可知，同一溫度下，三年桐BR處理的葉片葉綠素含量比CK處理高38.89%、6.14%、13.00%，SPAD值比CK處理高26.94%、6.01%、12.77%；千年桐BR處理的葉片葉綠素含量比CK處理高50.03%、2.52%、6.68%，SPAD值比CK處理高33.02%、17.00%、8.13%，說明BR對(duì)于油桐幼苗葉片的葉綠素積累具有促進(jìn)作用。2個(gè)油桐物種在28 ℃下，BR處理的幼苗葉片葉綠素總量及SPAD值較于CK處理增加較少，而在8 ℃和38℃下，BR處理的幼苗葉片葉綠素總量及SPAD值較于CK處理增加較多，而且，8 ℃和38 ℃下的2個(gè)油桐物種的葉綠素總量和SPAD值均低于28 ℃的2個(gè)物種，說明2兩個(gè)油桐物種在8 ℃和38 ℃下受到脅迫。

圖2 不同溫度下油菜素內(nèi)酯對(duì)油桐幼苗葉片葉綠素含量及SPAD值的影響Fig. 2 Effects of BR application on chlorophyll content and SPAD value of Tung tree seedling leaves at different temperatures

2.4 不同溫度下油菜素內(nèi)酯對(duì)油桐幼苗丙二醛含量（MDA）的影響

相對(duì)于28 ℃下的2個(gè)油桐物種，8 ℃和38 ℃下的油桐幼苗MDA含量顯著提升；而通過BR處理，三種溫度下2個(gè)油桐物種幼苗相比于CK處理均有下降，8 ℃和38 ℃ 2種溫度下降幅度明顯，見圖3。由圖3可知，三年桐下降幅度分別為52.02%、1.67%、20.51%，千年桐下降幅度分別為59.85%、1.40%、30.66%。

圖3 不同溫度下油菜素內(nèi)酯對(duì)油桐幼苗葉片MDA的影響Fig. 3 Effects of BR application on malondialdehyde content of Tung tree seedling leaves at different temperatures

2.5 不同溫度下油菜素內(nèi)酯對(duì)油桐幼苗可溶性糖、可溶性蛋白的影響

與8 ℃和38 ℃的2個(gè)油桐物種幼苗相比，28 ℃下的油桐幼苗葉片可溶性糖、可溶性蛋白含量較低，見圖4。由圖4可知， 8 ℃下的幼苗葉片可溶性糖、可溶性蛋白含量最高，38 ℃下的次之，28 ℃下的最低。對(duì)于3種溫度下的2個(gè)油桐物種，BR處理過的幼苗葉片可溶性糖、可溶性蛋白含量高于CK處理，其中，三年桐可溶性糖提高幅度分別為45.83%、14.79%、14.45%，差異顯著（P＜0.05），可溶性蛋白提高幅度分別為3.57%、19.62%、8.16%；千年桐可溶性糖提高幅度分別為67.62%、35.33%、37.09%，差異顯著（P＜0.05），可溶性蛋白提高幅度分別為20.88%、16.31%、12.25%。

2.6 不同溫度下油菜素內(nèi)酯對(duì)油桐幼苗葉片POD、SOD的影響

圖4 不同溫度下油菜素內(nèi)酯對(duì)油桐幼苗葉片可溶性糖、可溶性蛋白的影響Fig. 4 Effects of BR application on soluble sugar and soluble protein content of Tung tree seedling leaves at different temperatures

對(duì)于三年桐和千年桐2個(gè)油桐物種，28 ℃處理下的油桐幼苗POD、SOD活性均顯著低于8 ℃和38 ℃處理下的油桐幼苗，見圖5。由圖5可知，對(duì)于同一溫度處理下的2個(gè)油桐物種的幼苗，BR處理的幼苗葉片內(nèi)POD、SOD活性高于CK處理的油桐幼苗，其中，BR處理的三年桐幼苗葉片比CK處理的葉片SOD活性分別提高了12.60%、13.59%、4.78%，差異顯著（P＜0.05），POD活性分別提高了82.24%、128.58%、89.92%，差異顯著（P＜0.05）；BR處理的千年桐幼苗葉片比CK處理的葉片SOD活性分別提高了6.83%、15.78%、4.04%，POD活性分別提高了260.61%、194.04%、101.88%，差異顯著（P＜0.05）。

圖5 不同溫度下油菜素內(nèi)酯對(duì)油桐幼苗葉片POD、SOD的影響Fig.5 Effects of BR application on superoxide dismutase and peroxidase activities of Tung tree seedling leaves at different temperatures

2.7 不同溫度下油菜素內(nèi)酯對(duì)油桐幼苗葉片細(xì)胞的影響

對(duì)于三年桐和千年桐2個(gè)物種來說，相對(duì)于28 ℃，2個(gè)物種在8 ℃和38 ℃條件下，無論柵欄組織厚度還是葉片總厚度，都有大幅度降低，說明2個(gè)物種在8 ℃和38 ℃均受到脅迫，見表2。由表2可知，同一溫度條件下，2個(gè)物種BR處理在柵欄組織厚度和葉片總厚度上均大于CK處理，三年桐在8、28、38 ℃條件下，柵欄組織厚度BR比CK分別大19.70%、16.16%、46.13%，葉片總厚度BR比CK分別大9.21%、13.30%、26.91%；千年桐在8、28、38 ℃條件下，柵欄組織厚度BR比CK分別大93.85%、35.05%、33.01%，葉片總厚度BR比CK分別大56.94%、55.89%、13.21%。說明BR能增加2個(gè)物種的葉片的柵欄組織厚度和葉片厚度。

表2 不同溫度下油菜素內(nèi)酯對(duì)油桐幼苗葉片細(xì)胞影響Table 2 Effects of BR application on cells of Tung tree seedling leaves at different temperatures

3 結(jié)論與討論

高溫或者低溫環(huán)境對(duì)油桐幼苗生長有很大的不利影響，而葉片噴施BR對(duì)油桐幼苗的生長有利，它能夠在溫度脅迫條件下提高油桐幼苗的生長量，這與束紅梅等[22]在棉花葉片的研究結(jié)果相類似。研究表明，BR可以保護(hù)生物膜系統(tǒng)穩(wěn)定，緩解溫度逆境所帶來的危害[23]，在8 ℃和38 ℃溫度下，由于幼苗生長受到抑制，三年桐千年桐2個(gè)物種無論是地徑還是株高，根上干質(zhì)量還是根系干質(zhì)量，CK處理比BR處理都低，這也說明了BR能緩解高溫或低溫對(duì)于油桐幼苗所帶來的生長上的危害；其次，對(duì)于相同溫度條件和相同處理下，三年桐生長量均低于千年桐生長量，這也說明了在溫度逆境下，千年桐生長得更好，生長量增加得也更快。研究表明，2個(gè)油桐物種幼苗葉片在CK處理和BR處理下葉綠素含量和SPAD值均隨著溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，而相同溫度下，BR處理的幼苗葉片葉綠素含量和SPAD值均高于CK處理，這說明在8 ℃和38 ℃下，2個(gè)物種受到脅迫，導(dǎo)致葉綠素含量下降，而BR能緩解這種情況，能夠在相同溫度逆境下，提高葉綠素含量；其次，三年桐在相同溫度相同處理下，葉綠素含量均高于千年桐，說明三年桐葉片葉綠素含量較高。

雖然葉綠素含量能在一定程度上反映植物葉片的光合作用和能力，但是，由于其他因素的影響，葉綠素含量并不能十分準(zhǔn)確地反映植物葉片的凈光合速率，不能很好地從光合生理角度解釋BR對(duì)于2個(gè)物種的油桐幼苗有機(jī)物積累及提高其耐熱性和耐冷性的作用，而Chen[16]，張永平[17,26]，張睿佳等[15]都有從光合生理的角度分析BR對(duì)葉片的作用。由此可見，對(duì)外源噴施BR的油桐幼苗進(jìn)行光合生理方面的研究是十分必要的。

在正常生長條件下，植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡，而逆境會(huì)打破這種平衡，增加活性氧的產(chǎn)生，使膜系統(tǒng)損傷，細(xì)胞因此受到氧化脅迫，而植物體自身產(chǎn)生的抗氧化酶，如POD、SOD可清除活性氧，所以，POD和SOD含量的高低可以反映植物抗逆性程度[24-25]。張永平等[26]認(rèn)為，BR能提高甜瓜的耐熱性，李杰等[27]認(rèn)為，BR能提高辣椒的耐寒性，竇巧惠等[28]認(rèn)為，BR能提高番茄的耐銅能力，本次研究表明，2個(gè)物種在8 ℃和38 ℃均受到脅迫的時(shí)候，與CK處理相比，BR處理POD和SOD含量均有提升，MDA含量均有降低，說明BR有利于提高POD和SOD酶活性，清除自由基，降低膜脂過氧化產(chǎn)物MDA的生成，從而保護(hù)了膜結(jié)構(gòu)和功能，提高了油桐幼苗的耐熱性和耐寒性。研究表明，可溶性糖參與滲透調(diào)節(jié)，并在植物蛋白質(zhì)穩(wěn)定方面起到重要作用[29-30]，可溶性蛋白對(duì)維持細(xì)胞的膨壓、抵御或減輕高溫傷害具有一定的保護(hù)作用[17,30]，本次研究中，同一溫度下，2個(gè)物種可溶性蛋白、可溶性糖含量和葉片相對(duì)含水率BR處理均高于CK處理，說明BR可以促進(jìn)調(diào)節(jié)細(xì)胞間的滲透，促進(jìn)維持細(xì)胞的膨壓，減輕了高溫和低溫所帶來的傷害，這與Chen等的研究相同[16]。

本次研究表明，相比于28 ℃，8 ℃和38 ℃條件下2個(gè)物種葉片厚度和柵欄組織厚度大幅度降低，而BR處理高于CK處理，說明BR緩解了高溫和低溫脅迫下葉片厚度和柵欄組織厚度的降低；同時(shí)，在28 ℃條件下，三年桐葉片厚度和柵欄組織厚度2種處理均大于千年桐，但是，在8 ℃和38 ℃條件下，三年桐葉片厚度和柵欄組織厚度兩種處理均小于千年桐，說明高溫和低溫逆境對(duì)三年桐葉片厚度和柵欄組織厚度的降低更為明顯。

由此可知，用油菜素內(nèi)酯（BR）處理過的油桐幼苗生長加快，抗逆性顯著提高，葉片及葉片柵欄組織加厚，過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、可溶性糖、可溶性蛋白、相對(duì)含水率（RWC）均有提升，丙二醛（MDA）含量下降，短時(shí)間內(nèi)提高了葉綠素含量，所以，BR處理下的2個(gè)物種的油桐幼苗，耐熱性和耐寒性均有提升，BR促進(jìn)了油桐幼苗的生長，緩解了因溫度脅迫而帶來的危害。溫度脅迫下，2個(gè)油桐物種生長量增加均有明顯減緩，伴隨著株高地徑增加減緩的同時(shí)，葉片厚度及柵欄組織厚度開始降低。同時(shí)，三年桐生長量低于千年桐生長量，三年桐葉片厚度和柵欄組織厚度小于千年桐葉片厚度和柵欄組織厚度，千年桐在低溫和高溫兩個(gè)逆境下有機(jī)物的增加和生長量的提高優(yōu)于三年桐。