彭 沖，李曉東，隋正紅，商二磊，劉昊昕

(中國海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003)

龍須菜(Gracilariopsislemaneiformis)隸屬于江蘺科(Gracilariaceae)[1-3]，是中國的一種重要的經(jīng)濟海藻，生產(chǎn)瓊膠的重要原料[4]。龍須菜具有紅藻門中典型的三世代型生活史，由四分孢子體世代、果孢子體世代和配子體世代組成[5]。龍須菜的生活史可以在實驗室條件下完成，可以作為一種理想的遺傳學(xué)研究材料[6]。王津果等將龍須菜的發(fā)育過程分成了4個階段[7]，龍須菜具體發(fā)育階段的確認(rèn)與劃分，為其育性表現(xiàn)的研究奠定了基礎(chǔ)。

熱激蛋白(hot shock protein，hsp)是一類廣泛分布于各類生物細(xì)胞內(nèi)且高度保守的蛋白分子，在高溫、干旱、過氧化、重金屬等逆境下均能大量表達(dá)[8]，主要通過參與蛋白合成、折疊、細(xì)胞定位及蛋白降解等多種生物功能來維持植物內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[9]，在植物抵御逆境及適應(yīng)環(huán)境過程發(fā)揮重要作用[10]，行使分子伴侶、應(yīng)激防御和穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)等功能，不僅受環(huán)境脅迫的誘導(dǎo)也參與細(xì)胞各項正常生理活動[11]。

在高等植物中，谷氨酰胺(glutamine，gln)合成酶是氮素代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一，它可以聯(lián)合谷氨酸合成酶催化谷氨酸轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺[12]。有研究發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺合成酶與生物育性相關(guān)。谷氨酰胺合成酶在盤基網(wǎng)柄菌孢子母細(xì)胞中的活性比在柄細(xì)胞中的活性高約4倍，為谷氨酰胺合成酶調(diào)節(jié)盤基網(wǎng)柄菌發(fā)育提供了證據(jù)[13]。谷氨酰胺合成酶在水稻花粉成熟過程中起到重要作用，抑制谷氨酰胺合成酶活性，會使水稻圓錐花序中的氨積累，而導(dǎo)致水稻不育[13]。

研究發(fā)現(xiàn)，魯龍1號與龍須菜野生型之間的孢子放散數(shù)量并未出現(xiàn)顯著差異，而981釋放的孢子數(shù)量卻是最少，比野生型孢子放散量少一到2個數(shù)量級，呈現(xiàn)顯著差異[7]。本研究針對龍須菜981品系與魯龍1號表現(xiàn)出不同的育性性狀的這一現(xiàn)象，結(jié)合已完成981品系和魯龍1號品系的不同發(fā)育階段龍須菜的轉(zhuǎn)錄組測序工作，挑選出在不同發(fā)育階段差異表達(dá)顯著的2個基因(hsp和gln)，通過測序分析和熒光定量PCR技術(shù)，從單個基因水平，對龍須菜981低育原因進行探究，為研究紅藻發(fā)育調(diào)控提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

龍須菜981品系和魯龍1號品系的四分孢子體樣品采集于青島膠州灣養(yǎng)殖海區(qū)(36°08′N, 120°17′E)。將表面的附生生物、泥沙等肉眼可見的污染物沖洗干凈后，挑選生長狀態(tài)良好的藻株置于潔凈滅菌的廣口錐形瓶中，加入含有Pro培養(yǎng)基[14]的滅菌海水，置于22 ℃、鹽度30、光照50 μmol·m-2·s-1、光暗周期12/12h L/D的條件下馴養(yǎng)1周，中間更換1次海水加入新的培養(yǎng)基。

實驗室馴養(yǎng)1周后，將981和魯龍1號樣品置于最佳孢子放散條件下培養(yǎng)，即25 ℃、15 μmol·m-2·s-1、鹽度35、光暗周期8/16～14/10 h L/D[15]，培養(yǎng)過程中利用光學(xué)顯微鏡觀察藻體表面，根據(jù)王津果等[7]劃分的龍須菜不同發(fā)育階段的特征判斷樣品藻體的發(fā)育階段，用消毒的刀片分別對處于各發(fā)育階段的龍須菜樣品進行取樣，每份樣品約0.2 g，液氮中速凍后置于-80 ℃保存。

1.2 基因組DNA的提取及cDNA的制備

利用植物基因組DNA提取試劑盒(天根)對龍須菜樣品基因組DNA進行提取。利用植物RNA提取試劑盒(OMEGA)對龍須菜樣品進行總RNA的提取，利用核酸蛋白質(zhì)檢測儀測定提取RNA的濃度以及OD260/OD280，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。利用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)，參照說明書將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于-20 ℃條件下保存。

1.3 hsp和gln全基因序列與上游序列的獲得及基因片段克隆

根據(jù)龍須菜全基因組Survey數(shù)據(jù)[16]和不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中hsp和gln基因序列[17]，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計2基因的全長擴增引物(-all)、上游序列擴增引物(-up)和熒光定量引物(-q)，選擇gapdh基因[18]和18s基因[19]作為熒光定量PCR的雙內(nèi)參基因(見表1)。

表1 本研究所用引物序列Table 1 The sequence of primers used in this study

PCR反應(yīng)體系中含有10×PCR Buffer 2 μL，25 mmol/L的MgCl21.2 μL，2.5 mmol/L的dNTP 1.5 μL，10 μmol/L的正反向引物各1 μL，1 U的TaqDNA聚合酶和20 ng全基因組DNA模板。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，1個循環(huán)；94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s(在基因片段克隆的擴增反應(yīng)中設(shè)為45 s)，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測?；蛉L序列與上游序列的PCR產(chǎn)物送上海生工生物公司，用擴增引物進行雙向測序。

已發(fā)現(xiàn)在龍須菜中18s和gapdh這2個基因表達(dá)恒定，因此在本研究用作參照基因，雙參照基因相比單內(nèi)參能夠減小內(nèi)參基因方面引起的誤差，使結(jié)果更加準(zhǔn)確。以雙內(nèi)參基因作為標(biāo)準(zhǔn)，對龍須菜2個品系不同階段的樣品進行歸一化處理，就可以在不同的樣品間對目標(biāo)基因表達(dá)量進行比較分析。hsp、gln、18s、gapdh熒光定量引物擴增產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根)進行目的條帶回收。參照PMD18-T說明書，將回收的目的條帶與PMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α菌株中，PCR檢測顯示陽性克隆的單菌落接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h，然后利用質(zhì)粒提取試劑盒(天根)提取菌液質(zhì)粒，提取的質(zhì)粒于-20 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 序列的生物信息學(xué)分析

用BioEdit v7.0軟件[20]檢查雙向測序的結(jié)果，刪除序列兩端背景雜亂堿基，并利用MEGA6.0軟件拼接得到基因全長序列和上游序列，然后分別與龍須菜轉(zhuǎn)錄組和全基因組Survey數(shù)據(jù)中基因所在的Scaffold片段進行比對，確定目的基因的存在及其序列信息。利用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)推測開放閱讀框，結(jié)合MEGA6.0軟件進行氨基酸序列翻譯。蛋白質(zhì)的分子量與等電點使用ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)進行預(yù)測；利用SignalP2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/)分析蛋白信號肽；跨膜區(qū)通過TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)進行分析；利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)進行蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域分析；將獲得的hsp和gln氨基酸序列在NCBI上通過BLASTP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=&LINK_LOC=blasttab)進行同源性比對分析，下載其他物種的hsp和gln氨基酸序列分別與獲得的氨基酸序列一起使用Clustal X軟件進行多重比對分析，通過MEGA 6.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進化樹，用Bootstrap法對進化樹進行評估，Bootstrap設(shè)置為1 000次重復(fù)。利用PantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對獲得的hsp和gln基因的上游序列的啟動子元件進行分析。

1.5 hsp和gln基因的表達(dá)分析

以1.3中提取的質(zhì)粒為模板，按1∶10梯度用滅菌雙蒸水進行稀釋，共設(shè)8個梯度，每個梯度設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)，分別以hsp-q、gln-q、18s-q、gapdh-q(見表1)為引物，進行熒光定量PCR反應(yīng)，PCR體系中包含有10 μL的LightCycler 480 SYBR Green I Master，10 μmol/L的正反向引物各1 μL，1 μL模板，其余的用滅菌的ddH2O補足20 μL體系。在Roche LightCycler480實時定量PCR儀上進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序為：95 ℃ 5 min，1個循環(huán)；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃10 s，45個循環(huán)；95 ℃5 s，65 ℃1 min，1個循環(huán)；40 ℃ 10 s，1個循環(huán)。根據(jù)得到的Ct值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測引物是否符合熒光定量PCR要求(擴增效率在95%～105%)。

以1.2中來自龍須菜981品系和魯龍1號品系不同發(fā)育階段的cDNA為模板，每份樣品設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)，依照上述步驟分別進行hsp、gln、18s、gapdh的熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)果采用2-ΔΔCT法進行計算[21]，并利用SPSS軟件采用t檢驗對數(shù)據(jù)結(jié)果進行差異顯著性系統(tǒng)學(xué)分析(P)，并利用Origin6.0軟件對數(shù)據(jù)進行作圖分析。

2 結(jié)果

2.1 hsp、gln基因的獲得及氨基酸序列分析

hsp基因序列全長501 bp，編碼166個氨基酸，分子量為19.05 kD，理論等電點為6.38。帶負(fù)電的氨基酸殘基(Asp + Glu)為23個，帶正電的氨基酸殘基(Arg + Lys)為21個，不存在信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。蛋白功能結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)在49～164 aa處為HSP20結(jié)構(gòu)域(見圖1)。龍須菜Hsp的氨基酸序列與其它物種序列的比對如圖1所示，龍須菜的Hsp序列與其它物種存在較大差異，與星球蟲科Tetrasphaeraaustraliensis相似性為35%，與其他物種，如杉藻科的角叉菜(Chondruscrispus)，酵母科的Schizosaccharomycesoctosporus、綠菌門的Chlorobibacterium、放線菌目的Phycicoccussp.、Friedmanniellaflava、Rhodococcussp.與Knoelliaaerolata，相似性范圍為28%～34%。Hsp序列中共有8個保守位點，均處于HSP20結(jié)構(gòu)域內(nèi)。

(實線表示蛋白功能預(yù)測HSP20區(qū)；陰影部分為保守區(qū)域；相同氨基酸用“＊”表示，相似氨基酸用“．”與“：”表示。Solid line indicated predicted protein function region of HSP 20;shade part was conserved region;identical amino acids indicated by “*”，and similar ones by “·” and “：”.Phycicoccussp.(WP_056923286.1)；紅球菌Rhodococcussp(WP_032374627.1)；Tetrasphaeraaustraliensis(CCH71736.1)；紅球菌Rhodococcussp.(WP_057473142.1)；Friedmanniellaflava(SEQ28565.1)；紅球菌Rhodococcussp.(WP_027494920.1)；角叉菜Chondruscrispus_1(XP_005713022.1)；Phycicoccussp.(WP_057378702.1)；Tetrasphaeraaustraliensis(WP_048701086.1)；角叉菜Chondruscrispus_2(XP_005710585.1)；Gracialriopsislemaneiformis(本研究)；紅球菌Rhodococcussp.(WP_008711816.1)；Knoelliaaerolata(WP_035937060.1)；角叉菜Chondruscrispus_3(XP_005710590.1)；八孢裂殖酵母Schizosaccharomycesoctosporus(XP_013018981.1)；Chlorobibacterium(KXB97182.1))
圖1 Hsp序列比對結(jié)果
Fig.1 The amino acid sequences alignment ofhspgene

gln基因序列全長1 209 bp，編碼402個氨基酸，分子量為43.91 kD，理論等電點為5.57。帶負(fù)電的氨基酸殘基(Asp + Glu)為49個，帶正電的氨基酸殘基(Arg + Lys)為43個，不存在信號肽，存在2個跨膜區(qū)，分別為TMⅠ(位置1～18 aa，長度18 aa，方向為膜外向膜內(nèi))和TMⅡ(位置47～69 aa，長度23，方向為膜外向膜內(nèi))(見圖2)。蛋白功能結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)在29～41 aa的位置，存在一段長13 aa的低復(fù)雜性區(qū)域(Low complexity region，LCR)(見圖2)。在65～144 aa位置為谷氨酰胺合成酶N結(jié)構(gòu)域(見圖2)。龍須菜與角叉菜(Chondruscrispus)的Gln序列相似性最高，為73%，與其他物種如紅藻綱的Dixoniellagrisea、真紅藻綱的細(xì)毛石花菜(Gelidiumcrinale)、溫泉紅藻綱的Galdieriasulphuraria、雙子葉植物綱的胡蘿卜(Daucuscarotasubsp.sativus)、酸棗(Ziziphusjujube)、可可(Theobromacacao)、芝麻(Sesamumindicum)、苧麻(Boehmerianivea)、麻瘋樹(Jatrophacurcas)、楊樹(Populustrichocarpa)和PopulussimoniixPopulusnigra，相似性范圍為56%～69%。將龍須菜的Gln序列與其它物種的序列進行比對，發(fā)現(xiàn)共有124個保守位點，有30個保守位點在谷氨酰胺合成酶N結(jié)構(gòu)域中。龍須菜Gln的谷氨酰胺合成酶N結(jié)構(gòu)域與紅藻門的Dixoniellagrisea、Galdieriasulphuraria、細(xì)毛石花菜(Gelidiumcrinale)序列結(jié)構(gòu)相近。龍須菜Gln中的TMⅠ、TMⅡ跨膜區(qū)、LCR為龍須菜中特有的序列區(qū)域。

(實線框表示預(yù)測跨膜區(qū)，雙箭頭實線表示預(yù)測LCR區(qū)，實線表示預(yù)測的谷氨酰胺合成酶N結(jié)構(gòu)域；陰影部分為保守區(qū)域；相同氨基酸用“＊”表示，相似氨基酸用“．”與“：”表示。Solid frame indicated predicted trans-membrane region;solid double arrow indicated LCR region;solid line indicated predic ted N-terminal domain of glutamine synthase;shade part was conserved region;indentical amino acids indicated by “*”，and similar ones by “·” and “：”.楊樹Populustrichocarpa(XP_002312733.1)、PopulussimoniixPopulusnigra(ALJ94030.1)、酸棗Ziziphusjujube(XP_015888259.1)、麻瘋樹Jatrophacurcas(XP_012069490.1)、苧麻Boehmerianivea_1(AJI44225.1)、苧麻Boehmerianivea_2(AJD14836.1)、芝麻Sesamumindicum(XP_011090823.1)、胡蘿卜Daucuscarotasubsp.sativus(XP_017223067.1)、角叉菜Chondruscrispus_1(XP_005712206.1)、Galdieriasulphuraria(XP_005705248.1)、Dixoniellagrisea_1(ADX97446.1)、Dixoniellagrisea_2(ADX97445.1)、細(xì)毛石花菜Gelidiumcrinale(AAK60408.1)、角叉菜Chondruscrispus_2(XP_005717136.1)、角叉菜Chondruscrispus_3(XP_005717133.1))
圖2 Gln序列比對結(jié)果
Fig.2 The amino acid sequences alignment ofglngene

2.2 氨基酸序列進化分析

Hsp序列系統(tǒng)進化樹見圖3，整個NJ樹的樹形分為1個較大的類群和1個較小的類群，較小類群由角叉菜組成，龍須菜與紅球菌、八孢裂殖酵母和其他細(xì)菌序列聚合成一支較大的類群。

Gln序列系統(tǒng)進化樹見圖4，進化樹分為2個大類群，一大類群由雙子葉植物綱的植物組成，一大類群由紅藻門海藻組成，這與氨基酸序列對比的結(jié)果一致。龍須菜處于紅藻門海藻的類群中，先與角叉菜聚為一支，然后與Galdieriasulphuraria聚為一支，最后與Dixoniellagrisea和角叉菜所在的分支聚為大枝。

(Phycicoccussp.1(WP_056923286.1)、Phycicoccussp.2(WP_057378702.1)、Knoelliaaerolata(WP_035937060.1)、Tetrasphaeraaustraliensis_1(CCH71736.1)、Tetrasphaeraaustraliensis_2(WP_048701086.1)、Friedmanniellaflava(SEQ28565.1)、紅球菌Rhodococcussp.1(WP_008711816.1)、紅球菌Rhodococcussp.2(WP_032374627.1)、紅球菌Rhodococcussp.3(WP_057473142.1)、紅球菌Rhodococcussp.4(WP_027494920.1)、八孢裂殖酵母Schizosaccharomycesoctosporus(XP_013018981.1)、Chlorobibacterium(KXB97182.1)、龍須菜Gracilariopsislemaneiformis(KY971285)(本實驗)、角叉菜Chondruscrispus_2(XP_005710585.1)、角叉菜Chondruscrispus_1(XP_005713022.1)、角叉菜Chondruscrispus_3(XP_005710590.1))
圖3 基于hsp氨基酸序列的NJ進化樹
Fig.3 NJ tree based onhspamino acids

2.3 hsp、gln基因上游序列的啟動子元件分析

測序獲得hsp基因上游序列807 bp和gln基因上游序列951 bp分別進行啟動子預(yù)測分析，hsp和gln基因上游部分的序列具有多個TATA-box、CAAT-box，hsp上游序列含有11處TATA-box，18處CAAT-box；gln上游序列含有14處TATA-box、11處CAAT-box。hsp和gln上游序列中除了基本的轉(zhuǎn)錄起始元件TATA-box、CAAT-box之外，還存在著許多應(yīng)答元件如光響應(yīng)元件、缺氧誘導(dǎo)的調(diào)控元件、茉莉酸甲酯反應(yīng)調(diào)控元件和晝夜控制的調(diào)節(jié)元件(見圖5、6和表2)。hsp上游序列還具有冷反應(yīng)和脫水反應(yīng)的調(diào)控元件(1個)、防御和應(yīng)激反應(yīng)中的作用元件(1個)、脫落酸反應(yīng)作用元件(3個)和MYB結(jié)合位點(4個)。gln上游序列具有低溫反應(yīng)作用中的元件(2個)、熱應(yīng)激反應(yīng)中的作用元件(1個)、水楊酸反應(yīng)中的作用元件(1個)、生長素反應(yīng)元件(1個)和與分生組織相關(guān)的調(diào)控元件(2個)。

(楊樹Populustrichocarpa(XP_002312733.1)、PopulussimoniixPopulusnigra(ALJ94030.1)、可可Theobromacacao(XP_017975012.1)、酸棗Ziziphusjujube(XP_015888259.1)、麻瘋樹Jatrophacurcas(XP_012069490.1)、苧麻Boehmerianivea_1(AJI44225.1)、苧麻Boehmerianivea_2(AJD14836.1)、芝麻Sesamumindicum(XP_011090823.1)、胡蘿卜Daucuscarotasubsp.sativus(XP_017223067.1)、角叉菜Chondruscrispus_1(XP_005712206.1)、龍須菜Gracilariopsislemaneiformis(KY971286)(本實驗)、Galdieriasulphuraria(XP_005705248.1)、Dixoniellagrisea_1(ADX97446.1)、Dixoniellagrisea_2(ADX97445.1)、細(xì)毛石花菜Gelidiumcrinale(AAK60408.1)、角叉菜Chondruscrispus_2(XP_005717136.1)、角叉菜Chondruscrispus_3(XP_005717133.1))
圖4 基于gln氨基酸序列的NJ進化樹
Fig.4 NJ tree based onglnamino acids

2.4 龍須菜hsp、gln基因表達(dá)分析

根據(jù)hsp、gln、18s、gapdh基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得此4個基因的擴增效率分別為98.2%、100.4%、99.7%、101.0%，均接近100%且偏差在5%內(nèi)，說明熒光定量引物合格可用。在龍須菜魯龍1號和981品系的發(fā)育過程中，hsp基因表達(dá)水平的變化趨勢相似(見圖7)，從Ⅰ～Ⅲ階段，hsp基因表達(dá)水平呈緩慢上升狀態(tài)，到Ⅳ階段時表達(dá)水平出現(xiàn)驟然大幅升高(p<0.05)；與981品系相比，魯龍1號品系hsp基因相對表達(dá)量增加更多。gln基因在龍須菜魯龍1號和981品系的發(fā)育過程中，表達(dá)水平的變化趨勢也十分相似(見圖8)，從Ⅰ～Ⅱ階段呈上升趨勢，從Ⅱ階段到Ⅳ階段基因表達(dá)水平下降，到Ⅳ階段使達(dá)到最低水平；魯龍1號Ⅱ階段到Ⅲ階段的gln基因的相對表達(dá)量下降更多(p<0.05)。

圖5 hsp啟動子部分序列分析Fig.5 Promoter analysis of hsp upstream sequence sequence

3 討論

本實驗克隆得到了龍須菜hsp和gln基因，經(jīng)信號肽預(yù)測發(fā)現(xiàn)，兩基因的蛋白均不存在信號肽，為非分泌型蛋白。Hsp氨基酸序列的49～164 aa分析為HSP20的功能結(jié)構(gòu)域，此序列區(qū)與角叉菜最為相近。HSP20是熱休克蛋白(HSP)家族中平均分子量為20 kD的蛋白，作為分子伴侶在高溫下防止蛋白質(zhì)發(fā)生變性和聚集[22- 23]。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)Hsp序列在物種間存在較大差異，全長166 aa的氨基酸序列上，共有8個保守位點，均處于HSP20結(jié)構(gòu)域內(nèi)，說明該結(jié)構(gòu)域?qū)Φ鞍坠δ艿闹匾饬x。Hsp的NJ進化樹分析發(fā)現(xiàn)，龍須菜的Hsp與杉藻科角叉菜的Hsp在進化中處于不同的進化分支上，而與放線菌、酵母、綠菌及星球蟲科Tetrasphaeraaustraliensis的Hsp處于同一進化支中，發(fā)現(xiàn)Hsp在不同紅藻中的起源存在不同。

Gln序列的65～144 aa處分析為谷氨酰胺合成酶N結(jié)構(gòu)域，與谷氨酰胺合成酶的生物合成、酶活性相關(guān)，有助于谷氨酰胺合成酶結(jié)合底物[24]?？缒^(qū)預(yù)測發(fā)現(xiàn)Gln序列含有兩個跨膜區(qū)為(1～18 aa TMⅠ和47～69 aa TMⅡ)，說明其為跨膜蛋白。蛋白功能結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)29～41 aa為LCR。LCR是蛋白質(zhì)片段中重復(fù)出現(xiàn)一種或少數(shù)幾種氨基酸，氨基酸多樣性比較低[25]。LCR與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性相關(guān)，LCR在蛋白質(zhì)表面的含量隨蛋白質(zhì)半衰期的增長而增多[26]。Gln序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TMⅠ、TMⅡ跨膜區(qū)、LCR均為龍須菜中特有的序列區(qū)域，這些特有的序列結(jié)構(gòu)可能是龍須菜在進化過程中產(chǎn)生的，使蛋白質(zhì)具有獨特的功能特征，如跨膜區(qū)可能使蛋白質(zhì)具有附于膜上的能力。比對結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)，雙子葉植物綱的Gln序列結(jié)構(gòu)相似，龍須菜的Gln序列與紅藻的序列結(jié)構(gòu)相似。這一結(jié)果與系統(tǒng)進化樹的分析結(jié)果一致。系統(tǒng)進化樹中將紅藻的Gln與雙子葉植物的Gln分為了2大類群，這說明紅藻與雙子葉植物的Gln在進化過程中產(chǎn)生了分歧，從而形成了2個進化支，龍須菜的Gln處于紅藻Gln進化支中與角叉菜Gln相近的位置。

圖6 gln啟動子部分序列分析Fig.6 Promoter analysis of gln upstream sequence

圖7 龍須菜981和魯龍1號不同發(fā)育階段中hsp基因的相對表達(dá)量Fig.7 Relative analysis of hsp in different development stages of different Gp.lemaneiformis strains

表2 啟動子區(qū)的調(diào)控元件分析Table 2 Cis-acting regulatory elements analysis of promoter sequences of hsp and gln

圖8 龍須菜981和魯龍1號不同發(fā)育階段中g(shù)ln基因的相對表達(dá)量Fig.8 Relative analysis of gln in different development stages of different Gp.lemaneiformis strains

植物啟動子包括核心元件和一般上游元件，分析發(fā)現(xiàn)獲得的gln和hsp基因上游均具有TATA-box和CAAT-box，這是絕大多數(shù)啟動子正確啟動轉(zhuǎn)錄所必需的。TATA-box一般位于轉(zhuǎn)錄起始位點前25～30 bp的區(qū)域內(nèi)，是RNA聚合酶II結(jié)合位點，保證轉(zhuǎn)錄的精確起始，并調(diào)控上游激活蛋白[27]。CAAT-box主要分布在轉(zhuǎn)錄起始位點及其前面的150 bp范圍內(nèi)，主要控制著轉(zhuǎn)錄起始的頻率，并增強轉(zhuǎn)錄，是啟動子、增強子區(qū)域常見作用元件[28]。除了參與調(diào)控真核基因轉(zhuǎn)錄的基本元件，gln和hsp上游序列中還具有多種調(diào)節(jié)元件，2基因的表達(dá)均可能受光照、茉莉酸甲酯、厭氧和晝夜環(huán)境影響。植物激素對紅藻生殖發(fā)育具有調(diào)控作用，如精胺具有促進蜈蚣藻果胞的成熟和釋放的作用[29-30]；乙烯能夠促進翼枝菜的四分孢子囊成熟[31]。通過上游序列分析發(fā)現(xiàn)，gln基因表達(dá)可能受水楊酸、生長素的影響，而hsp基因的表達(dá)可能受MYB轉(zhuǎn)錄因子、脫落酸影響。有研究發(fā)現(xiàn)水楊酸、生長素、MYB、脫落酸轉(zhuǎn)錄因子均與植物生殖發(fā)育相關(guān)，如水楊酸可抑制小蒼蘭種球的生長、推遲花期、減少小花數(shù)目[32]；生長素對花分生組織的形成、雄蕊花絲發(fā)育、雌蕊心皮邊緣的軸向?qū)ΨQ和胎座框的發(fā)育相關(guān)[33-34]；MYB 轉(zhuǎn)錄因子與胚軸細(xì)胞伸長、轉(zhuǎn)基因植株花瓣大小、花粉和花芽的發(fā)育等相關(guān)[35]；脫落酸在植物的成花誘導(dǎo)、花芽分化及開花調(diào)控中也起著非常重要的作用[36]，還參與多種果實發(fā)育的生理過程，如柿子(Diospyroskaki)[37]、柑橘(Citrusreticulata)[38]、櫻桃(Prunusspecies)[39]、葡萄(Vitisvinifera)[40]、草莓(Fragaria×ananassa)[41]。在昆布屬(Ecklonia)海藻的孢子中, 脫落酸(ABA)的含量隨季節(jié)的變化而變化[42]。因此，推測這些因素可能通過調(diào)控gln與hsp基因的表達(dá)來影響龍須菜的育性表現(xiàn)，但這一推測仍需要進一步的研究。

基因表達(dá)水平檢測研究發(fā)現(xiàn)hsp基因在龍須菜不同品系發(fā)育的前3個階段處于緩慢升高的狀態(tài)，到Ⅳ階段上升幅度突然增大。研究發(fā)現(xiàn)，許多hsp家族成員參與生物體性成熟，如百合產(chǎn)生小孢子的減數(shù)分裂一期中，細(xì)胞核或染色體的變化可能有hsp70同源蛋白參與[43]；釀酒酵母的減數(shù)分裂受啟動子附近的熱休克元件相互作用誘導(dǎo)[44]；在番茄花粉發(fā)育早期的造孢組織、小孢子和絨氈層前體中檢測到存在hsp70同源的mRNA和蛋白，hsp70同源蛋白儲存在成熟的花粉粒中[45]；蘭州百合的hsp16.45可能幫助花粉母細(xì)胞和絨氈層細(xì)胞，在減數(shù)分裂的偶線期晚期到粗線期階段對抗極端溫度[46]；hsp70同源蛋白mRNA的缺失可能是造成高粱細(xì)胞質(zhì)雄性不育的重要原因[47]；在玉米花粉發(fā)育過程中的減數(shù)分裂前期和減數(shù)分裂期，hsp81在胚中大量表達(dá)[48]。龍須菜發(fā)育的Ⅳ階段特征為藻體表面四分孢子放散完畢，藻體便面出現(xiàn)大量孔洞，因此推測hsp在Ⅳ階段表達(dá)量特異性升高可能與四分孢子放散完畢后，藻體表面形成的大量傷口的修復(fù)相關(guān)，但此推測還需進一步的實驗驗證。gln基因在龍須菜2個品系的發(fā)育過程中的Ⅱ階段表達(dá)水平最高，Ⅳ階段表達(dá)水平最低，Ⅰ階段和Ⅲ階段為變化的過渡階段。有研究發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺合成酶與生物育性相關(guān)。谷氨酰胺合成酶在盤基網(wǎng)柄菌孢子母細(xì)胞中的活性比在柄細(xì)胞中的活性高約4倍，為谷氨酰胺合成酶調(diào)節(jié)盤基網(wǎng)柄菌發(fā)育提供了證據(jù)[13]；谷氨酰胺合成酶在水稻花粉成熟過程中起到重要作用，抑制谷氨酰胺合成酶活性，會使水稻圓錐花序中的氨積累，而導(dǎo)致水稻不育[13]等等。龍須菜在Ⅱ階段形成大量的四分孢子囊，并伴有少量的四分孢子放散現(xiàn)象；在Ⅳ階段孢子放散完畢，因此推測gln基因可能與龍須菜藻體表面大量四分孢子囊的形成相關(guān)。相比981品系，魯龍1號品系中hsp和gln基因的變化趨勢更加急劇，這可能與龍須菜兩品系不同的育性表現(xiàn)相關(guān)，但這些推測均還需要后續(xù)研究工作繼續(xù)探究。

致謝：特別感謝李曉東對本研究的貢獻，完成了表達(dá)譜數(shù)據(jù)篩選及基因克隆工作。