鞏五虎，薛少華，張 巖，林 源

（1.西安市公安局刑事偵查局技術(shù)處，陜西 西安 710038；2.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點實驗室上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海200063）

1 案例

1.1 簡要案情

兩名女性（全文用A和B進行標示）要求進行同父姐妹親緣關(guān)系鑒定，父母均已過世，且無任何其他直系親屬，無任何身份證明文件，如出生記錄、戶口記錄等。

常規(guī)檢測手段為采用X-STR檢測試劑盒對上述兩名個體DNA樣本進行分型檢測。采用商業(yè)化檢測試劑盒Investigator X-12試劑盒（德國凱杰公司）對12個X-STR基因座進行分型檢測[1]。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因座DXS8378和HPRTB存在突變的可能性，分型信息見表1。由于基因座DXS8378和HPRTB分別為X染色上連鎖群1和連鎖群4的核心基因座，國內(nèi)市場上推出的Goldeneye 17X試劑盒（北京基點認知生物有限公司）含有上述兩個基因座。兩個試劑盒檢測結(jié)果表明，相同基因座檢測結(jié)果一致，新增加的X-STR基因座分型在A和B個體中均檢見一個相同的等位基因。該案例依據(jù)現(xiàn)有檢測手段，無法做出肯定性的判斷結(jié)果。

表1 兩名女性個體（A和B）在12個X-STR基因座的分型結(jié)果

1.2 X-InDel位點的檢測信息

采用含有18個X染色體上Indel（Insertion-Deletion，Indel）位點的復(fù)合擴增體系對上述兩份DNA樣本進行分型檢測[2]。該復(fù)合擴增體系及應(yīng)用已獲專利授權(quán)（ZL 2013 1 0161815.3）。PCR反應(yīng)采用10μL擴增體系，其中，包括PCR反應(yīng)緩沖液2 μL，引物混合物 1 μL，DNA 聚合酶 1 μL，模板 DNA 0.5 ng，其余體積用去離子水補齊。反應(yīng)體系在9700 PCR儀上進行擴增，PCR擴增參數(shù)為：95℃15 min；94℃30 sec、65℃90 sec、72℃、90 sec，共進行 30 個循環(huán)；60℃延伸60 min。PCR產(chǎn)物變性后在3130XL遺傳分析儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行毛細管電泳，采用已授權(quán)分型文件進行等位基因結(jié)果判讀。兩份樣本在18個X-Indel的分型均檢見一個相同的等位基因。

1.3 X-SNP位點的檢測信息

為進一步獲取遺傳信息量，以更好地做出結(jié)果判斷，嘗試采用已完成驗證的高通量并行測序（Massive parallel sequencing， MPS）體系對 29個 XSNP位點進行分型檢測[3]。測序在Ion Torrent PGM（美國Thermo Fisher Scientific公司）完成，主要步驟包括文庫構(gòu)建、文庫修飾及定量、文庫富集及定量、芯片loading及測序、數(shù)據(jù)分析。兩份樣本在29個X-SNP位點分型均檢見一個相同的等位基因。

1.4 基于MPS技術(shù)對X-STR測序檢測

針對Investigator X-12試劑盒中包含的12個X-STR基因座進行MPS文庫構(gòu)建引物設(shè)計，其中DXS10134、DXS10079和 DXS10148基因座無法獲取理想的文庫構(gòu)建引物，其余9個STR基因座引物信息見表2。測序在Ion Torrent PGM平臺進行，采用“PGM:Ion PGMTMTemplate OT2 400 Kit for Hi-QTM”模式進行400 bp文庫測序，芯片為314 V2。測序發(fā)現(xiàn)樣本A和B在9個X-STR基因座上檢見的相同等位基因序列結(jié)構(gòu)一致，如DXS10101基因座相同等位基因29.2的序列結(jié)構(gòu)均為[AAAG]3GAAAGAAG[GAAA]3A[GAAA]4AAGA[AAAG]5AAAAAGAA[AAAG]14AA，其中黑色加粗的堿基不納入重復(fù)結(jié)構(gòu)計算[4]。

2 討論

由于女性個體含有兩條X染色體，男性個體只有一條X染色體，故X染色體遺傳標記具有伴性遺傳的特征，表現(xiàn)為性連鎖遺傳，以單倍體形式遺傳給子代，即母親可將兩條X染色體上的等位基因隨機地遺傳給子女，而父親X染色體上的等位基因則只能遺傳給女兒[1-2]。理論上同父姐妹樣本在X染色體上遺傳標記必然會檢見一個相同的等位基因。本案例特殊之處在于對X染色體上12個STR基因座的檢測中發(fā)現(xiàn)，其中兩個X-STR基因座基因分型均為純合子，存在一步突變的可能性。目前對于X染色體上遺傳標記的法醫(yī)學(xué)檢測試劑盒僅針對STR基因座展開，最多可以檢測17個X-STR基因座。為確?；蚍中筒淮嬖诘任换蚵z現(xiàn)象，采用含有上述兩個基因座的其他生產(chǎn)廠商推出的試劑盒進行驗證。另外，對于X-STR遺傳標記的親權(quán)關(guān)系計算，無統(tǒng)一的算法及相關(guān)標準。當遇到類似本案例情況時，如何進一步增加遺傳信息檢測，獲取更為科學(xué)可靠的法醫(yī)學(xué)證據(jù)，值得進一步研究。

表2 9個X-STR文庫構(gòu)建引物信息

本案例嘗試采用自行研發(fā)的基于毛細管電泳技術(shù)的X-Indel復(fù)合擴增體系對上述突變案例樣本進行了X染色體上遺傳信息的補充檢測，檢測結(jié)果不排除A與B個體屬于同父姐妹關(guān)系。Indel遺傳標記可分為插入和缺失兩種等位基因形式，本質(zhì)上也屬于SNP位點，但是由于存在長度差異，可以在法醫(yī)學(xué)實驗室必備的遺傳分析儀上完成檢測，該技術(shù)易于在基層法醫(yī)DNA實驗室推廣。

另外，本研究采用MPS技術(shù)對X-SNP位點和X-STR基因座進行了測序檢驗。SNP在遺傳分析儀上采用SNPshot技術(shù)也可以完成，但是由于熒光素限制，對于引物設(shè)計存在梯度長度排布的要求，且應(yīng)用于降解檢材效果不佳[5]。本次對29個X-SNP位點進行150bp以下的文庫構(gòu)建，測序效果較好，且適用于降解檢材。檢測中可以對樣本進行并行檢測，且可以根據(jù)樣本數(shù)量進行不同容量芯片的選擇，最大程度上節(jié)約樣本。采用MPS技術(shù)對9個常用X-STR基因座進行并行測序檢測，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)A與B個體在9個基因座上檢見的相同等位基因具有相同的序列結(jié)構(gòu)，且測序序列上變異信息一致，進一步增加了遺傳證據(jù)。

上述檢測實例為如何在常規(guī)X-STR基因座檢測發(fā)生突變情況時進一步獲取遺傳證據(jù)提供了新的遺傳標記及新的技術(shù)手段。其中MPS技術(shù)在多位點、多樣本的并行檢測中展現(xiàn)出了優(yōu)勢，為法醫(yī)學(xué)遺傳標記的高效檢測提供了一種新的思路，為非常規(guī)親緣關(guān)系鑒定提供了新的技術(shù)手段。