徐曉晶， 余一祎， 王志明， 崔越宏， 侯英勇， 劉天舒*

1. 復旦大學附屬中山醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，上海 200032 2. 復旦大學附屬中山醫(yī)院病理科，上海 200032

癌癥的形成是一個多因素、多步驟過程，慢性炎癥作為其中一個重要環(huán)節(jié)參與了10%～20%的癌癥發(fā)生，并與治療反應密切相關(guān)[1]。研究[2]證明，炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是某些結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的危險因素，包括潰瘍性結(jié)腸炎和克隆恩病。腸道炎癥引起致癌突變進而導致腸癌的發(fā)生。隨著對惡性腫瘤炎癥和免疫微環(huán)境認識的進展，IBD相關(guān)腸癌的基因組學特點及微生態(tài)菌群失調(diào)成為了目前研究的熱點。

IBD所致腸道炎癥的特點是中性粒細胞、巨噬細胞和其他免疫細胞特異性聚集，并釋放各種細胞因子、自由基和蛋白水解酶等，從而建立一個腫瘤形成所需的微環(huán)境[3]。研究[4]發(fā)現(xiàn)，IBD中細胞因子和生長因子的表達譜與結(jié)直腸癌有相似之處，包括腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素-1(IL-1)、IL-6、IL-17、IL-22、IL-23等。IBD的另一個特點是腸道菌群失調(diào)，如具核梭桿菌在結(jié)腸癌組織中富集并發(fā)揮重要作用[5]。但目前針對IBD相關(guān)腸癌發(fā)生的具體分子機制尚不清楚。

目前從炎癥到腫瘤的基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化研究主要利用動物模型[6]，而缺乏人群長期隨訪結(jié)果。因此，本研究采用3組IBD相關(guān)結(jié)腸癌患者的腫瘤組織和癌周組織進行二代測序，旨在探索炎癥相關(guān)性腸癌的基因組學特點，尋找并驗證差異表達基因，并對其富集的生物學功能進行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2016年1月至6月就診我科因炎癥性腸病長期隨訪發(fā)現(xiàn)惡性結(jié)腸癌者3例，其中1例合并潰瘍性結(jié)腸炎，2例合并克隆恩病。男性2例，女性1例，中位年齡44歲。2例臨床分期為ⅡA期，1例為ⅢB期。3例患者均符合以下條件：(1)按WHO組織學分類標準，經(jīng)病理學確診為結(jié)腸腺癌合并克隆恩病或潰瘍性結(jié)腸炎；(2)于2016年1月至6月行手術(shù)切除，具體時間分別為2016年2月16日、6月1日、6月15日；(3)手術(shù)標本行甲醛固定、石蠟包埋，室溫條件下保存，為盡量減少基因降解和損傷，標本均于半年內(nèi)進行二代測序；(4)手術(shù)前未接受過放化療；(5)既往接受過氨基水楊酸制劑藥物治療，術(shù)前半年未接受激素或免疫抑制劑治療。

1.2 新一代測序及分析 取石蠟塊內(nèi)部組織，使用切片機切割成5～20 μm切片，總量相當于80 μm。采用Ambion○RRecoverAllTM總核酸提取試劑盒提取RNA。用DNaseⅠ去除基因組DNA的污染，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA；加入打斷試劑在Thermomixer中適溫將mRNA打斷成短片段，以打斷后的mRNA為模板合成一鏈cDNA，然后配制二鏈合成反應體系合成二鏈，并使用試劑盒純化回收、黏性末端修復、cDNA的3′末端加上堿基“A”并連接接頭，經(jīng)片段大小選擇后進行PCP擴增。構(gòu)建好的文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System質(zhì)檢，合格后使用Illumina HiSeq 2000平臺進行測序。過濾掉低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基N含量過高的數(shù)據(jù)，然后使用Bowtie2軟件和RSEM軟件計算基因表達水平。分析不同樣品間的差異表達基因，并根據(jù)KEGG注釋結(jié)果及官方分類，將差異基因進行功能分類和生物學通路富集分析。

1.3 建立炎癥性腸癌動物模型 采用BALB/c品系雄性小鼠，體質(zhì)量18～20 g，6～8周齡，第1天腹腔注射氧化偶氮甲烷(AOM)10 mg/kg，予3%右旋葡聚糖硫酸鈉(DSS)自由飲用1周，后改為正常飲水2周，如此循環(huán)6次。

1.4 RNA抽提及RT-PCR檢測 將動物腫瘤組織和癌周組織剪成小塊在液氮中磨成粉末，采用TRIzol試劑提取組織內(nèi)總RNA，測定純度及濃度。取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成含cDNA的反應體系20 μL，稀釋10倍。每次取2 μL。使用SYBR Green進行RT-PCR反應。CST1前引物為：5′-CCG CAC CAT ATG TAC CAA GT-3′，后引物為：5′-CGT AGA TCT CGA AAG AGC ACA A-3′。SFRP4前引物為：5′-CAC AAC GGT GGT GGA TGT AA-3′，后引物為：5′- GTG GAC ACT GGC AAG AAG AA-3′。MSLN前引物為：5′-GTC AAC AAA GGG CAC GAA ATG-3′，后引物為：5′- AGG GTG TCT AGG GTG TCT TT-3′。TRIM29前引物為：5′-GGA GAC CAC CCA GAA GAA TTT-3′，后引物為：5′- GGC AGG TCA TT GTC AGA GTT-3′。CCL11前引物為：5′- TTC AGC GAC TAG AGA GCT ACA-3′，后引物為：5′- GAA TCC TGC ACC CAC TTC TT-3′。LTF前引物為：5′-GTG GTG TCT CGG ATG GAT AAG-3′，后引物為：5′- GGG CAG TCA GAT CCA TTT CT-3′。β-actin前引物為：5′-CGT GGG CCG CCC TAG GCA CCA-3′，后引物為：5′-TTG GCT TAG GGT TCA GGG GGG-3′。PCR擴增程序：95℃預變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火及延伸20 s，循環(huán)數(shù)為45個。用RT-PCR儀自帶軟件分析，獲得擴增產(chǎn)物的Ct值，結(jié)果采用2-ΔΔCt法來分析mRNA的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 12.0軟件，比較樣本間的基因表達量采用平均值的差異倍數(shù)(fold change)，倍數(shù)≥2倍且檢驗水準(α)為0.05。在富集分析時，對P值進行誤判率(FDR)校正，通常FDR≤0.01者視為顯著富集。FDR是錯誤發(fā)現(xiàn)率的簡稱，用于控制多重試驗中的Ⅰ型錯誤率。

2 結(jié) 果

2.1 采用FFPE標本進行測序的可靠性 各個樣本中質(zhì)量值大于20的堿基數(shù)目占總堿基數(shù)目的比例(Q20)均大于99%，堿基含量分布以及質(zhì)量分布均符合統(tǒng)計分析的要求。與參考基因組序列進行比對后，每個樣品的比對率均在80%左右，同時樣品間均勻的比對率表明樣品間具有可比性。

2.2 差異表達基因檢測 根據(jù)各個樣品基因表達水平結(jié)果，篩選出腫瘤組織和癌周組織間的差異表達基因。結(jié)果(表1)顯示：在腫瘤組織中的表達顯著上調(diào)的基因包括CST1、KRT80、SFRP4、MSLN等，顯著下調(diào)的包括SLC6A19、HGD、CCL11、LTF等。

表1 腫瘤組織/癌周組織前10位的差異表達基因

2.3 采用動物組織驗證差異表達基因 建立炎癥性腸癌動物模型后選擇其中6個基因(CST1、SFRP4、MSLN、TRIM29、CCL11、LTF)在動物組織中進行PCR驗證，結(jié)果表明除MSLN、CCL11外其他基因的表達趨勢與測序結(jié)果一致(圖1、圖2)。

圖1 在炎癥性腸癌動物組織中驗證差異表達基因

A，B：小鼠癌周組織H-E染色，可見正常腺體結(jié)構(gòu);C，D：AOM/DSS聯(lián)合誘導小鼠CAC模型標本H-E染色，可見典型惡性表現(xiàn)，如腺體緊密貼合、形成篩孔狀、腺泡內(nèi)可見壞死.Original magnification: ×40 (A,C), ×200(B,D)

圖2 PCR驗證差異表達基因

2.4 Pathway功能分類和富集分析 KEGG生物通路分類和富集分析顯示，IBD相關(guān)的腫瘤組織與癌周組織間的差異表達基因共涉及112個通路，其中前10位的通路如表2所示。富集最多的通路集中于免疫性疾病、免疫系統(tǒng)感染性疾病和信號轉(zhuǎn)導等。其中，富集最明顯且包含差異表達基因最多的是原發(fā)性免疫缺陷相關(guān)通路(圖3)。

表2 前10位差異表達基因富集的通路 n(%)

圖3 Pathway功能富集圖

顏色代表Q值(顏色越白值越大，越藍值越小)，值越小代表富集結(jié)果越顯著;點的大小代表差異基因數(shù)目(點越大代表數(shù)目越多，越小代表數(shù)目越少)

3 討 論

IBD是一種自身免疫紊亂導致的腸道慢性非特異性炎癥性疾病，是結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的重要危險因素。據(jù)報道，防治IBD的藥物如氨基水楊酸、維生素D等可能降低結(jié)直腸癌的發(fā)生風險[7-8]。由于缺乏長期隨訪的大規(guī)模前瞻性臨床研究，目前關(guān)于炎癥性腸病所致結(jié)直腸癌的研究主要基于動物模型。本研究采用回顧性的研究方式，對甲醛固定石蠟包埋臨床樣本進行測序?？紤]到在制備和儲存過程中，F(xiàn)FPE樣品的DNA容易發(fā)生降解、損傷、分子或生物學修飾，因此本研究僅回顧性分析了半年內(nèi)經(jīng)手術(shù)切除的常溫保存的石蠟標本。結(jié)果表明，經(jīng)數(shù)據(jù)過濾后，其堿基含量分布以及質(zhì)量分布均符合統(tǒng)計分析的要求且樣品間具有可比性。因此，采用FFPE標本進行測序具備一定的可靠性。研究[9-11]證實，在新鮮組織難以獲得的情況下，F(xiàn)FPE標本可以作為備選方案進行新一代測序。

本研究通過對3例炎癥性腸病所致結(jié)腸癌患者的腫瘤組織和癌周組織進行測序，發(fā)現(xiàn)兩者間存在上萬個差異表達基因，涉及分子、細胞、生物過程等各個方面。進一步分類和富集分析提示，這些差異基因主要與人類免疫缺陷性疾病和感染性疾病相關(guān)。其次，信號轉(zhuǎn)導、運輸和代謝也起到重要作用。NF-κB、PI3K-Akt、鈣離子、B細胞受體、EB病毒感染等傳統(tǒng)信號通路也參與其中。本研究進一步總結(jié)了差異倍數(shù)前10位的基因，根據(jù)文獻報道挑選了6個基因在炎癥性腸癌動物模型的新鮮腫瘤組織和癌周組織中進行了PCR驗證。結(jié)果提示，除MSLN、CCL11外，其他基因的表達差異趨勢與測序結(jié)果一致。據(jù)報道，分泌型卷曲相關(guān)蛋白4(SFRP4)作為Wnt信號通路的調(diào)節(jié)劑，參與細胞增殖、分化、凋亡及腫瘤形成過程[12]；MSLN編碼的間皮素作為細胞黏附蛋白，在多種腫瘤中呈現(xiàn)過表達[13]；人類宿主因子TRIM家族蛋白TRIM29通過抑制先天性免疫反應，從而促進鼻咽癌患者EB病毒持續(xù)性感染[14]；腫瘤相關(guān)鈣離子信號轉(zhuǎn)換因子2(TACSTD2)能夠編碼腫瘤相關(guān)性抗原，是一種參與鈣離子信號轉(zhuǎn)換的細胞表面受體[15]。上述基因的表達在IBD相關(guān)腫瘤組織中均呈上調(diào)趨勢。還有一些下調(diào)的基因，例如LTF編碼的乳酸轉(zhuǎn)鐵蛋白作為非特異性免疫系統(tǒng)的重要部分，參與宿主防御微生物感染、調(diào)節(jié)細胞生長和分化、阻止腫瘤形成和轉(zhuǎn)移[16-17]，其表達下調(diào)可能參與炎癥及腫瘤的形成。

目前，炎癥性腸癌動物模型一般采用致癌劑氧化偶氮甲烷(AOM)/致炎劑葡聚糖硫酸鈉(DSS)方法誘導。在炎癥至腫瘤的不同階段留取標本進行基因組學、蛋白質(zhì)組學的研究簡單易行，但并不能準確反映人類炎癌的特征。研究模型成為了限制因素。隨著三維培養(yǎng)的發(fā)展，利用患者的自身腫瘤細胞，研究其與免疫細胞間的相互作用，并進行藥物篩選，能為實現(xiàn)個體化治療提供基礎(chǔ)。今后有待收集新鮮的人類組織標本，進行前瞻性隨機對照研究或組織學分析，以驗證本研究結(jié)論。