楊 曉 旭， 張 麗， 劉 真 真， 王 興， 郭 延 柱,2

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 輕工與化學(xué)工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034；2.華南理工大學(xué) 制漿造紙工程國家重點實驗室， 廣東 廣州 510640 )

0 引 言

兩親性纖維素聚合物是一類新型的纖維素高附加值衍生物，其分子結(jié)構(gòu)中因同時含有親水基團和疏水基團，在水溶液中可通過自組裝技術(shù)形成具有核殼結(jié)構(gòu)的納米膠束[1-2]。其中膠束內(nèi)核由疏水性鏈段通過鏈段間的疏水作用力形成，可作為疏水性功能分子的納米容器；膠束外殼由親水性鏈段通過分子間氫鍵和范德華力相互作用形成，以溶劑化的形式包裹在疏水內(nèi)核外面，為膠束提供穩(wěn)定的外界環(huán)境[3-4]。由于聚合物膠束的親水性外殼由纖維素及其衍生物等天然高分子材料組成，故其具有優(yōu)異的生物可降解性和生物相容性，可作為紫杉醇[5-6]和吳茱萸堿[7-8]等疏水性抗癌藥物的運輸載體。

目前，關(guān)于兩親性纖維素聚合物的合成主要有3種途徑：纖維素本體的疏水化改性、水溶性纖維素衍生物的疏水化改性和油溶性纖維素衍生物的親水化改性。用于水溶性纖維素衍生物疏水化改性的原料包括羥乙基纖維素(HEC)、羧甲基纖維素(CMC)、羥丙基纖維素(HPC)、纖維素季銨鹽(QC)，其中HEC[9]因具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、生物相容性好、水溶性好、羥基含量較多等特點，在兩親性纖維素聚合物的制備中的研究最為廣泛[10-12]。Jiang等[13]采用ROP法合成了HEC-g-PCL兩親性聚合物，在水溶液中聚合物自組裝形成納米膠束，且隨著疏水單體用量的增加其臨界膠束濃度不斷減小，具體范圍在0.4～1.5 mg/mL。?stmark等[14]合成了一種以HEC為主鏈的兩親性嵌段接枝共聚物(HEC-g-PCL-g-PAA)，AFM結(jié)果表明聚合物可自組裝形成核殼結(jié)構(gòu)的單分子膠束，膠束分布均勻無聚集現(xiàn)象且粒徑在30～50 nm，在納米載體、靶向治療方面具有較好的應(yīng)用價值。

本研究采用鹵代烷烴(溴代十二烷和溴代十八烷)為疏水單體，對HEC進(jìn)行疏水化改性合成一系列HMHEC聚合物。通過改變疏水單體種類和用量，在水溶液中得到了穩(wěn)定性好的自組裝納米膠束，并探索納米膠束對疏水性抗癌藥物的包載效果。

1 實 驗

1.1 實驗原料和試劑

羥乙基纖維素(HEC)，摩爾取代度1.8，阿拉丁試劑有限公司，使用前于45 ℃真空干燥48 h以徹底除去水分。溴代十二烷(BD-12)，純度大于99.0%；溴代十八烷(BD-18)，純度大于97.0%；芘，純度大于99.9%；紫杉醇(PTX)，純度大于99.9%；吳茱萸堿(EVO)，純度均大于99.9%；Sigmar公司。異丙醇、正己烷、氫氧化鈉、丙酮以及磷鎢酸，分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 HMHEC聚合物的合成

稱取1 g HEC分散于6 mL異丙醇溶液中，氮氣保護(hù)下，25 ℃水浴磁力攪拌30 min。將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的活化劑NaOH溶液逐滴加入該混合液中，磁力攪拌24 h使HEC完全潤脹。將定量的BD-12/異丙醇或BD-18/異丙醇溶液逐滴加入上述溶液中，80 ℃下攪拌反應(yīng)5 h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)體系冷卻至室溫，產(chǎn)物經(jīng)正己烷浸泡過夜后，抽濾得到的沉淀分別用體積比為80%、90%、100%丙酮溶液進(jìn)行依次浸泡抽濾，最終產(chǎn)物HMHEC用冰醋酸調(diào)至pH為7～8后，45 ℃真空干燥12 h得到HMHEC產(chǎn)品。

1.3 HMHEC納米膠束的制備

準(zhǔn)確稱取100 mg HMHEC聚合物于10 mL超純水中，在超聲清洗機中超聲分散30 min。超聲條件：功率75 W，超聲2 s停1 s，經(jīng)0.22 μm濾頭過濾得到HMHEC聚合物納米膠束水溶液。

1.4 HMHEC聚合物及自組裝納米膠束的表征

1.4.1 傅里葉紅外光譜(FT-IR)表征

準(zhǔn)確稱取2 mg樣品與200 mg KBr混合均勻，研磨壓片后在光譜儀上掃描，純KBr壓片為背景掃描，掃描范圍400～4 000 cm-1。

1.4.2 氫核磁共振光譜(1H-NMR)表征

1H-NMR核磁譜圖在Bruker AV-Ⅲ 400M上獲得，樣品質(zhì)量濃度為20 mg/mL，溶劑為D2O-d6，測試內(nèi)標(biāo)為三甲基硅烷(TMS)。

1.4.3 熱重分析(TGA)

利用Q500型的熱重分析儀對樣品的熱穩(wěn)定性進(jìn)行表征，樣品質(zhì)量5～10 mg，測試溫度范圍室溫至600 ℃，升溫速率10 ℃/min，氮氣保護(hù)，體積流量30 mL/min。

1.4.4 臨界膠束濃度(CMC)表征

HMHEC聚合物的CMC值采用芘熒光探針法進(jìn)行測定。具體操作：配制10 mg/mL的HMHEC 聚合物納米膠束水溶液，采用逐級稀釋法制得質(zhì)量濃度分別為1、0.5、0.1、0.050 0、0.010 0、0.005 0、0.001 0、0.000 1 mg/mL的納米膠束水溶液，準(zhǔn)確移取50 μL的芘/丙酮溶液(0.6 μmol/L)，攪拌下加入至5 mL不同濃度的膠束水溶液中，經(jīng)漩渦振蕩混合器混合均勻后，置于超聲波清洗機內(nèi)超聲2 h，以輔助探針芘進(jìn)入膠束內(nèi)核。將該溶液置于37 ℃水浴搖床中振蕩過夜，使丙酮完全揮發(fā)，待結(jié)束后冷卻至室溫進(jìn)行測定。在LS-55型熒光光譜儀上進(jìn)行光譜測量，測試條件：激發(fā)波長339 nm，掃描范圍360～550 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為10和5 nm。

1.4.5 粒徑和Zeta電位測定

HMHEC納米膠束的粒徑大小和Zeta電位采用Nano ZS90型納米粒度儀進(jìn)行測量。測定粒徑時，膠束質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL；測定Zeta電位時，膠束的質(zhì)量濃度為1 mg/mL。測試前需將樣品置于超聲波清洗機內(nèi)超聲分散30 min，用0.22 μm 的濾頭過濾除去膠束聚集體。每個樣品重復(fù)測量5次，得到平均粒徑(Rh)。

1.4.6 透射電鏡(TEM)表征

HMHEC納米膠束的形貌采用JEM-2100型透射電子顯微鏡進(jìn)行表征。取一滴HMHEC納米膠束水溶液(0.1 mg/mL)置于200目鍍碳膜銅網(wǎng)上，用2%的磷鎢酸溶液染色3 min，50 ℃真空干燥10 min。測試條件：加速電壓200 kV。

1.5 HMHEC納米膠束對PTX或EVO的包載及包封率的測定

配制1.0～4.0 μg/mL的PTX/乙醇溶液，利用紫外可見光分光光度儀測量不同濃度PTX溶液在227 nm處的吸光度。吸光度(A)和PTX/乙醇溶液濃度(C)的關(guān)系為：A=0.156 5C+0.077 1，其中線性相關(guān)系數(shù)R2=0.982 2。EVO/乙醇溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法同PTX。EVO的最大吸收波長為224 nm，吸光度(A)和EVO/乙醇溶液濃度(C)的關(guān)系為：A=0.159C+0.052 7，其中線性相關(guān)系數(shù)R2=0.997 6。

2 結(jié)果與討論

2.1 HMHEC的合成與表征

采用HEC為原料，在異丙醇溶液中以BD-12和BD-18為疏水單體，在氫氧化鈉活化下，合成了一系列長碳鏈?zhǔn)杷男粤u乙基纖維素聚合物(HMHEC)，結(jié)構(gòu)和合成路線如圖1所示。由表1可以看出，隨著單體用量由40%增加至200%，HMHEC聚合物在水和有機溶劑(DMSO)中的溶解性能降低。在單體用量為80%時溶解性能達(dá)到最大，而在單體用量為200%時，HMHEC完全不溶，故采用HMHEC-Ⅲ和HMHEC-Ⅸ聚合物與HEC進(jìn)行對比，分析其結(jié)構(gòu)及性能方面的變化。

圖1 HMHEC聚合物的合成路線Fig.1 The preparation process of amphiphilic HMHEC polymers

圖2為HEC、HMHEC-Ⅲ和HMHEC-Ⅸ的FT-IR譜圖。與HEC的FT-IR譜圖相比，HMHEC 聚合物在1 210～1 000、2 929、1 360和1 463 cm-1附近的吸收峰強度增加。1 210～1 000 cm-1處的吸收峰為C—O伸縮振動吸收峰和C—O—C不對稱伸縮振動吸收峰，表明HMHEC 聚合物結(jié)構(gòu)中醚鍵含量增加；2 929 cm-1處為C—H伸縮振動吸收峰，峰強增加說明聚合物中烷烴結(jié)構(gòu)增加；1 360和1 463 cm-1處分別為甲基和亞甲基的對稱彎曲振動峰和不對稱彎曲振動峰。結(jié)果說明BD-12和BD-18的長碳鏈已成功接枝到HEC主鏈上。

表1 HMHEC的合成、性能及其自組裝納米膠束的特性參數(shù)Tab.1 Preparation, properties of HMHEC polymers and characterization of their self-assembled micelles

圖2 HEC與HMHEC的FT-IR譜圖Fig.2 FT-IR spectra of HEC and HMHEC polymers

圖3為HEC和HMHEC聚合物的1H-NMR 光譜圖。從圖中可以看出，HEC糖環(huán)上各個氫原子信號峰的化學(xué)位移在3.19～4.48，其中4.48處為糖環(huán)C1氫原子的信號峰，3.88處為C6氫原子的信號峰，3.58～3.69處為C3～C5氫原子的信號峰，3.31和3.17處為C4氫原子的信號峰，1.88處為羥乙基中亞甲基(C7～C8)上氫原子的信號峰。HMHEC聚合物上各個氫原子的信號峰位于0.85～1.97，歸屬如下：0.85 處為長鏈烷基中—CH3的氫原子信號峰；1.97、1.21和0.97處均為長鏈烷基中—CH2—氫原子的信號峰。

圖4為HEC和HMHEC聚合物的熱重圖。HEC的初始降解溫度為165.9 ℃，HMHEC-Ⅲ和HMHEC-Ⅸ的初始降解溫度分別為141.2和96.7 ℃。HEC的最大熱降解溫度為230.8 ℃，HMHEC-Ⅲ和HMHEC-Ⅸ的最大熱降解溫度較低，分別為192.8和197.6 ℃。HEC經(jīng)疏水化改性后熱穩(wěn)定性能下降。

圖3 HEC與HMHEC的1H-NMR光譜圖Fig.3 The typical 1H-NMR of HEC and HMHEC polymers

2.2 HMHEC納米膠束的表征

圖5為HMHEC聚合物的CMC值的測試曲線。從圖中可以看出，HMHEC-Ⅲ和HMHEC-Ⅸ聚合物的CMC值分別為378和282 μg/mL。說明隨著聚合物中碳鏈鏈段的增加，HMHEC聚合物的疏水能力增強，聚合物形成的納米膠束溶液更加穩(wěn)定，CMC值降低。

(a) TGA

(b) DTGA

圖5 I1/I3隨HMHEC共聚物在水中濃度的變化曲線Fig.5 Plots of the I1/I3 ratio of pyrene emission spectra in water as a function of the log concentration of HMHEC polymers

圖6為兩親性HMHEC-Ⅲ聚合物納米膠束的粒徑分布圖和TEM圖。從圖中可以看出，HMHEC-Ⅲ聚合物在水溶液中自組裝形成均一的納米膠束，其粒徑在50 nm左右。聚合物膠束的粒徑和Zeta電位如表1所示，對于以BD-12作為疏水鏈段得到的HMHEC，隨著聚合物中疏水單體由40%增加至200%，聚合物膠束的平均粒徑由250 nm減小到82 nm，說明聚合物中疏水單體含量增加，疏水作用力增強，聚合物形成的膠束結(jié)構(gòu)更加緊密，粒徑減小。以BD-18作為疏水鏈段得到的HMHEC也呈現(xiàn)相同趨勢。在疏水單體用量相同時，增加疏水鏈段的鏈長將會降低膠束的平均粒徑，說明疏水鏈段的長度增加將會增強聚合物之間的疏水作用力，使得聚合物的自組裝能力提高。

(a) DLS

(b) TEM

2.3 兩親性疏水改性衍生物HMHEC納米膠束對吳茱萸堿的包載

由表2可以看出，HMHEC聚合物膠束在包載藥物前粒徑為83～250 nm，包載PTX后粒徑為157～343 nm，包載EVO后粒徑為134～312 nm，包載藥物后聚合物膠束粒徑增大。以BD-12作為疏水鏈段得到的HMHEC，隨著疏水單體用量由40%增大至200%，其自組裝納米膠束對PTX的包封率由53.2%增大至79.5%，對EVO的包封率由54.4%增大至85.8%。說明聚合物中疏水單體用量增加，聚合物的疏水能力增強。以BD-18作為疏水鏈段得到的HMHEC也呈現(xiàn)相同趨勢。說明相同疏水單體用量的條件下，增加碳鏈長度有利于提高聚合物的疏水能力，進(jìn)而提高其藥物包載能力。

3 結(jié) 論

在NaOH/異丙醇體系中，借助HEC分子鏈上的羥基與溴代烷烴之間的醚化反應(yīng)，通過改變溴代烷烴用量、溴代烷烴鏈長，制備了一系列具備不同疏水鏈段含量和疏水鏈段鏈長的HMHEC聚合物。FT-IR和1H-NMR 結(jié)果表明長碳鏈結(jié)構(gòu)成功引入到HEC分子鏈中。TGA結(jié)果表明經(jīng)改性后HEC的熱穩(wěn)定性能下降。HMHEC在水溶液中可自組裝形成以疏水碳鏈為核、親水HEC為殼的球形膠束。HMHEC在水溶液中可自組裝形成以疏水碳鏈為核、親水HEC為殼的球形膠束。膠束平均粒徑為83～250 nm，粒徑大小隨疏水鏈段含量和鏈長的增加而降低。HMHEC-Ⅲ 和HMHEC-Ⅸ聚合物的CMC值分別為282和378 μg/mL。HMHEC聚合物自組裝納米膠束對PTX和EVO的最大包封率分別為79.5%和96.3%。膠束包載藥物后，粒徑增大。

表2 HMHEC納米膠束對抗癌藥物的包封率Tab.2 Encapsulation efficiency of HMHEC nano-micelles