張召議， 王彩云， 楊銀鳳

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018 ； 2.農(nóng)業(yè)部動(dòng)物臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

馬鹿屬于偶蹄目鹿科的反芻動(dòng)物。2008年被列入《世界自然保護(hù)聯(lián)盟》瀕危物種紅色名錄—低危(LC)，我國Ⅱ級保護(hù)動(dòng)物。馬鹿的鹿茸是名貴中藥材，鹿角是重要藥用原料，鹿胎、鹿鞭、鹿尾和鹿筋也具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此，馬鹿是一種珍貴的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物。由于生存環(huán)境和飼養(yǎng)條件無法滿足馬鹿特殊要求，很容易產(chǎn)生多種疾病，甚至死亡。Ghrelin 是日本科學(xué)家Kojima等在小鼠和人胃內(nèi)分泌細(xì)胞及下丘腦弓狀核中發(fā)現(xiàn)的一種含有28個(gè)氨基酸殘基的多肽。它是生長激素釋放激素受體(GHS-R)天然的內(nèi)源性配體，具有促進(jìn)生長激素(GH)的釋放、刺激食欲、調(diào)節(jié)能量代謝、促進(jìn)胃蠕動(dòng)、影響消化器官的發(fā)育和成熟等生物學(xué)效應(yīng)[1]。Ghrelin分布廣泛，在人的消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)中均有表達(dá)[2]。Kaiya等研究發(fā)現(xiàn)，其在禽的消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)中也有Ghrelin的表達(dá)[3-6]。隨著研究的不斷深入，Miller等人研究顯示在成年綿羊的消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)內(nèi)Ghrelin均有表達(dá)[7]。Kazak公綿羊的下丘腦、垂體、心臟、肝臟、瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃、十二指腸和背最長肌均發(fā)現(xiàn)有Ghrelin mRNA的分布。黃治國等用RT-PCR和Real-time PCR檢測雄性哈薩克羊和新疆細(xì)毛羊體內(nèi)Ghrelin的表達(dá)及組織分布，發(fā)現(xiàn)所檢測的各組織中均有Ghrelin表達(dá)[8]。有學(xué)者通過檢測發(fā)現(xiàn)Ghrelin和GHS-R1a的mRNA及蛋白在羊卵母細(xì)胞中也有表達(dá)[9]。Wang等在0～56日齡羔羊胃腸道內(nèi)均發(fā)現(xiàn)有Ghrelin的表達(dá)，其中在皺胃內(nèi)的表達(dá)量明顯高于瘤胃、網(wǎng)胃、十二指腸、空腸和回腸[10]。

運(yùn)用RT-PCR技術(shù)證實(shí)Ghrelin基因在烏珠穆沁羊子宮體、輸卵管、子宮頸和陰道組織內(nèi)均有表達(dá)。在蒙古綿羊卵泡中檢測到了Ghrelin mRNA及其多肽的存在[11]。目前有關(guān)Ghrelin在反芻動(dòng)物體內(nèi)的研究報(bào)道較少，且未見Ghrelin在馬鹿各器官內(nèi)的表達(dá)情況的報(bào)道。本試驗(yàn)以馬鹿為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，通過RT-PCR和Real-time PCR方法檢測Ghrelin在其體內(nèi)各組織器官中的表達(dá)情況，以闡述Ghrelin在馬鹿體內(nèi)的分布范圍，了解分泌Ghrelin的主要器官，旨在為進(jìn)一步探討Ghrelin在馬鹿體內(nèi)各器官的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 成年馬鹿(雌性)1頭。

1.2 主要試劑 RNAiso Plus(Total RNA 提取試劑盒， TaKaRa公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimerScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa公司)；Premix TagTM(TaKaRa公司)；SYBR Premix EX TagTMⅡ (Tli RNase Plus，TaKaRa公司)；核酸染料、TAE、氯仿、異丙醇、瓊脂糖、DL-2 000 Marker、75%乙醇。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 材料 馬鹿屠宰后立即刮取舌、氣管、食管、瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸和膀胱等器官的黏膜，并切取適量的大腦、下丘腦、肺、心肌、心內(nèi)膜、肝、胰、脾、腎、輸尿管、輸卵管、子宮、陰道、垂體、松果體、頜下腺、腮腺、甲狀腺、淋巴結(jié)、腎上腺、卵巢和骨骼肌等組織塊，立即置于液氮中冷凍備用。

1.3.2 PCR引物的設(shè)計(jì)及合成 依據(jù)馬鹿Ghrelin mRNA序列和引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)1對特異性PCR引物1(P1、P2)。另外根據(jù)GenBank中馬鹿β-actin序列設(shè)計(jì)了另一對PCR引物2(P3、P4)。引物序列見表1，以上序列均遞送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行合成。

表1 β-actin、馬鹿Ghrelin的引物序列

1.3.3 總RNA的提取 采用TaKaRa公司(日本)的RNAiso Plus Total RNA提取試劑盒，按其說明書進(jìn)行，最后用ddH2O溶解RNA沉淀，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 使用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，反應(yīng)液配置在冰上進(jìn)行。將6.5 μL的RNA加入到1.5 mL離心管中進(jìn)行去除基因組DNA反應(yīng)，反應(yīng)體系為10 μL，其中RNase Free dH2O 0.5 μL、gDNA Eraser 1.0 μL、5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL，42 ℃水浴2 min。將此反應(yīng)液加入到反轉(zhuǎn)錄體系中合成cDNA，反應(yīng)體系為20 μL，其中RNase Free dH2O 4.0 μL、5×Prime Script Buffer 2(for Real Time) 4.0 μL、RT Primer Mix 1.0 μL、Prime Script RT Enzyme Mix I 1.0 μL。置于PCR儀進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 定性表達(dá)檢測 將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為：PremixTaq(TaKaRaTaqTMVersion 2.0 plus dye) 12.5 μL、cDNA 0.5 μL、P1或P3 (20 μmol/L) 0.5 μL、P2或P4(20 μmol/L)0.5 μL、滅菌蒸餾水11 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，66.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂凝膠電泳分離，然后用凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.3.6 定量表達(dá)檢測 以cDNA為模板，進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μL：SYBR PreminExTaq(2×) 10 μL，P1或P3 (10 μmol/L) 0.8 μL，P2或P4 (10 μmol/L) 0.8 μL，10倍稀釋的cDNA模板2 μL，dH2O 6.4 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋簲U(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，63 ℃退火34 s，45個(gè)循環(huán)；熔解程序：95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s。每個(gè)樣品的β-actin基因和Ghrelin基因分別做3個(gè)重復(fù)。Ghrelin的相對表達(dá)量采用2-△CT進(jìn)行計(jì)算△CT= CTGhrelin—CTβ-actin。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)分析 采用Spass 20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，共分為36組，每組做3個(gè)重復(fù)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 定性表達(dá)檢測結(jié)果 為檢測Ghrelin在馬鹿體內(nèi)可能表達(dá)的器官，根據(jù)本課題組呈送到GenBank中馬鹿Ghrelin部分mRNA序列和引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)1對預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物為166 bp的特異性PCR引物，同時(shí)為檢測所提取的馬鹿各器官RNA的完整性，根據(jù)馬鹿β-actin序列設(shè)計(jì)1對預(yù)計(jì)產(chǎn)物為208 bp的引物，選用36鹿器官總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)后，經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳進(jìn)行檢測，在馬鹿的舌、食管、瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸、肝、胰、頜下腺、腮腺、氣管、肺、腎、輸尿管、膀胱、卵巢、輸卵管、子宮、陰道、大腦、下丘腦、垂體、松果體、甲狀腺、腎上腺、心肌、心內(nèi)膜、脾、淋巴結(jié)和骨骼肌內(nèi)均有約166 bp和208 bp 的擴(kuò)增帶(見圖1)。

圖1 馬鹿組織Ghrelin RT-PCR的表達(dá)檢測結(jié)果

1：心肌; 2：甲狀腺; 3：松果體; 4：卵巢; 5：結(jié)腸; 6：瘤胃; 7：腎; 8：膀胱; 9：肺; 10：十二指腸; 11：回腸; 12：食管; 13：盲腸; 14：瓣胃; 15：心內(nèi)膜; 16：脾; 17：子宮; 18：舌頭; 19.皺胃; 20：腎上腺; 21：垂體; 22：網(wǎng)胃; 23：下丘腦; 24：空腸; 25：胰; 26：淋巴結(jié); 27：輸尿管; 28：肝; 29：頜下腺; 30：陰道; 31：結(jié)腸; 32：直腸; 33：大腦; 34：氣管黏膜; 35：骨骼肌; 36：輸卵管; M：DL-2000 DNA Marker

2.2 定量表達(dá)檢測結(jié)果 馬鹿Ghrelin Real-time PCR數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 20.0軟件分析，在以上檢測的36種器官內(nèi)均有Ghrelin表達(dá)且相對表達(dá)量差異顯著，如圖2所示Ghrelin在皺胃內(nèi)的表達(dá)量顯著高于其他器官(P<0.05)，其次是胰、子宮、卵巢、十二指腸和食管，且與舌、瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸、大腦、下丘腦、氣管黏膜、肺、心肌、心內(nèi)膜、肝、脾、腎、輸尿管、膀胱、輸卵管、陰道、垂體、松果體、頜下腺、腮腺、甲狀腺、淋巴結(jié)、腎上腺和骨骼肌等器官內(nèi)的表達(dá)量相比差異顯著(P<0.05)。

圖2 Ghrelin相對表達(dá)量(P<0.05)

3 討論

3.1 定性表達(dá) Ghrelin是一種主要在胃部產(chǎn)生，然后作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腦腸肽[12]。它在小腸、大腸、胰腺、胎盤中有表達(dá)，在下丘腦弓狀核也檢測出有其mRNA表達(dá)[13]。許多研究者采用多種生物學(xué)手段研究Ghrelin在不同動(dòng)物組織器官內(nèi)的表達(dá)情況。它也廣泛分布在反芻動(dòng)物各器官中。本試驗(yàn)通過RT-PCR方法檢測此馬鹿體內(nèi)可能表達(dá)Ghrelin的器官，結(jié)果發(fā)現(xiàn),在所檢測的器官內(nèi)均有表達(dá)。由此推測，Ghrelin可能在馬鹿群體各器官組織中廣泛表達(dá)。王家鄉(xiāng)等采用RT-PCR方法研究Ghrelin在非洲雛鴕鳥胃腸道內(nèi)的分布變化，結(jié)果表明,Ghrelin除在空腸、結(jié)腸不表達(dá)外，在消化道的其他部位均有表達(dá)[5]。而本試驗(yàn)顯示Ghrelin在空腸、結(jié)腸同樣表達(dá)，這些結(jié)果的不同可能是由于種屬差異性，但也可能與樣本數(shù)量過少有關(guān),這一問題還有待于進(jìn)一步研究。

3.2 定量表達(dá) 黃治國等用RT-PCR和Real-time PCR檢測雄性哈薩克羊和新疆細(xì)毛羊體內(nèi)Ghrelin的表達(dá)及組織分布，發(fā)現(xiàn)所檢測的各組織中均有Ghrelin表達(dá)，并且在皺胃內(nèi)的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他器官[8]。本試驗(yàn)以馬鹿為研究對象，采用Real-time PCR方法檢測Ghrelin在不同器官內(nèi)的表達(dá)量，結(jié)果顯示,Ghrelin在所檢測的36種器官內(nèi)的表達(dá)量之間存在顯著差異，且在皺胃內(nèi)的表達(dá)量最高。同時(shí)張曼、劉驕等用RT-PCR和qPCR方法分別檢測馴鹿和梅花鹿體內(nèi)Ghrelin的表達(dá)，結(jié)果顯示,在皺胃內(nèi)的表達(dá)量高于其他被檢測的器官[14-15]。因此，筆者推測Ghrelin可能在馬鹿群體的皺胃內(nèi)表達(dá)量最高。由于馬鹿是我國Ⅱ級保護(hù)動(dòng)物，在開展試驗(yàn)的過程中只能選取被淘汰的馬鹿作為研究對象，因此本試驗(yàn)存在樣本過少等問題，后續(xù)試驗(yàn)在條件允許時(shí)將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本數(shù)量進(jìn)行研究。此試驗(yàn)為今后進(jìn)一步研究Ghrelin在馬鹿群體各組織器官中的表達(dá)情況奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，進(jìn)而為后續(xù)研究Ghrelin在反芻動(dòng)物各組織中的共性表達(dá)提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，Ghrelin在被測馬鹿中的36個(gè)器官內(nèi)均有表達(dá)，且在皺胃內(nèi)的表達(dá)量最高，其次是胰、子宮、卵巢、十二指腸和食管，其他器官的表達(dá)量相對較低。