陳錦嬋 福建省福州市長樂區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心 福州 350200

鴨大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的鴨的重要疾病，該病常見的表現(xiàn)型有敗血癥、心包炎、腹膜炎、氣囊炎和輸卵管炎等多種病型[1-3]。目前，獸醫(yī)臨床上主要應(yīng)用抗菌藥物來預(yù)防和控制鴨大腸桿菌病，導(dǎo)致耐藥菌的不斷產(chǎn)生，而且不同養(yǎng)殖區(qū)域的流行菌株對抗生素的敏感性也存在差異。因此，對當?shù)刂虏【M行分離鑒定并進行藥敏試驗具有重要的意義[4-6]。2014年4月，長樂市漳港街道某養(yǎng)鴨場發(fā)病，患鴨精神萎靡、食欲減退、排綠色稀糞，剖解病死鴨可見心包炎、氣囊炎和腹膜炎等病理變化。根據(jù)臨床癥狀和病死鴨剖檢，初步診斷該病為鴨大腸桿菌病。為進一步確診該病的病原，本試驗進行了細菌分離鑒定，并對分離到的致病菌進行藥敏試驗，為制定該病的預(yù)防和控制措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料和試驗動物 病死鴨來自于長樂市漳港街道某養(yǎng)鴨場；1日齡健康雛鴨由該養(yǎng)鴨場提供。

1.1.2 主要試劑 Taq酶、細菌基因組DNA純化試劑盒和pMD18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；腸桿菌科細菌生化微量鑒定管購自杭州天和微生物試劑有限公司；藥敏試紙片購自冰晶天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.2 方法

1.2.1 致病菌分離及形態(tài)觀察 病死鴨以心包炎和腹膜炎為主要病理特征，無菌采取心包液和腹腔積液劃線接種于脫纖綿羊血瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。挑取形態(tài)一致的單克隆菌落進行純化培養(yǎng)，菌株編號為DC2014-1。將上述純化的培養(yǎng)物劃線接種到麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，革蘭氏染色后進行鏡檢。

1.2.2 動物試驗 取DC2014-1菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng) 24 h后 10 000 r/min離心10 min。菌體用滅菌生理鹽水洗滌3次，將細菌濃度用滅菌生理鹽水調(diào)整為1.0×1010cfu/mL，用于小鼠攻毒試驗。隨機選取20羽1日齡健康雛番鴨，分為對照組和攻毒組，每組10羽。對照組試驗動物頸部皮下注射0.1 mL滅菌生理鹽水，攻毒組試驗動物頸部皮下注射0.1 mL經(jīng)滅菌生理鹽水重懸的DC2014-1菌株。觀察并記錄試驗結(jié)果。

1.2.3 生化試驗 將純化的DC2014-1菌株接種到腸桿菌科細菌生化鑒定管，37℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄結(jié)果。

1.2.4 16S rRNA序列的擴增和測定 應(yīng)用細菌基因組DNA純化試劑盒提取DC2014-1菌株的基因組，以提取的基因組為模板擴增16S rRNA。擴增16S rRNA的上游引物為5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游引物為：5'-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'[7]，引物委托上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：2×Taq酶預(yù)混液25 μL，基因組模板 2 μL，上、下游引物各 2 μL，無 RNA 酶水補齊至 50 μL。PCR 反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94℃30 s，42 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。預(yù)期的PCR擴增產(chǎn)物大小約1 500 bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后進行回收，并克隆到pMD18-T載體，載體轉(zhuǎn)化到TOP10感受態(tài)細胞，挑取陽性菌落，送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對分析，選取同源性較高的16S rRNA序列進行多重比較并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 藥敏試驗 藥敏試驗參考文獻[8]進行。取200 μL新鮮的DC2014-1菌株培養(yǎng)物均勻涂布于營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌鑷子將藥敏紙片均勻貼在瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑，試驗重復(fù)3次，計算抑菌圈直徑的平均值。

2 結(jié) 果

2.1 致病菌分離及形態(tài)觀察 從病死鴨的心包積液和腹腔積液中分離到一株革蘭氏陰性菌，該菌株不溶血，在脫纖綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，表面光滑，圓形微凸，直徑1～2 mm。該菌菌落在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈粉紅色。挑取典型菌落進行革蘭氏染色、鏡檢，結(jié)果顯示該菌為兩端鈍圓的革蘭氏陰性粗短桿菌。

2.2 動物試驗 在接種DC2014-1菌株12 h后，攻毒組試驗鴨表現(xiàn)出扎堆、不愿活動、精神較差、食欲減少；接種24 h后動物開始死亡，至96 h攻毒組試驗動物的死亡率高達50%。取攻毒后14 d未死亡的攻毒組雛鴨剖檢，可見不同程度的細胞炎和氣囊炎等癥狀，與臨床自然發(fā)病病例相似，對照組動物則無上述現(xiàn)象。從死亡和發(fā)病的攻毒組試驗動物體內(nèi)分離到與接種菌株菌落形態(tài)、生化特性、16S rRNA序列一致的細菌，表明該菌為引起該養(yǎng)鴨場感染死亡的病原。

2.3 生化試驗 將DC2014-1菌株按常規(guī)方法進行生化試驗，試驗結(jié)果表明該菌株對葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣；MR試驗、過氧化氫酶試驗陽性；三糖鐵產(chǎn)酸變黃；硫化氫試驗、氧化酶試驗、尿素酶試驗、VP試驗、明膠試驗陰性，與報道的大腸桿菌生化特征基本一致。

圖2 基于分離株調(diào)查DC2014-1 16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

表1 分離株DC2014-1的藥敏試驗

2.4 16S rRNA序列的擴增和測定 采用特異性引物擴增到DC2014-1菌株的16S rRNA，大小約1 500 bp，與預(yù)期結(jié)果一致（見圖1）。該基因回收測序后與GenBank中的序列比對分析，結(jié)果與大腸桿菌的相似度最高。選取相似度最高的細菌16S rRNA序列，多重比較后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，DC2014-1菌株與大腸桿菌在同一分支 （見圖2）。根據(jù)分離株DC2014-1的形態(tài)、生化特征和16S rRNA序列的分析結(jié)果，確定其為大腸桿菌。

圖1 分離株DC2014-1 16S rRNA基因的PCR擴增

2.5 藥敏試驗 選用13種抗菌藥對分離株DC2014-1進行藥物抑菌試驗，結(jié)果顯示（見表1）該菌對頭孢西丁、頭孢唑肟、頭孢克肟和頭孢曲松等4種藥物高度敏感；對多西環(huán)素中度敏感；對阿莫西林、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、青霉素G、卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素和氨芐西林等8種藥物不敏感。

3 討 論

本試驗從病死番鴨的心包液和腹腔積液中分離到一株細菌DC2014-1。該菌的染色特性、生化特性和16S rRNA分析結(jié)果表明，該分離株為大腸桿菌，動物回歸試驗表明該菌為導(dǎo)致番鴨發(fā)病死亡的病原。同時，對該分離菌進行藥物敏感性分析，結(jié)果顯示該菌對多種藥物耐藥，其原因除大腸桿菌自身極易產(chǎn)生耐藥性外，也與養(yǎng)殖場長期添加或大劑量使用抗生素防控細菌性疾病有關(guān)[9-10]。本試驗篩選出對該養(yǎng)殖場大腸桿菌DC2014-1株高度敏感的4種藥物頭孢西丁、頭孢唑肟、頭孢克肟和頭孢曲松，為該養(yǎng)殖場制定預(yù)防和控制大腸桿菌病的措施提供了科學(xué)的依據(jù)。