徐維茵，李 昂，胡 德，張智超，王淑敏**

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130117；2.吉林省生物研究所，吉林 長春 130012）

白刺馬勃（Lycoperdon wrightii Berk.&Curt.）為馬勃科（Lycoperdaceae） 馬勃屬（Lycoperdon） 大型藥用真菌，入藥部位為干燥子實體[1]。子實體成熟后內(nèi)部充滿孢絲和孢子粉，孢子粉可藥用[2]。白刺馬勃味辛、平，入肺經(jīng)，可用于解毒、消腫，更是止血良藥[3]，還可用于治療風(fēng)熱郁肺咽痛，音啞，咳嗽，外用鼻衄，創(chuàng)傷出血[4]。白刺馬勃雖不是《中國藥典》（2015版） 正品馬勃（脫皮馬勃 Langermannia fenzlii、大馬勃Calvatia gigantea和紫色馬勃Calvatia lilacina）[5]，但民間大部分地區(qū)也將其作馬勃入藥。白刺馬勃由于個體較小，常易與小馬勃Lycopedon pusillum混淆，因此本文對白刺馬勃進行生藥學(xué)研究，為今后的應(yīng)用研究和開發(fā)利用提供參考。

1 實驗儀器與材料

1.1 儀器

XL 30 FEG型電子顯微鏡，F(xiàn)EI公司；YYS-100E型生物顯微鏡，上海圓儀光學(xué)儀器有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀，日本島津公司。

1.2 試驗材料

麥角甾醇對照品，中國食品藥品檢定研究院，批號：MUST11070601，純度＞98%；麥角甾酮對照品，上海源葉生物科技有限公司，批號：X22M8L32255，純度＞96%；甲醇，色譜純，美Fisher公司；水為超純水；其他試劑均為分析純。白刺馬勃子實體采集于長春中醫(yī)藥大學(xué)校園草坪，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)王淑敏教授鑒定為白刺馬勃（Lycoperdon wrightii Berk.＆Curt.）。

2 方法

2.1 白刺馬勃的鑒別

2.1.1 基原鑒別

白刺馬勃的原基鑒別，結(jié)果見圖1和圖2。

由圖1和圖2可以看出，白刺馬勃子實體較小，高 0.5 cm～2.0 cm，直徑 0.5 cm～2.5 cm，生長初期呈白色，外包被有密集的白色小刺，其尖端成叢聚合成角錐形，后期其小刺脫落，露出淡色的內(nèi)包被。孢子體呈青黃色，不孕基小或無。生長在草叢或林下草地上，往往叢生在一起。

圖1 白刺馬勃幼嫩子實體Fig.1 Young fruiting body of Lycoperdon wrightii

圖2 白刺馬勃成熟子實體Fig.2 Mature fruiting body of Lycoperdon wrightii

2.1.2 性狀鑒別

白刺馬勃的性狀鑒別，結(jié)果見圖3。

圖3 白刺馬勃藥材Fig.3 Herbs of Lycoperdon wrightii

由圖3可以看出，白刺馬勃子實體小，近圓形或陀螺形，或被壓扁，有不規(guī)則凹陷，具短柄。頭部直徑可達2.5 cm，高可達2.0 cm。柄基部具纖維質(zhì)叢枝狀假根。老時表面孢體呈黃褐色，頂部形成開口，內(nèi)有黃褐色至暗褐色棉絮狀絲狀物，觸之有褐色孢子飛揚。2.1.3 顯微鑒別

白刺馬勃子實體的顯微鑒別結(jié)果見圖4和圖5。

由圖4和圖5可以看出，光學(xué)顯微鏡下孢子呈球形或卵圓形，淺黃色。電子顯微鏡下孢子呈卵圓形，直徑 3 μm～4.5 μm，表面有細小疣狀突起，孢子柄短，孢絲線形，近無色[6]。

圖4 白刺馬勃孢子光鏡下觀察（10×40）Fig.4 Observation on the spores of Lycoperdon wrightii(10×40)

圖5 白刺馬勃孢子電鏡下觀察（10 000×）Fig.5 Observation on the spores of Lycoperdon wrightii（10 00×）

2.1.4 理化性質(zhì)鑒別

火試：取子實體置于火焰上，輕輕抖動，即可見微細的火星飛揚，熄滅后，產(chǎn)生白色濃煙。

薄層鑒別：取白刺馬勃粉末約1 g，加二氯甲烷40 mL，超聲30 min，濾過，濾液置蒸發(fā)皿中蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。另取麥角

圖6 麥角甾醇對照品圖（282 nm）Fig.6 Chromatogram of ergosterol(282 nm)

圖8 麥角甾酮對照品圖（349 nm）Fig.8 Chromatogram of ergotsterone(349 nm)

分別精密稱取麥角甾醇和麥角甾酮對照品適量，加色譜甲醇制成每l毫升含麥角甾醇0.05 mg的溶液和每l毫升含麥角甾酮10 μg的溶液，即得對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

精密稱取白刺馬勃粉末2.0071 g，置100 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL二氯甲烷，超聲30 min，放至室溫，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，減壓干燥，殘渣加適量色譜甲醇使之溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，定容，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。甾醇和麥角甾酮對照品，加入甲醇溶解，分別制成每1毫升含麥角甾醇0.5 mg和麥角甾酮0.02 mg的溶液，作為對照品溶液。按照薄層色譜法（《中國藥典》2015版第4部，0502） 試驗，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一高效硅膠G薄層板上，以石油醚（60℃～90℃） -乙酸乙酯（7:3） 為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。

2.2 白刺馬勃麥角甾醇和麥角甾酮的含量測定

2.2.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（ODS-C18色譜柱，4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-水 （96:4），流速 1.0 mL·min-1，柱溫 28℃，進樣量10 μL，麥角甾醇檢測波長為282 nm，麥角甾酮檢測波長為349 nm。理論塔板數(shù)以麥角甾醇峰計算不得少于10 000，麥角甾酮峰不得少于10 000。記錄色譜圖與標準譜圖一致，見圖6～圖9。

2.2.2 對照品溶液的制備

圖7 白刺馬勃樣品（282 nm）Fig.7 Chromatogram of ergosterol in Lycoperdon wrightii(282 nm)

圖9 白刺馬勃樣品（349 nm）Fig.9 Chromatogram of ergotsterone in Lycoperdon wrightii(349 nm)

3 結(jié)果

3.1 白刺馬勃的鑒別

薄層鑒別結(jié)果見圖10～圖12。

白刺馬勃供試品色譜中有專屬性的藍色熒光斑點。噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰，供試品色譜中，與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的專屬斑點。噴顯色劑后再置紫外光燈（365 nm）下檢視，供試品色譜中，有專屬性的藍色和綠色熒光斑點。

圖10 365 nm紫外光燈下檢視Fig.10 Viewing under 365 nm UV lamp

圖11 顯色后日光燈下檢視Fig.11 Viewing under fluorescent lamp after color rendering

圖12 顯色后365 nm紫外光燈下檢視Fig.12 Viewing under 365 nm UV lamp after color rendering

3.2 麥角甾醇和麥角甾酮含量測定結(jié)果

3.2.1 方法學(xué)考察

（1）標準曲線和線性范圍的考察

分別取麥角甾醇對照品溶液 2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL，取麥角甾酮對照品溶液 2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL，分別注入液相色譜儀，按照“2.2.1”項條件測定。麥角甾醇以質(zhì)量（μg） 為橫坐標（X），麥角甾酮以質(zhì)量（ng） 為橫坐標（X），均以吸收峰面積值為縱坐標（Y），獲得線性回歸方程分別為Y=1 741 574X-1 438 （r=1）、Y=3 186.2X-2 282.9 （r=1）。結(jié)果表明麥角甾醇和麥角甾酮的量分別在 0.1 μg～0.5 μg （r=1）、19.88 μg～139.16 ng（r=1） 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

（2） 精密度考察

分別取麥角甾醇和麥角甾酮對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，按照“2.2.1”項條件測定，各重復(fù)6次。測得麥角甾醇的RSD值為0.12%、麥角甾酮的RSD值為0.19%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

（3） 穩(wěn)定性考察

取白刺馬勃子實體供試品溶液，按照“2.2.1”項條件測定，進樣量為10 μL，分別測定其在0、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h內(nèi)的峰面積值。測得白刺馬勃子實體中麥角甾醇的RSD值為0.23%、麥角甾酮的RSD值為0.44%，結(jié)果表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

（4） 重復(fù)性考察

取同一批白刺馬勃子實體各6份，按照“2.2.3”項條件制備樣品，按照“2.2.1”項條件進行測定。測得白刺馬勃子實體中麥角甾醇的RSD值為0.23%、麥角甾酮的RSD值為0.44%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

（5） 加樣回收考察

精密稱取已測定的白刺馬勃子實體共6份，分別加入一定量的麥角甾醇和麥角甾酮對照品溶液，按照“2.2.3”項條件制備樣品，按照“2.2.1”項條件進行測定，結(jié)果見表1～表2。

從表1、表2可以看出，白刺馬勃麥角甾醇的平均回收率為100.28%，RSD值為0.39%。麥角甾酮的平均回收率為99.82%，RSD值為0.42%。待測樣品的回收率和相對標準偏差均在限度范圍內(nèi)，表明該方法準確度較高。

3.2.2 樣品含量測定

表1 白刺馬勃麥角甾醇加樣回收率（n=6）Tab.1 Recovery of ergosterol in Lycoperdon wrightii(n=6)

表2 白刺馬勃麥角甾酮加樣回收率（n=6）Tab.2 Recovery of ergotsterone in Lycoperdon wrightii(n=6)

取白刺馬勃子實體，按照“2.2.3”項條件制備樣品，按照“2.2.1”項條件測定其中麥角甾醇和麥角甾酮的量，以外標一點法進行計算。測得白刺馬勃子實體中麥角甾醇平均含量為0.0808 mg·g-1，麥角甾酮的平均含量為 16.4871 μg·g-1。

4 討論

本試驗通過對白刺馬勃的生態(tài)考證、子實體的性狀鑒別、孢子的光鏡和電鏡特征觀察以及相應(yīng)的理化性質(zhì)鑒別等研究，建立了綜合鑒別白刺馬勃真?zhèn)蔚姆椒?。薄層色譜結(jié)果表明，白刺馬勃含有麥角甾醇和麥角甾酮成分。經(jīng)高效液相色譜法測定，麥角甾醇含量為 0.0808 mg·g-1，麥角甾酮含量為16.4871 μg·g-1。麥角甾醇（ergosterol）是真菌類的特征甾醇，主要存在于絕大多數(shù)的真菌細胞膜中，據(jù)報道麥角甾醇的量與真菌的生物量存在著相關(guān)關(guān)系，是真菌生物量的重要標志物之一[7]。生物體中的麥角甾醇量穩(wěn)定，可以麥角甾醇為生物指標對真菌進行鑒別[8]。麥角甾醇為脂溶性維生素D2的前體[9]，具有抗癌、防衰老、減毒等功效[10]。麥角甾酮（ergosterone）專屬性強、紫外響應(yīng)值高，且對其研究較少。因此，建立簡單、快速的方法測定馬勃藥材中麥角甾酮含量是必要的。本試驗建立的白刺馬勃中麥角甾醇和麥角甾酮含量測定方法，可作為白刺馬勃質(zhì)量控制的重要檢測方法，其麥角甾醇和麥角甾酮的含量也為今后白刺馬勃質(zhì)量標準的建立提供借鑒。