賈亞濤 鄧 飛 李紅飛 王艷波 姜鳳鳴

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科,吉林 長春 130021)

膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤，術(shù)后容易復(fù)發(fā)且預(yù)后較差。TSC1編碼的錯(cuò)構(gòu)瘤蛋白(hamartin)為腫瘤抑制基因，在細(xì)胞的生長、增殖、分化、遷移、凋亡等各方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)TSC1的編碼產(chǎn)物hamartin在膀胱癌的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮著極其重要的作用〔1〕。本實(shí)驗(yàn)擬分析TSC1在膀胱尿路上皮癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1一般材料 選取吉大一院泌尿外科2014年1月至2016年1月行經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)切除的病理切片51例，均經(jīng)病理證實(shí)為膀胱尿路上皮癌。其中男36例，女15例；年齡≤60歲19例，>60歲32例；腫瘤直徑≤3 cm 36例，>3 cm 15 例；病理分級(jí)(采用WHO2004年分級(jí)法)：低分級(jí)27例，高分級(jí)24例；臨床分期(采用國際抗癌協(xié)會(huì)2002年TNM分期法)：Ta-T1期：42例，T2期：9例。另取5例經(jīng)病理證實(shí)為正常膀胱組織的病理切片作為對(duì)照組，男3例，女2例，年齡≤60歲1例，>60歲4例。

1.2主要器材和試劑 主要器材：(1)石蠟切片機(jī)(上海華駿醫(yī)療器材有限公司)；(2)光學(xué)顯微鏡(上海點(diǎn)應(yīng)光學(xué)儀器有限公司)；(3)冰箱(廣東美的集團(tuán))；(4)自動(dòng)攝像顯微鏡(深圳奧斯微光學(xué)儀器有限公司)；(5)微波爐(廣東美的集團(tuán));(6)恒溫水浴箱(江蘇金環(huán)試驗(yàn)設(shè)備有限公司)；(7)10、100、1 000 μl微量加量器(上海高鴿工貿(mào)有限公司);(8)10、100、1 000 μl吸頭(上海晶安生物科技有限公司);(9)100.5 ml及1.5 ml EP管(上海百千生物科技有限公司)。主要試劑：(1)一抗兔來源TSC1抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；(2)SP免疫組化試劑盒(南京建成生物工程研究所)；(3)二甲苯(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；(4)乙醇(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；(5)無水甲醇(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；(6)30%過氧化氫(H2O2)(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；(7)蘇木精染液(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；(8)封片膠(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.3方法 (1)在石蠟標(biāo)本的最佳部位切3張厚度均為2 μm的切片，制成標(biāo)本。(2)用二甲苯常規(guī)對(duì)標(biāo)本脫蠟、入水和抗原修復(fù)。染色前用磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡10 min。(3)把標(biāo)本放入3%H2O2-甲醛中浸泡10 min，以便消除內(nèi)源性過氧化氫酶的作用。(4)用PBS沖洗3次，每次2 min。(5)加一滴試劑A于組織切片標(biāo)本上，孵育10 min。(6)倒掉或吸干液體。(7)每張切片加100 μl一抗，在4℃的濕盒內(nèi)過夜。(8)用PBS沖洗標(biāo)本3次，每次2 min。(9)加一滴試劑B于每張標(biāo)本上,孵育10 min。(10)用PBS洗標(biāo)本3次，每次2 min。(11)加一滴試劑C于每張切片,孵育10 min。(12)用PBS洗標(biāo)本3次，每次2 min。(13)加一滴上述二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液于每張組織切片標(biāo)本上，室溫下顯色2～5 min。 (14)用自來水充分沖洗。(15)蘇木素復(fù)染。(16)組織切片經(jīng)梯度酒精水干燥、透明、中性樹膠封片、鏡檢。

1.4結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) TSC1在胞質(zhì)中表達(dá)，呈棕黃色或棕褐色。根據(jù)陽性細(xì)胞的比例及著色程度進(jìn)行綜合評(píng)分，陽性細(xì)胞比例<30%為1分，30%～60%為2分，>60%為3分；細(xì)胞著色程度：無著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。根據(jù)陽性細(xì)胞比例和細(xì)胞著色程度的乘積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：0～1分為陰性，≥2分為陽性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1TSC1在膀胱癌及正常膀胱組織中的表達(dá) 在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)彌漫分布的棕褐色或棕黃色顆粒即為TSC1表達(dá)陽性，見圖1。在膀胱癌組織中，30例(58.8%)呈陰性表達(dá)；而在正常膀胱組織中，均見TSC1正常表達(dá)；兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.335,P=0.012)。

2.2TSC1 在膀胱癌組織的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 TSC1表達(dá)與臨床分期、病理分級(jí)有關(guān)(P<0.05)，與性別、年齡及腫瘤大小無關(guān)(P>0.05)。見表1。

2.3TSC1的表達(dá)與膀胱癌復(fù)發(fā)的關(guān)系 術(shù)后隨訪18～36個(gè)月，隨訪45例復(fù)發(fā)19例。在膀胱癌組織中，復(fù)發(fā)組TSC1陰性表達(dá)率〔14例(73.7%)〕明顯高于非復(fù)發(fā)組〔10例(38.5%)，P<0.05〕。

圖1 TSC1在膀胱尿路上皮癌組織中的表達(dá)(×400)

臨床病理特征n陰性表達(dá)(n=30)χ2值P值臨床分期 Ta-T1期4222(52.4)4.0780.043 T2期98(88.9)病理分級(jí) 低分級(jí)2712(44.4)4.8980.027 高分級(jí)2418(75.0)性別 男3621(55.3)0.120.912 女159(69.2)年齡 ≤60歲1911(57.9)0.110.917 >60歲3219(59.4)腫瘤大小 >3 cm159(60.0)0.120.912 ≤3 cm3621(58.3)

3 討 論

盡管約75%的膀胱癌患者在首次診斷時(shí)屬于早期腫瘤〔2，3〕，但50%～70%的膀胱癌患者會(huì)在術(shù)后1～2年內(nèi)復(fù)發(fā)，且20%的復(fù)發(fā)腫瘤最后會(huì)進(jìn)展為肌層浸潤性膀胱癌〔4〕。根據(jù)其復(fù)發(fā)和進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)，膀胱癌患者可分為低危、中危、高危人群〔5〕。研究發(fā)現(xiàn)，70%膀胱癌患者涉及某種特定基因的突變〔6〕，TSC1是與膀胱癌密切相關(guān)的腫瘤抑制基因〔7，8〕。TSC1基因發(fā)生突變導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物所編碼的hamartin截?cái)?翻譯的過程被提前終止，從而引起hamartin功能缺失或障礙,其穩(wěn)定馬鈴薯蛋白及防止其變性的功能減弱甚至消失,調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架過程的作用減弱,引起TOR不受調(diào)控和持續(xù)激活,對(duì)細(xì)胞周期的抑制作用隨之減弱,從而引起細(xì)胞異常黏附、生長及遷移,造成細(xì)胞的異常生長和過度增殖,最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Edwards等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)TSC1發(fā)生基因突變的膀胱癌患者會(huì)在更短的時(shí)間內(nèi)復(fù)發(fā)。hamartin表達(dá)減少或降低的膀胱癌患者其發(fā)生進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)也更高，Mhawech-Fauceglia等〔10〕發(fā)現(xiàn)hamartin通過上調(diào) p27 和14-3-3σ調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖過程參與膀胱癌的形成，從而推測(cè)hamartin可能用作預(yù)測(cè)膀胱癌的進(jìn)展新指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Edwards等〔9,10〕研究結(jié)果較為一致。TSC1基因參與細(xì)胞周期的調(diào)控,其編碼的hamartin在胰島素信號(hào)通路中是關(guān)鍵環(huán)節(jié),該通路在許多惡性腫瘤中異常激活,為此可為膀胱癌的有效治療提供新的靶點(diǎn)。定性定量的測(cè)定TSC1基因在膀胱癌組織的表達(dá)及突變情況,能夠?qū)ρ芯堪螂装┑陌l(fā)生、發(fā)展、治療、預(yù)后及轉(zhuǎn)歸提供重要的參考依據(jù)。