汪 王，蘇小霞，楊柳慧，周蘊(yùn)薇

(東北林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150000)

細(xì)葉百合(Liliumpumilum)是百合屬中分布最廣，緯度偏北的一種野生花卉，其花色艷麗，觀賞價(jià)值高，對(duì)鐮刀菌，葉枯病，鹽漬化，干旱和低溫具有較強(qiáng)的抗性，是百合抗性育種的重要親本[1]，同時(shí)鱗莖營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是食用、藥用和觀賞俱佳的草本植物。對(duì)其花發(fā)育基因的研究，是運(yùn)用分子生物學(xué)手段調(diào)控花期，實(shí)現(xiàn)促成栽培的基礎(chǔ)[2]。

目前，擬南芥是研究開花最為深入的模式植物，許多調(diào)控開花時(shí)間的基因都已經(jīng)克隆鑒定，如促進(jìn)開花的基因有AGAMOUS-LIKE20(AGL20)，AGAMOUS-LIKE24(AGL24)，SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS1(SOC1)，F(xiàn)LOWERINGLOCUST(FT)等[3-5],抑制開花的基因有FLOWERINGLOCUSC(FLC)，F(xiàn)LOWERINGLOCUSM(FLM)，F(xiàn)RIGIDA(FRI)等[6-8]。SHORTVEGETATIVEPHASE(SVP)屬于MADS-box轉(zhuǎn)錄因子家族一員，并且對(duì)開花具有抑制作用，它能整合自主途徑、春化途徑和赤霉素途徑開花信號(hào)，從而調(diào)控植物開花時(shí)間[9]。有文獻(xiàn)報(bào)道，在ga1-3突變體中SVP表達(dá)量較高，而在赤霉素處理后的野生型植物中表達(dá)量降低[10]，可見赤霉素途徑能負(fù)調(diào)節(jié)SVP。關(guān)于SVP對(duì)開花的調(diào)控機(jī)制，已有詳細(xì)報(bào)道。C.Jung[11]等通過(guò)免疫沉淀法和GST融合技術(shù)分別證實(shí)了擬南芥中2個(gè)開花信號(hào)整合子SVP和FLC在體內(nèi)和體外均能構(gòu)成蛋白復(fù)合物，J.H.Lee[12]等進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)SVP-FLC蛋白復(fù)合物能抑制FT及FT的靶基因SOC1的表達(dá)，且SVP通過(guò)直接結(jié)合FT序列中的CArG基序，負(fù)調(diào)控開花整合子FT，從而調(diào)控植物開花時(shí)間。SVP功能基因的研究，對(duì)花期調(diào)控具有重要意義。

本研究從MADS-box家族中克隆得到LpSVP基因，通過(guò)蛋白質(zhì)特性分析、同源蛋白聚類以及基因時(shí)空表達(dá)分析，初步闡明LpSVP的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究該基因功能和機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院苗圃引種的野生細(xì)葉百合。

1.2 細(xì)葉百合LpSVP總RNA提取與cDNA合成

總RNA的提取參照天根生化科技(北京)有限公司試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，并采用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的完整性和純度。參照PrimeScripTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)試劑盒說(shuō)明，以0.5 μg為模板，合成cDNA第1鏈。

1.3 細(xì)葉百合LpSVP基因克隆

從細(xì)葉百合轉(zhuǎn)錄組cDNA文庫(kù)中獲得該基因最大開放閱讀框(ORF),利用primer 5.0設(shè)計(jì)特異性上下游引物L(fēng)pSVP-F GTGGGTGGTGAGATCAGATG;LpSVP-R ATAGGGTAATTGCTGGACAT。以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，參照KOD-Plus-Neo說(shuō)明書克隆基因，反應(yīng)體系為25 μL，包括distilled water 16 μL，10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 2.5 μL，2 mmol·L-1dNTPs 2.5 μL，25 mmol·L-1MgSO4 1.5 μL，上下游引物各0.75 μL，cDNA 0.5 μL，KOD-Plus-Neo 0.5 μL。采用三步法按如下反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增：預(yù)變性94℃ 2 min；變性98℃ 10 sec，退火65～0.5℃/cycle 30 sec，延伸68℃ 1 min，40循環(huán)；最終延伸72℃ 10 min ；4℃ forever。對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段，與PMD18-T載體過(guò)夜連接[13]，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并挑取單菌落PCR驗(yàn)證后過(guò)夜搖菌，送往生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 細(xì)葉百合LpSVP基因序列及其蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

對(duì)測(cè)序結(jié)果與細(xì)葉百合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的SVP序列進(jìn)行比對(duì)，利用NCBI在線軟件Conserved Domains Search Service(CD Search)預(yù)測(cè)基因保守結(jié)構(gòu)域，并利用BlastX[14]進(jìn)行同源比對(duì)，利用DNAMAN[15]軟件推測(cè)基因編碼的氨基酸序列，并進(jìn)行多序列比對(duì)，利用MEGA 5.0[14]構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，利用ProtParam[16]預(yù)測(cè)氨基酸理化性質(zhì)，利用TMHMM[16]預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域，利用SignaIP[16]預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽，利用ProtScale[16]預(yù)測(cè)蛋白親/疏水性，利用WOLF PSORT[16]進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，利用GOR4[16]預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用SWISS-MODEL[16]對(duì)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)建模分析。

1.5 細(xì)葉百合LpSVP基因時(shí)空表達(dá)特性分析

以lilyActin[17](GenBank 登錄號(hào)：JX826390)基因作為內(nèi)參，Rever Tra Ace?qPCR RT Kit反轉(zhuǎn)錄開花五個(gè)時(shí)期(花蕾Ⅰ期，花蕾Ⅱ期，花蕾Ⅲ期，花蕾末期和盛開期)總RNA，所得cDNA稀釋5倍作為熒光定量模板，采用SYBR Green在Roche LightCycler96上進(jìn)行如下反應(yīng)：預(yù)變性(95℃ for 30 s)；3步法(95℃ for 5 s；60℃ for 15 s；72℃ for 30 s；40 cycles )；溶解(95℃ for 10 s；65℃ for 60 s；97℃ for 1 s)；冷卻(37℃ for 30 s)。并利用2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，分析LpSVP基因?qū)ú煌l(fā)育時(shí)期的調(diào)控作用。同時(shí)提取葉片、花瓣、雄蕊、雌蕊、鱗莖總RNA，RT-PCR分析LpSVP基因組織特異性表達(dá)[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)葉百合LpSVP基因的克隆

采用試劑盒提取的RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，完整性好，28S大約為18S的2倍，D260/D280介于1.8～2.0，通過(guò)特異性擴(kuò)增后得到目的片段，測(cè)序后的拼接序列與轉(zhuǎn)錄組原始序列ORF比對(duì)吻合。該編碼區(qū)大小為675 bp,預(yù)測(cè)編碼224個(gè)氨基酸(圖1)，具有高度保守的MADS區(qū)和半保守的K區(qū)(圖2)，分別位于核苷酸序列的第4～234和第241～507處，屬于MADS-box基因家族。基因登錄號(hào)為MF693882。

圖1 LpSVP的cDNA及其推測(cè)的氨基酸序列

2.2 細(xì)葉百合LpSVP序列同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

在NCBI上通過(guò)BLASTX對(duì)LpSVP序列進(jìn)行同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該序列與臺(tái)灣百合和麝香百合雜交品種(Liliumformosanum×Liliumlongiflorum)的SVP蛋白具有最高同源性，同源性達(dá)到99%，與荷花(Nelumbonucifera)、橡膠樹(Heveabrasiliensis)、葡萄(Vitisvinifera)、咖啡樹(Coffeaarabica)、獼猴桃(Actinidiachinensis)、芝麻(Sesamumindicum)、木薯(Manihotesculenta)SVP蛋白也具有較高的同源性，分別達(dá)到66%、67%、67%、67%、66%、66%、67%，并將LpSVP推測(cè)的氨基酸序列與這些物種的SVP蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)，一致性達(dá)到76.39%(圖3)。

為進(jìn)一步確定LpSVP進(jìn)化關(guān)系，根據(jù)前人將擬南芥中MADS-box基因家族分成AGL15-like、AG、AGLClike、APl/FUL/CAL、SVP、SOC1、TT16、AP3 /PI、ANR1、FLC/MAF、AGLl2-like、SEP等12個(gè)進(jìn)化枝構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[19]，結(jié)果顯示LpSVP基因與SVP聚為一類(圖4)，從細(xì)葉百合中克隆得到的基因?qū)儆贛ADS-box中的SVP亞家族，命名為L(zhǎng)pSVP。

2.3 細(xì)葉百合LpSVP蛋白特性分析

2.3.1 氨基酸理化性質(zhì)分析 利用ProtParam[16]軟件分析顯示，LpSVP蛋白編碼224個(gè)氨基酸，分子量為25.783 ku，理論等電點(diǎn)為5.62，分子式為C1112H1830N326O362S7，正負(fù)電荷殘基總數(shù)分別為33和37，表示其在中性環(huán)境中帶負(fù)電荷，其中谷氨酸含量最高，占12.1%，其次為亮氨酸(9.4%)和絲胺酸(8.9%)。

2.3.2 蛋白質(zhì)親/疏水性預(yù)測(cè) 利用ProtScale[16]預(yù)測(cè)蛋白的親/疏水性，顯示LpSVP蛋白在第165和第208位氨基酸殘基處親水性最強(qiáng)，最低值為-2.611；在第47位氨基酸殘基處疏水性最強(qiáng)，最高為2.189，位于親水區(qū)的蛋白占絕大多數(shù)，表明LpSVP蛋白為親水蛋白。

2.3.3 蛋白質(zhì)信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) 信號(hào)肽是位于分泌蛋白的N端由15～30個(gè)氨基酸組成短肽鏈，指導(dǎo)分泌蛋白合成并在完成功能后被切除[20]。經(jīng)預(yù)測(cè)LpSVP蛋白不含有信號(hào)肽，為非分泌性蛋白。

利用TMHMM[16]對(duì)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，LpSVP肽鏈位于膜外，推測(cè)其可能沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于非跨膜蛋白。LpSVP發(fā)揮功能的部位可能在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中。

亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示LpSVP位于細(xì)胞核可能性為87.0 %，位于線粒體可能性為13.0 %，推測(cè)LpSVP蛋白可能定位在細(xì)胞核中，具體位置有待后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步證明。

2.3.4 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 蛋白質(zhì)多肽鏈通常盤曲和折疊成較為穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，以進(jìn)一步完成活性功能域構(gòu)象的構(gòu)建，從而完成特定的生命活動(dòng)。預(yù)測(cè)顯示LpSVP蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)有大量的a-螺旋136個(gè)(60.71%)，可能位于第6～39、62～69、83～132、136～141、143～173、200～206氨基酸殘基處；隨機(jī)卷曲65個(gè)(29.02%)，可能位于第1～5、40～42、49～53、56～61、70～82、133～135、142、174～178、185～199、207～214、224氨基酸殘基處；延伸鏈23個(gè)(10.27%)，可能位于第43～48、54～55、179～184、215～223氨基酸殘基處，總體上LpSVP蛋白為a-螺旋結(jié)構(gòu)。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)蛋白以同型四聚體形式存在。

圖2 LpSVP的保守結(jié)構(gòu)域分析

注：APY23912.1：百合，XP_010254525.1：荷花，XP_021662492.1：橡膠樹，XP_019073897.1：葡萄，AHW58026.1：咖啡樹，AFA37967.1：獼猴桃，XP_020554864.1：芝麻，XP_021631111.1：木薯。

2.4 細(xì)葉百合LpSVP時(shí)空表達(dá)特性分析

2.4.1 細(xì)葉百合LpSVP在花發(fā)育過(guò)程中定量表達(dá)分析 選取細(xì)葉百合花發(fā)育5個(gè)階段，即花蕾Ⅰ期、花蕾Ⅱ期、花蕾Ⅲ期、花蕾末期和盛開期(圖5A)進(jìn)行qRT-PCR分析。LpSVP基因在花發(fā)育過(guò)程中表達(dá)量呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì)，在花蕾Ⅱ期表達(dá)量達(dá)到最大值，而后表達(dá)量一直下降，并在盛開期表達(dá)量降為最低(圖5B)。

2.4.2 細(xì)葉百合LpSVP組織特異性表達(dá)分析 為進(jìn)一步分析LpSVP在細(xì)葉百合不同部位的表達(dá)情況，提取鱗莖、葉片、花瓣、雄蕊、雌蕊各個(gè)組織RNA進(jìn)行RT-PCR分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LpSVP基因在各個(gè)組織中都有表達(dá)，但表達(dá)量相對(duì)有差異，表達(dá)量從高到低分別為葉片、鱗莖、雄蕊、雌蕊、花瓣(圖6)。

3 結(jié)論與討論

在MADS-box轉(zhuǎn)錄因子家族中，SVP和AGL24具有最近的親緣關(guān)系，兩者同屬于STMADS11亞家族[21]，但它們對(duì)花發(fā)育具有完全相反的調(diào)控作用，AGL24促進(jìn)開花[4]，而SVP則抑制開花[9]，在花發(fā)育早期和AP1、CAL共同決定花分生組織的特異性[22]，且SVP和AP1，AGL24直接抑制B類和C類花同源基因的表達(dá)，從而抑制成花轉(zhuǎn)變過(guò)程[22]。通過(guò)對(duì)細(xì)葉百合花發(fā)育過(guò)程定量表達(dá)分析，我們發(fā)現(xiàn)，從花蕾Ⅰ期到花蕾Ⅱ期LpSVP表達(dá)量顯著增加，而從花蕾Ⅱ期到花蕾Ⅲ期，其表達(dá)量顯著降低，表明它對(duì)此3個(gè)階段的成花轉(zhuǎn)變具有重要調(diào)控作用，且在花蕾Ⅱ期所行使的調(diào)控作用與其他幾個(gè)花發(fā)育階段相反。Li[23]等研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥SVP-41突變體表現(xiàn)為早花型，而在突變體中導(dǎo)入枳PtSVP基因后，開花時(shí)間則推遲，J.H.Lee[24]等通過(guò)將大白菜BcSVP基因與擬南芥AtSVP啟動(dòng)子結(jié)合后轉(zhuǎn)入擬南芥SVP突變體中也有類似發(fā)現(xiàn)，說(shuō)明SVP在植物體內(nèi)功能保守，且對(duì)開花時(shí)間延遲具有重要調(diào)控作用。自花蕾Ⅱ期后，LpSVP表達(dá)量一直降低，并在花朵發(fā)育完全(盛開期)時(shí)表達(dá)量最低，以減弱對(duì)花發(fā)育的抑制作用，響應(yīng)植物開花進(jìn)程。因此，在正常植物的花分生組織中必定存在抑制SVP過(guò)量表達(dá)的某種機(jī)制[25]，從而維持植株正常的開花時(shí)間。

圖4 LpSVP蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

注：a:花蕾Ⅰ期; b:花蕾Ⅱ期; c:花蕾Ⅲ期; d:花蕾末期; e:盛開期。

圖6 LpSVP組織特異性分析

有研究表明，MADS-box在不同物種中會(huì)有不同程度的亞功能化和新功能化[26]。野生型擬南芥中，SVP基因在營(yíng)養(yǎng)組織中表達(dá)量相似，在花原基中表達(dá)，但在花中不表達(dá)[9]。葡萄中SVP基因在營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官中都表達(dá)，但在花中表達(dá)量相對(duì)較低[15]。Wu[27]等對(duì)獼猴桃時(shí)空表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，SVP基因僅在營(yíng)養(yǎng)器官中表達(dá)，在花朵中并不表達(dá)。通過(guò)半定量分析發(fā)現(xiàn)，LpSVP在各個(gè)組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量有強(qiáng)弱差異，從高到低依次為葉片、鱗莖、雄蕊、雌蕊、花瓣，這與前人的研究存在差異。不同物種、不同個(gè)體，甚至同一個(gè)體不同組織器官或不同SVP類基因，功能都有很大差異性，SVP基因既有保守性又有多樣性[15]。

開花抑制基因突變體表現(xiàn)為早花型[9]，細(xì)葉百合LpSVP基因的克隆，為探討SVP類基因?qū)òl(fā)育分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為采用基因工程實(shí)現(xiàn)促成栽培和花期調(diào)控提供理論指導(dǎo)。