張靖雯，姜在民，蔡 靖*

(1.西北農(nóng)林科技大學 林學院，陜西 楊陵 712100；2.西北農(nóng)林科技大學 生命科學學院，陜西 楊陵 712100)

葉綠體是植物進行光合作用的細胞器，具有自主遺傳信息，是植物細胞遺傳的重要單位。高等植物的葉綠體DNA(chloroplast DNA,cpDNA)，一般長120～160 kb，多數(shù)為雙鏈共價閉合環(huán)狀分子，極少數(shù)為線狀[1]，葉綠體基因組結(jié)構(gòu)由長單拷貝序列(long single copy sequence,LSC)，短單拷貝序列(short single copy sequence,SSC)和2個反向重復序列(inverted repeat sequence A/B,IRA/IRB)組成，IRA和IRB編碼相同，方向相反，被LSC和SSC隔開。被子植物葉綠體基因組序列高度保守，且屬于母系遺傳，具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單，進化速率低、多拷貝[2]等多方面優(yōu)點。目前已在遺傳結(jié)構(gòu)分析[3]、分子標記[4]、起源進化[5]、核質(zhì)互作和葉綠體基因工程[6]等方面展開了廣泛研究，且葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)在遺傳改良、生物制劑的生產(chǎn)等方面顯示出巨大潛力[7]，已成為植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)又一新的研究目標[8]，而獲得高質(zhì)量的cpDNA是展開后續(xù)基因分子水平研究的必要條件。

相對于較成熟的基因組DNA提取方法而言，cpDNA的提取存在很大障礙，主要是由于物種之間差異性較大，核DNA的污染等。目前，關(guān)于葉綠體基因組的提取方法有很多，但是提取效率依然較低，不同植物提取葉綠體基因組的難易程度也各不相同。目前國內(nèi)外對丁香屬植物葉綠體基因組的研究較少，而提取出高質(zhì)量的cpDNA是很多相關(guān)研究的關(guān)鍵所在。因此，本研究以現(xiàn)有的cpDNA提取方法為基礎(chǔ)，建立適用于丁香屬植物的cpDNA的提取方法體系，這對丁香屬植物葉綠體基因組的進一步研究有重大意義。

丁香屬(Syringa)植物為木犀科(Oleaceae)多年生灌木或小喬木，是本科著名的觀花植物[9]，由于生境多樣、適應(yīng)性廣、觀賞性狀獨特而深受世界人民的喜愛,現(xiàn)已有近千年的栽培歷史[10]。本試驗所選取的植物材料紫丁香(Syringaoblata)和羽葉丁香(Syringapinnatifolia)分別為丁香屬的廣布種和瀕危物種。紫丁香作為中國三北地區(qū)的廣布種，廣泛地應(yīng)用于園林綠化當中，具有較高的觀賞價值。羽葉丁香是我國三級瀕危保護種，且具有較高的藥用及觀賞價值，是丁香屬中唯一具有羽狀復葉性狀的物種，對于研究丁香屬的親緣關(guān)系、系統(tǒng)發(fā)育、地理分布等，都具有重要的科學意義。研究丁香屬植物cpDNA的提取方法，并利用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)，探究丁香屬植物間的遺傳多樣性、親緣關(guān)系和起源進化，對今后科學利用丁香種質(zhì)資源有重要指導意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及預處理

試驗材料為紫丁香與羽葉丁香的成熟葉片，紫丁香葉片采自西北農(nóng)林科技大學南校區(qū)丁香園，羽葉丁香葉片采自西北農(nóng)林科技大學羽葉丁香種質(zhì)資源圃。于2017年5月分別摘取2種植物新鮮葉片30～40 g，清水洗3遍，擦干，紗布包裹，置于4℃冰箱饑餓處理12～24 h。

1.2 方法

1.2.1 高鹽-低pH法 參考C.Shi[11]等的方法。

1.2.2 改良的高鹽-低pH法 參考K.Diekmann[12]、劉娟[13]、陳春梅[14]等的方法，并進行改進。

1.2.2.1 葉綠體分離 所有試驗步驟均在冰上進行，玻璃器皿、離心管等提前預冷處理。

1) 勻漿：將葉片剪成1 cm長短，放入勻漿機(用小型榨汁機代替)，倒入400 mL預冷的緩沖液A(20 mmol/L EDTA-Na2，50 mmol/L Tris，1.25 mol/L NaCl，0.25 mol/L 抗壞血酸，1 mmol/L DTT，0.1%BSA，pH=3.6；抗壞血酸，BSA，DTT現(xiàn)用現(xiàn)加)，低速勻漿10 s，2次，高速勻漿10 s，3次。

2) 過濾：將勻漿液用4層無菌紗布過濾。

3) 去除細胞殘?。哼^濾后用50 mL離心管分裝濾液，1 000 r/min，4℃，離心5 min，棄沉淀，重復1次。

4) 粗提：將上清4 000 r/min，4℃，離心10 min，棄上清。

5) 純化：沉淀中加入25 mL預冷的緩沖液B(20 mmol/L EDTA-Na2，50 mmol/L Tris，1.25 mol/L NaCl，1 mmol/L DTT，0.1%BSA；BSA，DTT現(xiàn)用現(xiàn)加)，用無菌軟毛刷懸浮沉淀，4 000 r/min，4℃，離心10 min，棄上清，重復1次。

6) 再純化：沉淀加入5 mL預冷的緩沖液C(40 mmol/L蔗糖，50 mmol/L Tris，0.1%BSA；BSA現(xiàn)用現(xiàn)加)，用無菌軟毛刷懸浮沉淀，4 000 r/min，4℃，離心10 min，棄上清。所得沉淀為純化的葉綠體，用顯微鏡鏡檢葉綠體的完整性。

1.2.2.2 葉綠體裂解，cpDNA的分離純化

1) 裂解：純化葉綠體加入2 mL緩沖液D(50 mmol/L EDTA-Na2，100 mmol/L Tris，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L DTT；DTT現(xiàn)用現(xiàn)加)，0.5 mL 20% SDS,10 μL蛋白酶K，55℃水浴3 h，使葉綠體裂解，釋放出cpDNA。裂解結(jié)束后加入0.5 mL 5 mol/L KAc，冰浴20 min。

2) 抽提：加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，輕柔顛倒混勻，12 000 r/min，4℃，離心10 min，離心后，小心吸取上清液，重復1次。

3) 再抽提：加入等體積氯仿，輕柔顛倒混勻，12 000 r/min，4℃，離心10 min，小心吸取上清液。

4) 沉淀DNA：上清液加入等體積的異丙醇，-20℃，沉淀3 h，12 000 r/min，4℃，離心15 min，收集沉淀，70%乙醇清洗2次，無水乙醇清洗1次，自然揮發(fā)乙醇。

5) 除RNA除蛋白：沉淀加入0.5 mL 1×TE緩沖液，加入2.5 μL RNase(10 mg/mL)，37℃水浴1 h，再加入2.5 μL蛋白酶K(10 mg/mL)，37℃水浴1 h。

6) 沉淀DNA：加入1/10體積NaAc(3 mol/L)和兩倍體積的無水乙醇沉淀過夜，12 000 r/min，4℃，離心15 min，收集沉淀，70%乙醇清洗2次，無水乙醇清洗1次，自然揮發(fā)乙醇。

7) 溶解DNA：加入50 μL 1×TE緩沖液溶解DNA，得到cpDNA溶液，-20℃保存，長期保存需放入-80℃超低溫冰箱。

1.3 葉綠體鏡檢

取2 mL緩沖液D懸浮葉綠體沉淀，制作臨時裝片，在Leica DM4000B熒光顯微鏡下觀察葉綠體的完整性。

1.4 cpDNA檢測

1.4.1 cpDNA質(zhì)量檢測 取1 μL cpDNA溶液，在Nano Drop 2000C超微量分光光度計上測量核酸含量，用1×TE作空白對照，記錄OD260nm/OD280nm值、OD260nm/OD230nm值及質(zhì)量濃度。質(zhì)量高的DNA的OD260nm/OD280nm值在1.8～1.9，>1.9表明樣品存在RNA污染，<1.7表明樣品存在蛋白質(zhì)、酚類污染；純DNA的OD260nm/OD230nm值為2.5，<2.0表明樣品存在糖類、鹽類或有機溶劑污染，需純化。

1.4.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測 取4 μL cpDNA溶液，加0.8 μL DNA loading buffer混勻，使用bio-rad Power pac Universal電泳儀，在0.5%瓊脂糖凝膠中電泳，上樣量為4 μL，電泳緩沖液為1×TAE，電壓為120 V，電泳30 min，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下檢測蛋白是否除干凈、RNA是否除徹底、cpDNA的完整性。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁香葉綠體完整性檢測

采用高鹽-低pH法(方法Ⅰ)和改良高鹽-低pH法(方法Ⅱ)，分別得到了紫丁香(Z)和羽葉丁香(Y)的葉綠體。對比圖1可發(fā)現(xiàn)，方法Ⅱ所得的葉綠體沉淀更多；對比圖2鏡檢結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，方法Ⅱ分離的葉綠體濃度高、數(shù)量多、雜質(zhì)少、背景清晰，說明改良高鹽-低pH法更適合丁香葉綠體的分離。

注：Ⅰ、Ⅱ分別代表高鹽-低pH法和改良高鹽-低pH法，Z、Y分別代表紫丁香和羽葉丁香。下同。

2.2 丁香cpDNA質(zhì)量檢測

由表1的紫外分析結(jié)果可知，2種提取方法所得的cpDNA的各項質(zhì)量指標差異顯著，方法Ⅰ所提取的紫丁香與羽葉丁香的cpDNA質(zhì)量濃度僅為64.1 ng/μL和171.6 ng/μL，OD260/OD280值分別為1.32和1.29，均<1.7，表明樣品存在蛋白、酚的污染，OD260/OD230值分別為1.34和1.00，均<2.0，表明樣品存在被糖類、鹽類或有機溶劑污染，不能滿足后續(xù)的測序要求以及葉綠體基因組的深入研究。方法Ⅱ所提取的紫丁香與羽葉丁香的cpDNA質(zhì)量濃度分別為650.1 ng/μL和330.3 ng/μL，OD260/OD280值分別為1.86和1.88，在純凈的DNA比值1.8～1.9，OD260/OD230值分別為2.35和2.58，大于衡量DNA純凈比值2.0，表明方法Ⅱ所提取的DNA質(zhì)量好，濃度和純度高，不存在蛋白、酚類、鹽以及有機溶劑等的污染。上述結(jié)果表明改良的高鹽-低pH法適合丁香葉綠體cpDNA的提取，能夠滿足后續(xù)的測序要求以及葉綠體基因組的深入研究。

2.3 丁香cpDNA電泳檢測

由圖3的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可知，方法Ⅰ所提取的cpDNA無明顯條帶，而方法Ⅱ所提取的cpDNA條帶清晰，明亮，整齊一致，無降解現(xiàn)象，無RNA、蛋白、鹽等雜質(zhì)的污染，所得cpDNA純度較高，質(zhì)量好。

圖2 高鹽-低pH法(Ⅰ)和改良高鹽-低pH法(Ⅱ)分離的葉綠體鏡檢比較Fig.2 Comparison of chloroplast microscopy seperated by the high-salt low-pH method (Ⅰ) and the modified high-salt low-pH method (Ⅱ)

表1 2種方法提取的cpDNA紫外分析結(jié)果Table 1 UV scanning results of cpDNA extracted by two methods

注：M代表5 000 DNA Ladder Marker。

3 結(jié)論與討論

獲得高質(zhì)量、高純度的cpDNA樣品，是后續(xù)基因分子水平研究的前提條件。cpDNA提取的關(guān)鍵是去除葉綠體膜外的核DNA與線粒體DNA污染。高鹽-低pH法分離葉綠體的原理是通過葉片在高速勻漿過程中，產(chǎn)生大量靜電,核DNA被組蛋白包裹帶正電,緊緊地被吸附在帶負電的葉綠體膜上，而在高鹽介質(zhì)環(huán)境中由于電子屏蔽作用，這種靜電作用被減弱,因此可以通過不同pH值的高鹽緩沖液反復洗滌，以達到去除吸附的核DNA的目的[15]，而由于線粒體與葉綠體差別較大,通過差速離心就可分離。其他關(guān)于cpDNA的提取方法主要有DNaseⅠ法[16]、蔗糖密度梯度離心法[17]、percoll密度梯度離心法[18]、氯化銫密度梯度離心法[19]等。DNaseⅠ法利用DNaseⅠ消化膜外的DNA，以達到消除核DNA以及線粒體DNA污染的目的，但經(jīng)過勻漿和多次離心后，葉綠體膜難以保持完整，使得膜內(nèi)的cpDNA也被消化掉，cpDNA得率低[15]；蔗糖密度梯度離心法無法將完整的葉綠體與破碎的葉綠體分離，密度梯度液不易保持，對離心機等設(shè)備要求高，分離效果不理想；氯化銫密度梯度離心法主要用于草本植物cpDNA的提取，且其成本高、耗時長、得率低、對設(shè)備要求也較高，一般實驗室難以采用[20]；percoll密度梯度離心法雖可較簡便地分離提取cpDNA，但所提取的cpDNA得率較低，且percoll分離液的價格偏高。因此，這幾種方法均無法簡便高效地提取植物cpDNA。

本研究采用了高鹽-低pH法[11]和改良的高鹽-低pH法[12-14]，分別提取了紫丁香與羽葉丁香的cpDNA。C.Shi[11]的高鹽-低pH法已成功提取了葡萄[21]、無患子[22]、三葉青[22]、棗[23]等植物的cpDNA,但此方法并不適合丁香cpDNA的提取，經(jīng)紫外分光光度計檢測，所提取的紫丁香與羽葉丁香cpDNA的OD260/OD280<1.7，OD260/OD230<2.0，且質(zhì)量濃度較低，表明提取的cpDNA純度低，含有蛋白、酚類、鹽以及有機溶劑等的污染，瓊脂糖凝膠電泳也發(fā)現(xiàn)并無條帶，表明所提取的cpDNA含量小，濃度低，結(jié)果證明C.Shi[11]的高鹽-低pH法并不適合丁香cpDNA的提取，分析可能是C.Shi[11]的高鹽-低pH法在葉綠體分離過程中，離心時間過長，是本研究改進的高鹽-低pH法分離葉綠體離心時間的兩倍，因此導致葉綠體活性大幅降低；葉綠體裂解時間過長，導致基因組DNA片段斷裂，使得最終提取結(jié)果cpDNA的質(zhì)量、濃度都達不到要求。之后采取K.Diekmann[12]、劉娟[13]、陳春梅[14]等的方法進行組合，并根據(jù)丁香的特性加以改進，形成改良的高鹽-低pH法，所提取的紫丁香與羽葉丁香的cpDNA的OD260/OD280值在1.8～1.9，OD260/OD230值接近2.5，且質(zhì)量濃度分別高達650.1 ng/μL和330.3 ng/μL，表明提取的cpDNA質(zhì)量好、純度高，瓊脂糖凝膠電泳顯示條帶清晰、明亮，無降解現(xiàn)象，結(jié)果證明改良后的高鹽-低pH法適合紫丁香與羽葉丁香cpDNA的提取。本研究在高鹽-低pH法的基礎(chǔ)上，做了如下改進：提取前，將新鮮葉片放入4℃冰箱，將饑餓處理時間減少到12～24 h，去除葉片中的淀粉等糖類物質(zhì)，減少糖類物質(zhì)對后續(xù)提取工作的影響；由于葉綠體離體后活力會迅速下降，所以葉綠體分離過程要快，本試驗開始采用研缽進行手工研磨，發(fā)現(xiàn)手工研磨會使葉片研磨不徹底，費時費力且導致葉綠體活性下降嚴重，因此采用勻漿機代替手工研磨勻漿，減少勻漿時間，避免葉綠體離體時間過長導致的活力下降，并采用短時多次的勻漿方法，避免勻漿機發(fā)熱，破壞葉綠體被膜；用DTT(二硫蘇糖醇)代替β-巰基乙醇作為還原劑，DTT具有比β-巰基乙醇更低的毒性和更小刺激性的氣味，且其抗氧化性是β-巰基乙醇的7倍，能更有效組織酚類物質(zhì)的氧化，并進一步提高葉綠體完整性；增加了氯仿抽提，是因為酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)抽提后，會有酚污染殘留，由于酚易溶于氯仿中，因此增加氯仿抽提，以達到進一步排除酚污染的目的；試驗最后再次加入少量蛋白酶K，37℃水浴1 h，以達到進一步去除蛋白殘留的目的；在使用RNase和蛋白酶K處理了cpDNA溶液后，再次進行酒精沉淀洗滌cpDNA，是為了減少所得cpDNA溶液中的其他雜質(zhì)，提高所得cpDNA質(zhì)量。

本研究改良的高鹽-低pH法可較快速簡單地提取丁香cpDNA，所提取的cpDNA可用于葉綠體基因組分子水平的后續(xù)研究。此提取方法對實驗室儀器設(shè)備要求不高，操作簡便、成本低，可為木本植物cpDNA的提取提供參考。