王 巍，易 軍，唐 慧，方東輝，甘 佳，石 溢，王 淮，付茂忠

（四川省畜牧科學(xué)研究院，動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610066）

基因組印記（Genomic imprinting），又稱為遺傳印記（Genetic imprinting），是指在配子期或者合子期，父源和母源的等位基因或染色體進(jìn)行特異性的修飾，并產(chǎn)生具有不同表達(dá)活性等位基因的一種由單親傳遞遺傳信息的特殊遺傳現(xiàn)象，且該現(xiàn)象不遵從孟德?tīng)柖桑?-2］。具有這種現(xiàn)象的基因稱為印記基因（Imprinted gene），絕大多數(shù)的印記基因都是成簇存在的，每個(gè)簇都包括若干能夠翻譯成蛋白的基因和一個(gè)非編碼RNA（ncRNA）組成。在印記簇中基因的表達(dá)或沉默是由印記控制區(qū)（Imprinting control regions，ICRs），通過(guò)順式作用來(lái)調(diào)控的［3］，ICRs的本質(zhì)是一段差異甲基化區(qū)域（Differentially methylated regions，DMRs），它的調(diào)控作用可以覆蓋很長(zhǎng)的染色體區(qū)域。ICR在生殖細(xì)胞中即發(fā)生了特定的印記，以便調(diào)控整個(gè)基因簇的基因沉默情況［4］。因此基因簇可以分為2種，即在卵母細(xì)胞發(fā)生過(guò)程中進(jìn)行修飾產(chǎn)生的母源印記以及在精子發(fā)生過(guò)程中進(jìn)行修飾產(chǎn)生的父源印記［5-6］。

IGF2/H19基因簇為父源印記基因簇，包括2個(gè)父源表達(dá)的基因 IGF2 和 INS 還包括 1 個(gè) ncRNA（H19）［7］。該簇包括4個(gè)甲基化印記區(qū)（DMR），其中DMR1和DMR2分別定位在IGF2的啟動(dòng)子和外顯子6上，呈父源印記［8］；DMR0定位在 IGF2的外顯子 U1上，呈母源印記狀態(tài)［9］；H19-DMD定位在H19轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)以前2 kb左右的區(qū)域內(nèi)，呈父源印記狀態(tài)［10］。敲除H19-DMD會(huì)導(dǎo)致H19基因表達(dá)上調(diào)和IGF2基因的表達(dá)抑制，該印記區(qū)為基因簇的 ICR［11］。

印記區(qū)作為一種反應(yīng)甲基化動(dòng)態(tài)模式的標(biāo)記，已經(jīng)成為基礎(chǔ)理論研究的焦點(diǎn)。因此，選擇父源印記區(qū)作為標(biāo)簽，通過(guò)甲基化測(cè)序手段檢測(cè)克隆動(dòng)物早期胚胎中這些印記區(qū)的甲基化水平，可以直觀地反映克隆胚中父源染色體的甲基化模式，對(duì)于提高克隆胚胎的成功率具有重要的理論指導(dǎo)意義。

1 材料

1.1 試驗(yàn)樣本

處于配子期（受精后8 h或激活后5 h）、S期、2-cell期、8-cell期和桑葚期的牛體外受精（IVF）胚胎和體細(xì)胞核移植（SCNT）胚胎各40枚，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物遺傳育種與繁殖實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 總DNA的亞硫酸鹽變性及DNA提取

按照全細(xì)胞亞硫酸鹽DNA甲基化修飾試劑盒（Epigentek）的操作說(shuō)明，取20 μL的樣品進(jìn)行DNA的亞硫酸鹽變性及提取。提取的DNA可立刻使用或存儲(chǔ)在-20℃下以便以后使用。

1.3 引物設(shè)計(jì)

試驗(yàn)分別選取IGF2/H19基因簇的ICR區(qū)為主要研究對(duì)象。根據(jù)NCBI網(wǎng)站上公布的牛H19基因序列查找其啟動(dòng)子序列，使用methyl primer express software v1.0引物設(shè)計(jì)軟件分別在2個(gè)基因的啟動(dòng)子內(nèi)選取1個(gè)CPG島設(shè)計(jì)引物，用于BSP測(cè)序。引物設(shè)計(jì)情況見(jiàn)圖1。

圖1 H19啟動(dòng)子區(qū)選取擴(kuò)增片段

1.4 目標(biāo)片段的克隆

參照天根生化科技（北京）有限公司MasterMix PCR試劑盒的使用說(shuō)明，在2×25 μL應(yīng)體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)，條件如下：94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 45 s，退火 45 s，72℃延伸 45 s，38個(gè)循環(huán)；72℃作用 10 min。

1.5 目標(biāo)片段的擴(kuò)增

用干凈的手術(shù)刀割下含有要回收DNA片段的瓊脂糖凝膠，放入1.5mL離心管中。采用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒（上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），按照說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行膠回收?；厥盏腄NA通過(guò)pMD19-T載體（大連寶生物公司）進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物均勻加入到30 μL的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min；42℃水浴熱激45 s，然后立即冰上放置冰浴1 min；每管中加入900 μL的LB肉湯培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)2 h，使細(xì)菌復(fù)蘇，并表達(dá)對(duì)抗生素的抗性；然后涂布于含Amp的LB瓊脂平板中，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。

1.6 菌落PCR鑒定

挑選平板上的單個(gè)菌落，接種于含Amp的LB肉湯中培養(yǎng)過(guò)夜，用菌液作PCR模板進(jìn)行菌落PCR鑒定，挑選3個(gè)基因（SCNT和IVF兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組）各個(gè)時(shí)間階段的12～15個(gè)陽(yáng)性克隆后送上海英俊公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用BIQ甲基化分析軟件對(duì)獲得序列的甲基化程度進(jìn)行計(jì)算。使用SPSS統(tǒng)計(jì)分析各處理組相對(duì)表達(dá)量，以P＜0.05和P＜0.01為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。IVF與SCNT兩種胚胎間不同胚胎發(fā)育階段比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)基因擴(kuò)增結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，在250 bp至500 bp之間接近250 bp處出現(xiàn)目的條帶，與目的片段的長(zhǎng)度相符。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

2.2 H19-IGF2基因簇ICR區(qū)在早期胚胎發(fā)育期中的印記模式

各個(gè)發(fā)育階段的IVF胚胎和SCNT胚胎中，H19基因啟動(dòng)子的甲基化測(cè)序結(jié)果，見(jiàn)表1。

由表1可知，H19-IGF2基因簇ICR區(qū)甲基化水平在IVF組和SCNT組早期胚胎中的變化趨勢(shì)相同，均為2-cell期之前呈下降趨勢(shì)，在2-cell達(dá)到甲基化的最低點(diǎn)，8-cell甲基化值開(kāi)始回升。IVF胚胎S期較配子期的甲基化水平下降較大，差異顯著（P＜0.05），與2-cell期的甲基化水平差異不顯著（P＞0.05）。SCNT胚胎的甲基化水平在這3個(gè)階段均差異不顯著（P＞0.05）。SCNT胚胎的甲基化水平在早期胚胎發(fā)育的各個(gè)階段均高于IVF的，2-cell和8-cell兩組的甲基化水平差異顯著（P＜0.05），其他各階段差異均不顯著（P ＞0.05）。

表1 H19-IGF2基因簇ICR區(qū)在早期胚胎發(fā)育期中的甲基化值

2.3 H19啟動(dòng)子區(qū)10個(gè)甲基化位點(diǎn)在SCNT和IVF胚胎中的甲基化變化模式

如圖3所示，H19轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)前468 bp開(kāi)始的262 bp序列中包含有10個(gè)甲基化位點(diǎn)。

圖3 H19啟動(dòng)子區(qū)的10個(gè)甲基化位點(diǎn)分布

如圖4～5所示，將10個(gè)甲基化位點(diǎn)在IVF與SCNT早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的甲基化情況分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。5號(hào)與7號(hào)甲基化位點(diǎn)在IVF與SCNT的2-cell期均未見(jiàn)甲基化，4號(hào)、9號(hào)和10號(hào)甲基化位點(diǎn)在SCNT胚胎的2-cell期出現(xiàn)了異常的甲基化升高，其余各位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)在IVF與SCNT早期胚胎發(fā)育過(guò)程中均呈2-cell期之前下降，2-cell期達(dá)到最低點(diǎn)，8-cell期開(kāi)始回升的模式。

圖4 10個(gè)甲基化位點(diǎn)在牛早期胚胎發(fā)育周期中甲基化趨勢(shì)（IVF）

圖5 10個(gè)甲基化位點(diǎn)在牛早期胚胎發(fā)育周期中甲基化趨勢(shì)（SCNT）

將SCNT早期胚胎2個(gè)ICR區(qū)的各個(gè)甲基化位點(diǎn)在發(fā)育過(guò)程中相對(duì)于IVF的甲基化變異情況如圖6所示。SCNT早期胚胎H19啟動(dòng)子的10個(gè)甲基化位點(diǎn)集中在2-cell期大量發(fā)生甲基化程度變異，其中4號(hào)、6號(hào)和9號(hào)位點(diǎn)的甲基化增加的百分比較高；SNRPN啟動(dòng)子的5個(gè)甲基化位點(diǎn)同樣在2-cell期大量發(fā)生甲基化程度變異，且都為正向變化，其中5號(hào)位點(diǎn)的甲基化增加的百分比最高。

圖6 SCNT胚胎H19啟動(dòng)子各甲基化位點(diǎn)相對(duì)于IVF胚胎甲基化的差異

3 討論

3.1 SCNT胚胎父源DNA的異常甲基化動(dòng)態(tài)模式

H19-IGF2基因簇表現(xiàn)為父源印跡，其ICR區(qū)在父源染色體呈甲基化狀態(tài)并且隨父源基因組一起經(jīng)歷甲基化的消除和重建［1，12］，因此該ICR區(qū)在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的甲基化變化情況能夠間接地反映父源DNA的甲基化動(dòng)態(tài)變化模式。如表1所示，IVF胚胎S期較配子期的甲基化水平下降較大，差異顯著（P＜0.05），與2-cell期的甲基化水平差異不顯著（P＞0.05）。表明IVF胚胎的父源印跡ICR區(qū)由合子期至S期進(jìn)行了激烈的去甲基化，由S期進(jìn)入2-cell期的過(guò)程中去甲基化程度減緩，且該去甲基化是不依賴DNA復(fù)制的。間接證明了IVF胚胎中父源基因在S期之前進(jìn)行主動(dòng)的去甲基化，并于8-cell期開(kāi)始DNA甲基化的重建，該結(jié)果與前面的免疫熒光結(jié)果相吻合，并支持Santos［3］的試驗(yàn)結(jié)果。SCNT胚胎的父源印跡ICR區(qū)甲基化模式雖然保持著與IVF胚胎相同的趨勢(shì)，但8-cell之前各階段的甲基化水平之間差異不顯著（P＞0.05）。通過(guò)計(jì)算H19基因啟動(dòng)子區(qū)在SCNT胚胎中各發(fā)育階段的甲基化程度相對(duì)于IVF胚胎的差異百分比，發(fā)現(xiàn)S期之前的甲基化變化百分比之間差異極顯著（P＜0.01），而S期開(kāi)始各階段差值的差異不顯著（P＞0.05）。表明SCNT胚胎的父源基因組在進(jìn)入S期，DNA發(fā)生大量復(fù)制之前去甲基化活動(dòng)很微弱。兩組胚胎之間在S期和2-cell期差異的百分比不顯著（P＞0.05），這就證明S期DNA大量開(kāi)始復(fù)制后，父源染色體的去甲基化能力也很微弱。以上結(jié)論間接說(shuō)明SCNT的父源基因組在S期之前極微弱地發(fā)生了主動(dòng)去甲基化，伴隨著DNA復(fù)制的開(kāi)始，又發(fā)生了極微弱的被動(dòng)去甲基化。父源染色體去甲基化能力的減退造成了2-ell期甲基化水平的異常升高。SCNT胚胎在8-cell期出現(xiàn)甲基化水平回升，由于2-cell期、8-cell期和桑葚胚時(shí)SCNT胚較IVF胚甲基化水平增長(zhǎng)的百分比相同，說(shuō)明SCNT胚胎父源基因組與IVF胚具備相當(dāng)?shù)募谆亟ǖ哪芰?。最終造成SCNT胚父源基因組過(guò)高的直接原因?yàn)?-cell期前去甲基化的不完全［4］，并且該去甲基化能力的降低包括主動(dòng)和被動(dòng)模式的同時(shí)降低。

3.2 H19-IGF2基因簇ICR區(qū)異常印記對(duì)胚胎的影響

印記控制區(qū)ICRs通過(guò)順式作用調(diào)控著整個(gè)印記簇中基因的表達(dá)或沉默［13］，其甲基化模式的正常與否就更加關(guān)鍵。試驗(yàn)選取的H19-IGF2基因簇對(duì)胚胎發(fā)育以及機(jī)體生理水平的調(diào)控至關(guān)重要。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，SCNT胚胎中這2個(gè)基因簇的ICR區(qū)甲基化模式均出現(xiàn)了較大的異常。SCNT胚胎H19-IGF2基因簇ICR的甲基化水平在早期胚胎發(fā)育的各個(gè)階段均高于IVF胚胎，最終的桑葚胚仍保留著較高的甲基化水平，超甲基化水平必定會(huì)影響ICR區(qū)對(duì)于整個(gè)基因簇的調(diào)控情況。H19-IGF2基因簇包括2個(gè)重要的與胚胎發(fā)育相關(guān)的基因，即H19和IGF2。大量的研究表明，H19基因表達(dá)的紊亂將導(dǎo)致多種發(fā)育異常及死胎［14］，更易導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)腫瘤的發(fā)生［15］。Ogura 等［7］檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，克隆小鼠發(fā)育到足月和出生后存活與印記基因的正常表達(dá)有著十分緊密的聯(lián)系。Weksberg 等［16］和 Birnbacher等［17］研究發(fā)現(xiàn)，IGF2 基因印跡的松弛或喪失會(huì)導(dǎo)致胎兒出現(xiàn)生長(zhǎng)過(guò)度、羊水過(guò)多、致死率升高、器官發(fā)育比例失調(diào)等BWS的癥狀。Forne研究發(fā)現(xiàn)，H19基因具有反式調(diào)節(jié)作用，其表達(dá)受到抑制，會(huì)引起IGF2基因DMR甲基化水平發(fā)生改變，從而引起IGF2基因過(guò)度表達(dá)，出現(xiàn)過(guò)度生長(zhǎng)的表型［8］。

3.3 影響SCNT胚胎印跡區(qū)發(fā)生甲基化變異的關(guān)鍵甲基化位點(diǎn)的篩選

將SCNT胚胎H19基因啟動(dòng)子區(qū)的10個(gè)甲基化位點(diǎn)的甲基化水平與IVF胚胎做對(duì)比，可見(jiàn)大量位點(diǎn)甲基化水平發(fā)生變化的階段集中在S期和2-cell期，也就是H19-IGF2基因簇ICR區(qū)甲基化模式出現(xiàn)重大異常的時(shí)間段。在這10個(gè)位點(diǎn)中，3號(hào)位點(diǎn)和4號(hào)位點(diǎn)分別在SCNT胚胎的S期與2-cell期較IVF胚出現(xiàn)了最大量的異常上調(diào)，為這2個(gè)時(shí)間段內(nèi)該ICR區(qū)去甲基化作用的弱化提供了最大貢獻(xiàn)。另外，4號(hào)位點(diǎn)在2-cell期相對(duì)于IVF胚胎的變異百分比最大，說(shuō)明該位點(diǎn)受到去甲基化抑制機(jī)制的影響最大。

4 結(jié)論

SCNT的父源基因在S期之前發(fā)生了主動(dòng)去甲基化，伴隨著DNA復(fù)制的開(kāi)始，又發(fā)生了被動(dòng)去甲基化。SCNT胚胎父源基因與IVF胚的甲基化重建能力相當(dāng)。篩選了1個(gè)去甲基化抑制機(jī)制的易感位點(diǎn)，H19的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)前468 bp開(kāi)始的262 bp序列中的4號(hào)甲基化位點(diǎn)。