蔣文捷，梁雪梅

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 老年科，四川 瀘州 646000）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種可由多因素引發(fā)的自身免疫性疾病，病變主要累積關(guān)節(jié)，病理表現(xiàn)為成纖維樣滑膜細(xì)胞增生、大量炎癥細(xì)胞浸潤、微血管新生、血管翳形成及軟骨和骨組織的破壞等，好發(fā)于40～60歲年齡段，且以女性居多，其發(fā)病持續(xù)時間與關(guān)節(jié)炎癥程度呈正相關(guān)，應(yīng)給予及早發(fā)現(xiàn)治療，避免發(fā)生關(guān)節(jié)畸形及功能喪失。目前，對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療，主要是減輕關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)，抑制病變發(fā)展及不可逆骨質(zhì)破壞，盡可能保護關(guān)節(jié)和肌肉功能，最終達(dá)到病情完全緩解或低疾病活動度的目的[1-3]。治療藥物主要有非類固醇類消炎止痛藥，如芬必得、扶他林等，可減輕癥狀，但不能治根；緩解病情藥，如按捺劑等，能緩解病情；激素，可快速消除癥狀，但不良反應(yīng)嚴(yán)重。也陸續(xù)有一些新的藥物被用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，但還是有很大一部分患者病情得不到控制，因此迫切需要一種更好的治療方法。

間充質(zhì)干細(xì)胞來源于中胚層，具有高度自我更新能力和多向分化潛能，來源廣泛，體外容易擴增，安全性較好，免疫原性低，并且具有強大的免疫抑制功能。間充質(zhì)干細(xì)胞來源廣泛，可來源于骨髓、脂肪、臍帶、臍血或胎盤等多種組織，并且有研究證實間充質(zhì)干細(xì)胞可抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖[4-5]。實驗選擇人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞（placenta mesenchymal stem cells, PMSCs）作為移植治療細(xì)胞，觀察其對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥因子及軟骨破壞的改善作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人胎盤組織來自本院實施剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦，產(chǎn)婦健康，產(chǎn)婦自愿捐獻(xiàn)胎盤組織，對實驗知情同意并簽署知情同意書。鼠成纖維細(xì)胞購自上海富衡生物科技有限公司。

6～8周齡清潔級SD大鼠32只，雌雄不拘，體重（200±16）g，將35只大鼠隨機分為正常組（n=8）、模型組（n=8）、對照組（n=8）及實驗組（n=8）。

Ⅰ型膠原酶、牛Ⅱ型膠原、弗氏完全佐劑（美國Sigma Alofich公司），逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（大連TaKaRa公司），DMEM培養(yǎng)基、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基及成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（Gibco公司），抗CD90、CD44、CD34、CD45抗體（美國BD公司），茜素紅S試劑、油紅O試劑（上海生工生物工程有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

流式細(xì)胞儀（美國BD公司），倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司），二氧化碳CO2培養(yǎng)箱（美國Forma公司），PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 方法

1.3.1 PMSCs的分離培養(yǎng)[6-7]取新鮮剝離胎盤羊膜下組織，PBS反復(fù)清洗后，剪成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，Ⅰ型膠原酶水浴震蕩消化1 h，細(xì)胞篩過濾收集，離心棄上清，PBS清洗2遍后，以含胎牛血清、雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中，72 h后全量換液，每3天換液1次，第4、5天細(xì)胞生長可達(dá)80%融合，胰酶消化細(xì)胞，以1∶3的比例進行細(xì)胞傳代，傳代培養(yǎng)第3代細(xì)胞用于以下實驗。

1.3.2 PMSCs的鑒定 取第3代PMSCs，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面CD90、CD44、CD34、CD45抗體表達(dá)；取生長良好的第3代PMSCs，細(xì)胞生長至80%融合時接種至6孔板，加入成脂細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)10 d，進行油紅O染色，觀察脂滴形成情況[8]；取生長良好的第3代PMSCs，細(xì)胞生長至80%融合時接種至6孔板，加入成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)21 d，進行茜素紅染色，觀察鈣結(jié)節(jié)形成情況[8]。

1.3.3 復(fù)制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動物模型 首先將純化的牛Ⅱ型膠原溶于0.1 mol/L醋酸中，制成質(zhì)量濃度為1 g/L的溶液，與等量弗氏完全佐劑混合成穩(wěn)定乳劑。取模型組、對照組及實驗組大鼠，在各大鼠背部皮內(nèi)分4點共注射1 ml乳劑；21 d后，將0.5 mg膠原溶于0.5 ml 1 mol/L醋酸中，注入大鼠腹腔再次加強注射。第1次注射后2周，隨機取模型組大鼠3只，處死，取后肢關(guān)節(jié)進行蘇木精-伊紅染色，發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)腔均存在不同程度狹窄，關(guān)節(jié)軟骨增生嚴(yán)重，部分個體標(biāo)本可見軟骨壞死現(xiàn)象，滑膜組織增生較多，可見10層以上的細(xì)胞層，關(guān)節(jié)周邊可見增生較多的血管叢或血管翳，證實實驗造模成功[9]。

1.3.4 實驗分組干預(yù) 第2次注射后12 h，實驗組大鼠尾靜脈注射1×107個/kg PMSCs（細(xì)胞濃度為1×107個/ml），對照組注射等量成纖維細(xì)胞，模型組不進行任何治療。干預(yù)3周后，處死所有大鼠，進行以下檢測。

1.3.5 酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測細(xì)胞因子水平 處死前內(nèi)眥靜脈取外周血2 ml，1 000 r/min離心10 min，取上清液，嚴(yán)格參照酶聯(lián)免疫吸附試劑盒說明書操作，檢測腫瘤壞死因子ɑ（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β, TGF-β）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）及白細(xì)胞介素6（interleukin-6, IL-6）水平。

1.3.6 檢測基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物（tissue inhibitor of metallo-proteinases, TIMPs）及鈣黏素11 mRNA表達(dá)處死大鼠，獲取關(guān)節(jié)滑膜組織，提取各組RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作獲得cDNA，設(shè)計引物序列。MMP-1：正向 5'-CTGGCCAAATCTGCCAGGTAA-3'，反 向 5'-TCACAAACGGCAGCGTCAA-3'；MMP-3：正向5'-TGATGGGCCTGGAATGGTC-3'，反向5'-TTCAT GAGCAGCAACCAGGAATAG-3'；MMP-13：正向 5'-CC CAGATGATGACGTTCAAGGA-3'，反向 5'-CTCGGAGA CTAGTAATGGCATCAAG-3'；TIMP-1：正向 5'-CATCT CTGGCCTCTGGCATC-3'，反向 5'-CATAACGCTGGTAT AAGGTGGTCTC-3'；TIMP-3：正向5'-AGGGCTGTGC AACTTTGTGG-3'，反向5'-TCTTGGAGGTCACAAAGC AAGG-3'；鈣黏素11：正向5'-TGCTGCCAACAGCCCA ATAA-3'，反向5'-GAGATGTTGAGCCAGGCAGTTTC-3'；GADPH：正向 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，反 向 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。PCR 反 應(yīng)總體積20 μl，在ABI Prism 7500型高通量熒光定量PCR儀進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR），各基因每個標(biāo)本做3個復(fù)孔，qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，循環(huán)45次；在60℃退火34 s階段檢測熒光值，并在上述擴增條件后增加60～95℃的熔解曲線分析步驟，計算各標(biāo)本平均Ct值，以GAPDH Ct值作為內(nèi)參，將目的基因Ct值減去GAPDH Ct值作為ΔCt值。正常組大鼠的ΔCt值平均值作為ΔΔCt值，計算標(biāo)準(zhǔn)化后的2-ΔΔCt值為mRNA的相對表達(dá)含量[10]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)分布和方差齊性的情況下，多組間數(shù)據(jù)比較可采用多個樣本均數(shù)比較的方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，再進一步應(yīng)用LSD-t檢驗進行組間兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PMSCs的分離培養(yǎng)與鑒定結(jié)果

原代培養(yǎng)約3 d，可見少量貼壁細(xì)胞，細(xì)胞呈圓形或梭形；培養(yǎng)10 d左右，貼壁細(xì)胞逐漸增多并伸展；培養(yǎng)的第3代PMSCs呈長梭形，類似成纖維細(xì)胞，呈漩渦狀聚集（見圖1A）。第3代PMSCs成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d后，油紅O染色可見紅色的脂滴顆粒，呈陽性（見圖1B）；成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d后，茜素紅染色可見鈣結(jié)節(jié)，呈陽性（見圖1C）。流式細(xì)胞儀檢測顯示，第3代PMSCs高表達(dá)CD44、CD90，而CD34、CD45呈陰性表達(dá)（見圖2）。

2.2 4組細(xì)胞因子水平比較

方差分析結(jié)果表明，4組間TNF-α、TGF-β、IL-1β及IL-6水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步進行LSD-t檢驗結(jié)果表明，模型組、對照組與正常組比較，TNF-α、IL-1β及IL-6水平均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；實驗組與模型組、對照組比較，TNF-α、IL-1β及IL-6水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；實驗組TGF-β水平高于其余3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

圖1 PMSCs的培養(yǎng)與成脂成骨分化能力 （×100）

圖2 PMSCs表面分子表達(dá)分析

表1 各組大鼠血清細(xì)胞因子水平的比較 （n =8，ng/L，±s）

表1 各組大鼠血清細(xì)胞因子水平的比較 （n =8，ng/L，±s）

注：1）與正常組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05；3）與對照組比較，P ＜0.05

組別 TNF-α TGF-β IL-1β IL-6正常組 57.65±11.23 309.79±96.45 25.67±8.96 25.68±8.96模型組 80.12±9.681） 310.57±198.60 99.36±89.781） 89.85±24.381）對照組 70.69±6.391） 246.27±80.961） 66.38±28.541） 88.64±25.641）實驗組 58.62±10.782）3） 512.63±230.192）3） 59.35±26.782）3） 70.69±11.852）3）F值 32.092 43.465 59.474 48.954 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 4組MMPs mRNA表達(dá)比較

方差分析結(jié)果表明，4組間MMP-1、MMP-3及MMP-13 mRNA表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步進行LSD-t檢驗結(jié)果表明，模型組、對照組與正常組比較，滑膜組織MMP-1、MMP-3及MMP-13 mRNA表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；實驗組與對照組、模型組比較，MMP-1、MMP-3及MMP-13 mRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表 2。

2.4 4組TIMP-1 mRNA表達(dá)比較

正常組、模型組、對照組、實驗組TIMP-1 mRNA表達(dá)分別為（4.90±0.45）、（1.39±0.21）、（8.09±0.78）及（10.26±0.90）。正常組、模型組、對照組、實驗組TIMP-3 mRNA表達(dá)分別為（1.29±0.15）、（0.49±0.08）、（0.36±0.06） 及（0.52±0.09）。 方 差 分 析結(jié)果表明，4組間TIMP-1、TIMP-3 mRNA表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=25.145和22.466，均P=0.000）。進一步進行LSD-t檢驗結(jié)果表明，模型組與正常組比較，TIMP-1、TIMP-3 mRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組、實驗組與模型組比較，TIMP-1 mRNA表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而模型組、對照組、實驗組間TIMP-3 mRNA表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 4組鈣黏素11 mRNA表達(dá)比較

正常組、模型組、對照組、實驗組鈣黏素11 mRNA 表達(dá)分別為（0.94±0.08）、（5.92±0.64）、（6.15±0.59）及（0.82±0.05）。方差分析結(jié)果表明，4組間鈣黏素11 mRNA表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=20.893，P=0.000）。進一步進行LSD-t檢驗結(jié)果表明，模型組、對照組與正常組比較，鈣黏素11 mRNA表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；實驗組與模型組、對照組比較，鈣黏素11 mRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠滑膜組織MMPs mRNA表達(dá)的比較（n =8，±s）

表2 各組大鼠滑膜組織MMPs mRNA表達(dá)的比較（n =8，±s）

注：1）與正常組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05；3）與對照組比較，P ＜0.05

組別 MMP-1 mRNA MMP-3 mRNA MMP-13 mRNA正常組 1.23±1.12 1.35±1.24 1.49±1.89模型組 6.80±5.691） 5.89±6.971） 22.58±19.491）對照組 8.54±5.981） 6.01±4.211） 23.19±23.251）實驗組 1.19±1.252）3） 1.33±1.262）3） 3.01±2.152）3）F值 21.628 23.440 29.151 P值 0.000 0.000 0.000

3 討論

體內(nèi)外研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫抑制能力，可通過調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞亞群而改善系統(tǒng)性紅斑狼瘡與克羅恩病[11-12]。因此推測PMSCs也同樣有免疫抑制能力，并且前期實驗通過病理組織學(xué)也證實，PMSCs確實可改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠的關(guān)節(jié)炎癥及關(guān)節(jié)破壞的程度。因此本實驗做了進一步研究，觀察PMSCs移植治療后，大鼠血清炎癥因子及滑膜組織MMPs、TIMPs及鈣黏素11的表達(dá)水平。

IL-1β、IL-6與TNF-α均是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病的重要促炎癥因子，參與疾病的發(fā)生與發(fā)展[13-16]。解海霞等[17]、肖金魚等[18]研究表明，白細(xì)胞介素1可促進滑膜細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的增殖和分化，促進滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞合成并釋放前列腺素E2和D膠原酶，引發(fā)滑膜炎癥反應(yīng)、軟骨基質(zhì)的崩解。另外，IL-1β能刺激滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞合成過量的MMPs，包括膠原酶和基質(zhì)溶素，后者能溶解破壞軟骨基質(zhì)。在體外，TNF-α可刺激滑膜纖維母細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素E2和膠原酶，促進骨質(zhì)破壞和骨的吸收及纖維母細(xì)胞增生，抑制骨膠原的合成；也能促進軟骨細(xì)胞分泌纖維蛋白溶酶激活劑，使纖維蛋白溶酶原變成纖維蛋白溶酶，加快關(guān)節(jié)炎損傷過程。IL-6可由IL-1β、TNF-α誘導(dǎo)與分泌，其與IL-1β與TNF-α具有協(xié)同效應(yīng)。通過檢測3種細(xì)胞因子水平，可判斷PMSCs對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的炎癥抑制作用。研究結(jié)果顯示，模型組、對照組TNF-α、IL-1β及IL-6水平均高于正常組，說明實驗造模成功，有關(guān)節(jié)炎癥表現(xiàn)；實驗組TNF-α、IL-1β及IL-6水平低于模型組及對照組，說明PMSCs移植治療降低類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)，具有治療作用。此外，實驗結(jié)果還顯示實驗組TGF-β水平高于其余各組，而TGF-β為抑炎癥因子，同樣也證實了PMSCs的治療作用。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎最重要的病理表現(xiàn)之一就是軟骨的破壞，而軟骨破壞主要與MMPs及TIMPs比例失衡及鈣黏素的表達(dá)有關(guān)[19-22]。實驗結(jié)果顯示，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠滑膜組織內(nèi)高表達(dá)破壞軟骨結(jié)構(gòu)的MMP-1、MMP-3及MMP-13，低表達(dá)TIMP-1、TIMP-3經(jīng)過PMSCs移植治療后，滑膜組織內(nèi)MMP-1、MMP-3及MMP-13降低，說明其可通過抑制MMPs的表達(dá)減輕關(guān)節(jié)軟骨的破壞。鈣黏素11為關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞特異性表達(dá)黏附分子，可促進類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的遷移，增強其侵襲能力，參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，模型組、對照組鈣黏素11水平高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，證實類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病中滑膜組織鈣黏素11水平增高；經(jīng)過PMSCs移植治療后，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠滑膜組織鈣黏素水平降低，說明PMSCs移植可通過下調(diào)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織鈣黏素11水平來抑制滑膜成纖維細(xì)胞的遷移，抑制其侵襲能力，阻止病情的進一步發(fā)展。

綜上所述，PMSCs可能通過抑制TNF-α、IL-1β及IL-6水平及MMPs分泌與鈣黏素11表達(dá)，上調(diào)TGF-β水平，來減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)炎癥與軟骨破壞，但具體的機制還有待進一步研究。