吳翔，卓書偉，鄭才玲，高戈

（1.海南省中醫(yī)院 檢驗科，海南 ?？?70203；2.中南大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗系，湖南 長沙 410013）

肺高壓（pulmonary hypertension, PH）是一大類以肺動脈壓進(jìn)行性升高為特點(diǎn)的肺血管疾病[1]，其中肺動脈平滑肌細(xì)胞（pulmonary arterial smooth muscle cell,PASMC）增殖是肺血管重塑的關(guān)鍵所在[2-3]。Wnt/βcatenin信號通路在血管平滑肌細(xì)胞的功能和血管平滑肌細(xì)胞增殖中起著重要作用[4]。DKK1作為Wnt/β-catenin信號通路的拮抗劑，可以特異地與Wnt的受體結(jié)合，從而抑制下游信號的傳導(dǎo)[5]。MicroRNA（miRNA）是一種新型的18～23 nt長的非編碼RNA，已經(jīng)在多種真核生物中證明調(diào)控miRNA表達(dá)是發(fā)育、細(xì)胞生長和分化過程中的關(guān)鍵參與者[6]。miRNA-21在疾病早期即呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢[7]，它有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的作用，且它的表達(dá)水平與細(xì)胞的分化程度相關(guān)，能夠提示患者預(yù)后[8]。本研究擬通過Wnt通路的拮抗劑DKK1探討miRNA-21在平滑肌細(xì)胞的形成和促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、OPTI-MEM細(xì)胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基（Gibco）、細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000、實時熒光定量PCR試劑盒、miRNA-21引物、內(nèi)參（Ambion），相關(guān)抗體購自Abcam公司，大鼠肺血管平滑肌細(xì)胞（原代分離）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

野百合堿干預(yù)喂養(yǎng)大鼠復(fù)制PH動物模型，取模型肺動脈組織剪碎消化，貼壁培養(yǎng)，獲得肺高壓大鼠PASMCs[9]，于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中37℃、5%二氧化碳CO2條件下培養(yǎng)，每2天換液，3～4 d傳代1次。

miRNA-21 mimics和對照序列自行設(shè)計交生工生物工程上海(股份)有限公司合成。實驗分3組：miRNA-21抑 制 組、miRNA-21正 常 組和miRNA-21過表達(dá)組。miRNA-21引物序列：正向5'-AGGCTGTGAAGCTCTCCCCACT-3'，反向5'-G CCACACTGCTGCCTTTTAGTCCC-3'。GADPH探針序列：正向5'-ACGCCTCTGGCCGTACCACT-3'，反向5'-TGGTGAAGCTGTAGCCGCGC-3'。進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染，細(xì)胞存活率＜50%。

1.3 實時熒光定量PCR

按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，樣本置入-20℃冰箱冷凍保存。按照熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.3.1 miRNA-21表達(dá)水平檢測 PH大鼠模型原代PASMCs瞬時轉(zhuǎn)染miRNA-21 inhabits 和overpress mimics 48 h后，實時熒光定量PCR分別檢測3組細(xì)胞中miRNA-21表達(dá)水平。

1.3.2 β-catenin、Cyclin D1和 DDK1核酸表達(dá)水平檢測 外源性miRNA-21干擾PH大鼠模型原代PASMCs后，實時熒光定量PCR法分別檢測3組細(xì)胞Wnt通路中β-catenin、Cyclin D1和DDK1的核酸表達(dá)水平。

1.4 Western blot檢測 β-catenin、Cyclin D1、DKK1蛋白表達(dá)

一抗?jié)舛?∶1 000，β-actin：一抗?jié)舛?∶1 000。收集瞬時轉(zhuǎn)染后72 h細(xì)胞，提取總蛋白。SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜．室溫封閉，一抗4℃反應(yīng)過夜，洗膜，二抗室溫孵育1 h，洗膜，增強(qiáng)發(fā)光底物試劑反應(yīng)發(fā)光，X射線片顯影。

外源性miRNA-21干擾PH鼠模型原代PASMCs后，Western blot法分別檢測3組細(xì)胞Wnt通路中β-catenin、Cyclin D1和DKK1的蛋白表達(dá)水平，陽性條帶以Gel pro4.0 版凝膠光密度分析軟件進(jìn)行分析，測其累積光密度（integrated optical density, IOD）參考值，其發(fā)表強(qiáng)度用β-catenin、Cyclin D1或者DKK1光密度值/β-action光密度值表示，重復(fù)6次，統(tǒng)計結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多樣本均數(shù)比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代大鼠PASMCs瞬時轉(zhuǎn)染后miRNA-21表達(dá)的改變

miRNA-21的 表 達(dá)，miRNA-21正 常 組 為（0.000407±0.000184），miRNA-21抑 制 組 為（0.000038±0.000013），miRNA-21過 表 達(dá) 組 為（0.0414±0.0012），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=68.32，P=0.000）。其中，與miRNA-21正常組比較，miRNA-21抑制劑組原代大鼠PASMCs中miRNA-21表達(dá)下降（P＜0.05），而miRNA-21過表達(dá)組原代大鼠PASMCs中miRNA-21表達(dá)增高（P＜0.05）。

2.2 外源性miRNA-21對Wnt通路中βcatenin、Cyclin D1和DDK1 mRNA表達(dá)的影響

各組細(xì)胞中β-atenin、Cyclin D1和DDK1 mRNA表達(dá)，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。其中在外源性miRNA-21被抑制的時候，PH大鼠模型原代PASMCs中β-catenin、Cyclin D1的mRNA表達(dá)水平增高（均P＜0.05），DDK1的miRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）；而在外源性miRNA-21過表達(dá)干預(yù)的時候，細(xì)胞中β-catenin、Cyclin D1的mRNA表達(dá)水平反而降低（均P＜0.05），DDK1 mRNA表達(dá)水平增高（P＜0.05）。見表1。

表1 外源性miRNA-21對β-catenin、Cyclin D1和DDK1 mRNA表達(dá)的影響 （n =6，±s）

表1 外源性miRNA-21對β-catenin、Cyclin D1和DDK1 mRNA表達(dá)的影響 （n =6，±s）

注：?與miRNA-21組比較，P ＜0.05

miRNA-21 正常組 0.000 867±0.000 256 0.003 469±0.001 022 0.000 813 7±0.000 368 6 miRNA-21 抑制組 0.002 769±0.000 879? 0.011 08±0.003 517? 0.000 075 5±0.000 022 6?miRNA-21 過表達(dá)組 0.000 200 9±0.000 078? 0.000 401 7±0.000 156? 0.010 37±0.003 057?F值 37.867 40.464 62.627

2.3 外源性miRNA-21對Wnt通路中β-catenin、Cyclin D1和DDK1蛋白表達(dá)的影響

各組細(xì)胞β-catenin、Cyclin D1和DDK1蛋白表達(dá)，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。其中，在外源性miRNA-21被抑制的時候，PH大鼠模型原代PASMCs中β-catenin、Cyclin D1的蛋白表達(dá)水平增高（均P＜0.05），DDK1的蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；而在外源性miRNA-21過表達(dá)干預(yù)的時候，細(xì)胞中β-catenin、Cyclin D1的蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），DDK1的蛋白表達(dá)水平增高（P＜0.05），與基因表達(dá)一致。見附圖和表2。

表2 外源性microRNA-21對β-catenin、cyclin D1和DDK1蛋白表達(dá)的影響 （n =3，±s）

表2 外源性microRNA-21對β-catenin、cyclin D1和DDK1蛋白表達(dá)的影響 （n =3，±s）

注：?與miRNA-21正常組比較，P ＜0.05

組別 β-catenin蛋白 cyclin D1蛋白 DDK1蛋白miRNA-21 正常組 0.418 1±0.017 42 0.320 3±0.019 25 0.300 3±0.030 7 miRNA-21抑制組 0.860 9±0.090 11? 0.717 2±0.045 32? 0.190 3±0.032 64?miRNA-21過表達(dá)組 0.220 5±0.030 04? 0.176 6±0.253 5? 0.769 8±0.090 19?F值 103.818 230.183 84.055 P值 0.000 0.000 0.000

附圖 外源性miRNA-21對β-catenin、Cyclin D1和DDK1蛋白表達(dá)的影響 （n =3）

3 討論

早期預(yù)測高度保守的基因類型的miRNA不僅擴(kuò)大人類對該疾病的生物學(xué)理解，更重要的是開辟新的發(fā)展途徑新的預(yù)后和診斷策略[10]。由于miRNA穩(wěn)定性高，即使在保存不良的標(biāo)本中，也被認(rèn)為是強(qiáng)大的臨床分析物，對臨床研究和生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)很有價值。miRNA-21以前多報道見于人類癌細(xì)胞系，miRNA-21扮演著癌基因的角色，有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的作用[11-13]，而在PH的發(fā)病機(jī)制中，肺血管收縮、肺血管重塑和肺血管原位血栓形成是PH發(fā)生、發(fā)展的3個重要病理生理基礎(chǔ)，其主要病理特征為肺血管重構(gòu)。主要表現(xiàn)為PASMCs增殖，肌型血管中膜增厚，非肌型血管肌化，成纖維細(xì)胞和胞外基質(zhì)合成增多等[2]。PASMCs增殖是肺血管重塑的關(guān)鍵所在，亦是阻止和逆轉(zhuǎn)肺高壓進(jìn)程的關(guān)鍵所在，本研究認(rèn)為，miRNA-21在PH早期通過對肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響，也參與肺血管的重塑。

而在不同的Wnt信號途徑中，DKK僅特異地影響經(jīng)典Wnt信號通路，而對于Wnt/PCP通路及Wnt/Ca2+通路無明顯的作用。在DKK家族中，DKK1作為Wnt通路的抑制子是研究得較清楚的。DKK1作為Wnt/β-catenin信號通路的拮抗劑，可以特異地與Wnt的受體之一LRP5/6結(jié)合，從而干擾LRP5/6與Wnt-Frizzled復(fù)合物的結(jié)合，抑制下游信號的傳導(dǎo)。當(dāng)在野百合堿誘導(dǎo)的大鼠PH模型中使用DKK1抗體后可降低平滑肌細(xì)胞的增殖。這表明通過阻斷Wnt通路的拮抗劑DKK1對平滑肌細(xì)胞的形成和促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖都具有重要意義。

本實驗結(jié)果證實，在外源性miRNA-21干擾PH大鼠模型原代PASMCs后，PH大鼠模型原代PASMCs中β-catenin、Cyclin D1和DDK1的表達(dá)水平隨之改變。在外源性miRNA-21被抑制的時候，PASMCs中β-catenin、Cyclin D1表達(dá)水平增高，DDK1表達(dá)降低，拮抗作用減弱；而在外源性miRNA-21過表達(dá)干預(yù)的時候，PASMCs中β-catenin、Cyclin D1表達(dá)水平降低，DDK1表達(dá)增高，拮抗作用增強(qiáng)。所以筆者認(rèn)為miRNA-21的早期干預(yù)可通過調(diào)控Wnt通路的DKK1作用與Wnt/β-catenin信號通路，Wnt/β-catenin信號通路在血管平滑肌細(xì)胞的功能和血管平滑肌細(xì)胞增殖中起著重要作用，Wnt蛋白通過與膜上受體LRP5/6及frizzed（Fz）結(jié)合形成的跨膜復(fù)合物導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號通路活化，激活的受體將信號進(jìn)一步傳遞到細(xì)胞質(zhì)中，使得Dishevelled和Axin被募集到細(xì)胞膜上，導(dǎo)致Axin-APC-GSK3β復(fù)合物被破壞，于是β-catenin從這個降解復(fù)合體中釋放出來并在細(xì)胞質(zhì)中積累。胞質(zhì)中積累的β-catenin繼而進(jìn)入細(xì)胞核與LEF/TCF等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖。miRNA-21有望成為早期檢測PH的新靶點(diǎn)。