閻雯，齊薛浩

（陜西省西安市兒童醫(yī)院 1.新生兒一科，2.NICU科，陜西 西安 710003）

缺血缺氧性腦?。╤ypoxia-ischemic encephalopathy,HIE）是新生兒較為常見的疾病之一，其臨床病死率高達75%，是目前新生兒早期死亡及小兒智力發(fā)育障礙、癲癇、小兒腦性癱瘓及其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害的主要原因，缺血缺氧性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage, HIBD）后的炎癥反應(yīng)是新生兒HIE的特征性反應(yīng)之一[1]。MicroRNA（miRNA）是真核生物中參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控非編碼單鏈的小分子RNA，miRNA雖然僅占人類基因約1%～5%，卻能調(diào)控人類大約60%的mRNA和30%的蛋白編碼[2]。既往有報道指出，miRNA-181b在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急性炎癥反應(yīng)中通過對炎癥因子腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α），白介素 6（interleukin 6, IL-6）、IL-1β、IL-8及高遷移率族蛋白1（high mobility group box-1 protein,HMGB-1）表達的調(diào)控發(fā)揮重要神經(jīng)保護作用[3]。最近研究顯示，miRNA-181能夠通過靶向Toll樣受體4（Toll like receptor 4, TLR4）通路，調(diào)控促炎癥因子的分泌，在燒傷、銀屑病患者表皮細(xì)胞的過度增殖及肺臟的纖維化過程中發(fā)揮一定的保護作用[4-6]。然而，miRNA-181b能否在新生兒HIE的進展中發(fā)揮保護作用尚未見報道，本文通過原代培養(yǎng)新生大鼠神經(jīng)元細(xì)胞HIBD，體外模擬新生兒缺血缺氧的病理生理反應(yīng)，觀察miRNA-181b在HIE中的作用，并進一步探討其可能的作用機制，以期為新的靶點的尋找提供實驗依據(jù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

Neurbasal培養(yǎng)液、B27培養(yǎng)基添加劑、0.25%胰酶及胎牛血清（美國Gibco公司），CCK-8（Cell Counting Kit-8）細(xì)胞活性檢測試劑盒（日本同仁公司），Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒（美國BD公司），總mRNA提?。绹鳬nvitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR）試劑盒（美國Roche公司），特異性引物合成[生工生物工程（上海）股份有限公司]，兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）及TLR4單克隆抗體（英國Abcam公司），細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000和miRNA第1鏈合成試劑盒（美國Invirogen公司），miRNA-181b模擬物（miRNA-181b mimic），miRNA-181b無關(guān)序列（miRNA-181b negative control, miRNA-NC） 及miRNA-181b抑 制劑（anti-miRNA-181b）（Ribobio公司），si-NC（nontargeting）及si-TLR4試劑盒（美國Ambion公司）。

1.2 方法

1.2.1 原代細(xì)胞培養(yǎng)及分組 新生1～2日齡無特定病原體（SPF）斯?jié)娎鄹穸嗬祝⊿D）大鼠3只（購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司）常規(guī)消毒后置于超凈工作臺斷頭取腦，在預(yù)冷的D-Hank's液中分離大腦皮層，預(yù)冷的D-Hank's液洗凈后迅速剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的小塊，胰酶37℃下消化20 min，每5分鐘輕輕搖晃或吹打1次，使用預(yù)冷的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基和Ham's F-12營養(yǎng)混合物DMEM/F12培養(yǎng)液終止反應(yīng)。200目篩網(wǎng)過濾，4℃，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，再用含20%胎牛血清的DMEM/F12新鮮培養(yǎng)液洗1次，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×106個/L，接種于經(jīng)0.01%多聚賴氨酸浸泡過夜的6孔板中，放入37℃恒溫5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。4～8 h后neurbasal+B27營養(yǎng)因子培養(yǎng)液換全液1次，接種第4天，加入終濃度為5 mol/L的阿糖胞苷作用24 h，抑制膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，以后每4天半量換液1次。取培養(yǎng)7 d的原代神經(jīng)元細(xì)胞，吸去培養(yǎng)液，隨機分為對照組和HIBD組，其中對照組用含糖DMEM洗2次，再加入含糖DMEM置于37℃、95%空氣孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。HIBD組用無糖DMEM洗2次，加入無糖DMEM培養(yǎng)液后，置于37℃、95% N2的密閉缺氧室中培養(yǎng)4 h。

1.2.2 CKK-8法檢測細(xì)胞活性 將各組細(xì)胞以2×103個/孔密度接種于96孔板中，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，隨后向各孔中加入10 μl CCK-8溶液，輕晃混勻后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，酶標(biāo)儀490 nm 波長處測光密度（optical density, OD）值。取3個復(fù)孔的OD值均數(shù)，根據(jù)公式計算細(xì)胞的相對增殖率（P%）：P%=（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 神經(jīng)元細(xì)胞分別以2×105個/孔密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后換新鮮培養(yǎng)液，按操作手冊說明書以等量DMEM雙無培養(yǎng)基分別稀釋適量的miRNA-181b mimic和脂質(zhì)體LipofectamineTM2000，混勻后各自室溫靜置5 min，后將兩者混勻室溫下共培養(yǎng)20 min，加入培養(yǎng)板中，輕輕混勻，放入培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，隔8 h后換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，同法轉(zhuǎn)染miRNA-181b陰性對照（miRNA-NC）以及miRNA-181b抑制劑（anti-miRNA-181b）。TLR4 siRNA的轉(zhuǎn)染，當(dāng)接種到6孔板中原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞融合達60%左右時，棄完全培養(yǎng)基，PBS洗1次，加入1.5 ml無抗DMEM培養(yǎng)基。5 μl LipofectamineTM2000及5 μl siRNA分別與250 μl雙無DMEM培養(yǎng)基混勻后，室溫培養(yǎng)5 min。將上述溶液混勻后室溫放置20 min，獲得siRNA轉(zhuǎn)染液。將siRNA轉(zhuǎn)染液加入已換成雙無DMEM培養(yǎng)基的6孔板中，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h后，更換為無抗DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。24 h后更換為含10%胎牛血清的完全DMEM培養(yǎng)基。

1.2.4 雙熒光素酶報告檢測 PCR擴增TLR4 mRNA 3'-UTR并克隆至pMD18-T載體，構(gòu)建野生型TLR4基因載體（TLR4-WT），利用點突變方法構(gòu)建TLR4 3'-UTR突變載體（TLR4-Mut）。將構(gòu)建的TLR4-WT、TLR4-Mut基因載體進行XhoI和NotI雙酶切，將野生型及含有突變位點的TLR4-3'-UTR克隆置于psiCHECKTM-2載體的海腎熒光素酶開放讀碼框架的下游，構(gòu)建含該野生及突變載體的雙熒光素酶報告載體。將所構(gòu)建的熒光素酶報告載體與miRNA-181b mimic表達載體或者陰性對照miRNA-NC載體共轉(zhuǎn)染至HEK-293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24 h收集細(xì)胞進行雙熒光素酶報告基因測定。計算公式：相對熒光值=螢火蟲熒光素酶熒光值/海腎熒光素酶熒光值。

1.2.5 Western blot檢測TLB4蛋白表達 將各組原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞用0.05%胰蛋白酶消化后PBS洗滌3次，加入450 μl蛋白裂解液裂解細(xì)胞，BCA法測定蛋白濃度，10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，封閉后兔抗小鼠一抗GAPDH（1∶2 000）及兔抗鼠TLR4（1∶500）4℃過夜，HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗（1∶2 000），常溫下作用1 h，Western blot檢測TLR4蛋白表達，F(xiàn)luor Chem Q凝膠成像系統(tǒng)（美國Alpha Innotech公司）顯影，Scion Image圖像分析系統(tǒng)對條帶進行分析，目的蛋白的相對含量以目的蛋白與GAPDH條帶光密度的比值表示。

1.2.6 SYBR Green qRT-PCR檢測miRNA-181b和TLR4 mRNA表達 Trizol抽提法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計測吸光度值確定RNA的濃度和純度。Quantscript RT kit逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴增引物采用Oligo 6.0設(shè)計，引物及其序列分別為（5'-3'）：miRNA-181b，正向AACATTCATTGCTGTCGGT，反向CCGCCTAACGTACCGCGAATTT；U6，正向GCTTCGG CAGCACATATACTAA，反向AACGCTTCACGAATTTG CGT；TLR4，正向GGCATCATCTTCATTGTCCTTG，反向AGCATTGTCCTCCCACTCG；GAPDH，正向GGAG CGAGATCCCTCCAAAAT，反向 GGCTGTTGTCATACTT CTCATGG。采用SYBR Green Ⅰ（美國Roche公司）熒光染料嵌合法20 μl反應(yīng)體系，即10 μl SYBR Green real-time PCR Master Mix，1 μl 0.2 μmol/L引物，2 μl cDNA及7 μl無菌雙蒸水。避光置于qRT-PCR儀（ABI 7500 Fast PCR）采集熒光信號檢測miRNA-181b及TLR4 mRNA表達，U6及GAPDH分別作為miRNA-181b及TLR4 mRNA內(nèi)參，ABI7500配套軟件采用 2-ΔΔCt處理數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIBD組神經(jīng)元細(xì)胞中miRNA-181b的表達

新生大鼠神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)8 d后，HIBD組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（0.64±0.08 vs 1.01±0.14，t=3.974，P=0.017）。HIBD 組神經(jīng)元細(xì)胞中miRNA-181b表達量降低。見圖1A。anti-miRNA-181b及miRNA-181b mimic的轉(zhuǎn)染效率，見圖1B，方差分析結(jié)果顯示各組間miRNA-181b表達量有差異（F=50.365，P=0.000），其中，與對照組比較，miRNANC和anti-NC組神經(jīng)元細(xì)胞miRNA-181b表達量均無明顯變化，miRNA-181b mimic組較miRNA-NC組神經(jīng)元細(xì)胞miRNA-181b表達增高（4.42±0.83 vs 1.06±0.17，P＜0.05），anti-miRNA-181b 組較 anti-NC組神經(jīng)元細(xì)胞miRNA-181b表達降低（0.53±0.09 vs 1.02±0.13，P＜0.05）。

2.2 miRNA-181b過表達對新生大鼠神經(jīng)元細(xì)胞缺血缺氧損傷的影響

圖1 不同處理組神經(jīng)元細(xì)胞中miRNA-181b表達水平比較

圖2 miRNA-181b過表達對新生大鼠神經(jīng)元細(xì)胞缺血缺氧損傷的影響

miRNA-181b在各組神經(jīng)元細(xì)胞中的表達水平有差異（F=15.322，P=0.000）（見圖2A），流式細(xì)胞儀及CKK-8檢測結(jié)果（見圖2B、2C及2D）顯示，細(xì)胞存活率及凋亡率在各組間有差異（F=11.496和32.312，均P=0.000）。其中與對照組比較，缺血缺氧能增加神經(jīng)元細(xì)胞凋亡（31.20±4.90 vs 3.99±0.54，P=0.001），降 低 細(xì) 胞 活 性（71.50±11.20 vs 100.15±11.50，P=0.037）。miRNA-181b mimic轉(zhuǎn)染后，部分逆轉(zhuǎn)缺血缺氧所誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡（20.60±3.50 vs 30.90±5.01，P=0.043），增加細(xì)胞活性（89.50±7.20 vs 69.00±6.45，P=0.021）。此外，anti-miRNA-181b轉(zhuǎn)染后抑制神經(jīng)元細(xì)胞中miRNA-181b表達會進一步加重缺血缺氧對新生大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的損傷，增加細(xì)胞凋亡（35.80±3.00 vs 29.90±2.10，P=0.049），降低細(xì)胞活性（55.90±4.72 vs 70.4±4.93，P=0.021）。

2.3 miRNA-181b在新生大鼠神經(jīng)元細(xì)胞中靶向調(diào)控TLR4表達

應(yīng)用http：//www.microrna.org及http：//www.target scan.org對miRNA-181b進行在線分析預(yù)測，發(fā)現(xiàn)miRNA-181b與TLR4 mRNA的3'-UTR存在結(jié)合序列（見圖3A）。雙熒光素酶報告檢測結(jié)果顯示各組間熒光素酶活性有差異（F=4.810，P=0.034），其中與miRNA-NC組比較，miRNA-181b mimic轉(zhuǎn)染組能抑制TLR4 mRNA的3'-UTR載體的相對熒光素酶活性（0.62±0.07 vs 0.97±0.19，P=0.040）。而對TLR4 mRNA該段序列進行突變（TLR4-Mut）后，該抑制作用消失（見圖3B）（1.03±0.11 vs 0.90±0.17，P=0.329），本結(jié)果提示miRNA-181b對TLR4存在直接的靶向關(guān)系。此外，在原代培養(yǎng)的新生大鼠神經(jīng)元細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA-181b mimic后降低TLR4的表達（0.62±0.09 vs 1.09±0.16，P=0.011），各組間 TLR4表達水平有差異（F=15.721，P=0.004）（見圖3C）。

圖3 miRNA-181b在新生大鼠神經(jīng)元細(xì)胞中靶向調(diào)控TLR4表達

Western blot檢測結(jié)果顯示，各組細(xì)胞TLR4表達水平有差異（F=11.820，P=0.003），其中HIBD組神經(jīng)元細(xì)胞中TLR4表達增加（2.26±0.43 vs 1.01±0.12，P=0.008），si-TLR4轉(zhuǎn)染后48 h，TLR4表達降低（1.48±0.26 vs 2.35±0.39，P=0.032）（見圖 4A）。CKK-8檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同處理組細(xì)胞存活率有差異（F=22.859，P=0.000），TLR4成功敲減能增加缺血缺氧下新生大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的活性（88.5±7.2 vs 65.7±6.1，P=0.014）（見圖 4B）。

進一步研究結(jié)果顯示，不同處理組TLR4表達水平及神經(jīng)元細(xì)胞活性有差異（F=22.693和6.648，均P=0.015），anti-miRNA-181b轉(zhuǎn)染后TLR4蛋白表達增加（3.27±0.42 vs 1.06±0.09，P=0.001）并伴隨細(xì)胞活性的降低（71.5±13.1 vs 100.2±9.2，P=0.036），anti-miRNA-181b與si-TLR4共轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)TLR4表達的增加（1.96±0.33 vs.3.36±0.57，P=0.013），同時部分恢復(fù)缺血缺氧下神經(jīng)元細(xì)胞的活性（94.2±11.2 vs 66.1±11.1，P=0.037）（見圖 4C、4D）。

2.4 TLR4介導(dǎo)缺血缺氧下的神經(jīng)元損傷

圖4 TLR4介導(dǎo)缺血缺氧下的神經(jīng)元損傷

3 討論

既往研究顯示，新生兒HIBD可引起不可逆的腦損傷，導(dǎo)致一系列的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，發(fā)生過HIBD而存活的新生兒中約25%出現(xiàn)腦性癱瘓、癲癇及智力落后等永久性神經(jīng)精神缺陷，給社會和家庭帶來沉重的經(jīng)濟精神負(fù)擔(dān)[7]。新生兒HIBD的發(fā)病機制復(fù)雜，臨床療效差，至今尚無統(tǒng)一、有效的治療方案能防止神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的發(fā)生。因此，深入研究新生兒HIBD分子生物學(xué)機制，尋找新生兒HIBD治療的新靶點是醫(yī)學(xué)專業(yè)者亟待解決的問題。有文獻報道指出miRNA-181b能通過調(diào)控NF-κB信號通路在急性肺損傷中發(fā)揮一定的抗炎作用[8]。與該研究類似，本研究中發(fā)現(xiàn)，miRNA-181b在新生大鼠神經(jīng)元細(xì)胞HIBD模型中表達降低，雙熒光素酶報告結(jié)果顯示miRNA-181b能靶向作用于TLR4，通過調(diào)控TLR4的表達，在新生大鼠神經(jīng)元細(xì)胞缺血缺氧時發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞活性的保護性作用。

miRNAs是一類含有約22個核苷酸序列組成的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，廣泛參與細(xì)胞的分化、免疫、炎癥及慢性疼痛等過程的調(diào)制[9]。最近研究報道發(fā)現(xiàn)，在腫瘤，神經(jīng)系統(tǒng)及心血管疾病領(lǐng)域中有多個miRNA與缺血缺氧密切相關(guān)，其中miRNA-181b是1個多次出現(xiàn)而又倍受關(guān)注的miRNA，研究中發(fā)現(xiàn)，miRNA-181b不僅能夠通過對調(diào)節(jié)熱休克蛋白A5以及泛素型羧基末端水解酶L1表達的調(diào)控在缺血缺氧性腦卒中病程進展中發(fā)揮一定的神經(jīng)保護作用，還可通過對巨噬細(xì)胞中IL-6的調(diào)節(jié)改變細(xì)胞對內(nèi)毒素的耐受性[10-12]。本研究中發(fā)現(xiàn)，miRNA-181b轉(zhuǎn)染后過表達miRNA-181b可減輕缺血缺氧下神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，增加細(xì)胞活性。因此，可以推斷缺血缺氧后神經(jīng)細(xì)胞中miRNA-181b的表達下調(diào)可能是缺氧缺血性腦組織病理損傷的分子機制之一，miRNA-181b表達增加可能改善缺血缺氧下的腦損傷，為新生兒缺氧缺血性損傷的治療提供一個新的研究方向。

TLRs是I型跨膜受體超家族，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在免疫炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)中起重要作用[13]。既往有研究指出，小鼠在缺失TLR4后炎癥因子表達減少，從而避免腦部缺血再灌注損傷，提示TLR4可參與缺血再灌注損傷過程中的炎癥反應(yīng)。此外，有研究證實早產(chǎn)兒與TLRs多態(tài)性存在密切關(guān)系，且胎鼠及新生鼠中TLR4的過度激活與腦損傷的關(guān)系確切[14-15]。然而，關(guān)于TLR4在新生兒腦損傷中作用機制，尤其是與miRNAs相互作用的研究尚未見報道，本研究中發(fā)現(xiàn)缺血缺氧下miRNA-181b的表達下調(diào)，負(fù)性調(diào)控TLR4蛋白表達增多，促進神經(jīng)元細(xì)胞死亡，TLR4敲減后逆轉(zhuǎn)缺血缺氧下神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，提示TLR4介導(dǎo)新生大鼠神經(jīng)元細(xì)胞缺血缺氧損傷在腦損傷，在新生兒HIBD過程中可能發(fā)揮神經(jīng)毒性作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在新生兒HIBD中miRNA-181b能通過負(fù)性調(diào)控TLR4表達緩解缺血缺氧下的腦損傷。本研究闡述miRNA-181b及TLR4在新生兒HIBD過程中的意義，證實miRNA-181b與TLR4靶向關(guān)系，補充新生兒HIBD過程的細(xì)胞分子生物學(xué)機制。值得注意的是新生兒HIBD機制復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)、受體以及離子通道，且病情變化迅速，后遺效應(yīng)嚴(yán)重，在以后的研究中，希望能夠進一步多角度明確參與新生兒HIBD的miRNAs及其各分子靶標(biāo)，闡明其作用機制，為新生兒HIBD的治療提供有效的藥物合成新的靶點。