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最小體積法玻璃化保存的研究進展

2018-08-08 09:57
制冷學(xué)報 2018年4期
關(guān)鍵詞:微滴玻璃化液氮

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院 上海 200093)

低溫環(huán)境下,細胞或組織的代謝活動會削弱甚至完全停止。低溫環(huán)境為細胞、組織的長期有效儲存提供條件,使其可廣泛應(yīng)用于組織工程、再生醫(yī)學(xué)和輔助生殖等多個領(lǐng)域[1]。目前實現(xiàn)細胞低溫保存的方法有慢速冷凍法和玻璃化法。慢速冷凍法于20世紀70年代早期出現(xiàn),它是先將凍存管放在程序降溫盒中以1~2 ℃/min的降溫速率緩慢降至某一中間溫度,然后置于液氮中保存。慢速冷凍法需要1~2 mol/L[2]的低溫保護劑(cryoprotectant agents,CPAs),冷凍過程中易形成冰晶,冰晶對細胞結(jié)構(gòu)具有破壞作用[3],保存效果不理想。玻璃化是將液體直接轉(zhuǎn)化為非晶態(tài)(玻璃態(tài))的固體,在此過程中無冰晶形成。與慢速冷凍法相比,玻璃化法需要更高的CPAs濃度,如6~8 mol/L,以及更高的降溫速率,如105℃/min[4]。

實現(xiàn)玻璃化有兩種方法,一種是提高CPAs濃度,另一種是提高冷卻速率。高濃度CPAs會對細胞造成滲透休克及毒性損傷,具有致命性損傷[4],因此該方法有較大的局限性。研究表明,實現(xiàn)玻璃化過程中,降溫速率與保護劑濃度間存在一定對應(yīng)關(guān)系,降溫速率越高,實現(xiàn)玻璃化所需要的CPAs濃度越低。理論顯示,當(dāng)冷卻速度大于106℃/s時,甚至純凈水也可以實現(xiàn)玻璃化[5]。提高降溫速率有兩種方法:1)提高傳熱系數(shù),如將液滴直接噴入液氮中或優(yōu)化載體傳熱特性。Y. S. Song等[6]發(fā)現(xiàn)液滴與液氮直接接觸時,液滴表面易形成一層氮氣膜,這層薄膜會降低熱傳遞效率,降溫速率并未得到明顯提升。采用優(yōu)化載體傳熱特性的方法,如石英毛細管法,對胚胎干細胞玻璃化,降溫速率高于105℃/min,在較低的CPAs濃度下,如2 mol/L丙二醇和0.5 mol/L海藻糖即可實現(xiàn)玻璃化[5,7-8];2)通過降低微滴體積提高降溫速率。研究表明,當(dāng)微滴尺寸降低至0.1 uL時,微滴從表面到中心的降溫速率均超過105℃/min[9-10],能成功實現(xiàn)玻璃化。

最小體積法玻璃化保存,即通過降低微滴體積實現(xiàn)玻璃化。微滴體積足夠小時,可顯著提高降溫速率,減少玻璃化所需的CPAs濃度,有助于提高保存后細胞的活性和功能。本文綜述了最小體積法玻璃化保存的最新研究進展,包括有載體的微滴玻璃化保存、噴射微滴玻璃化保存、生物打印微滴玻璃化保存、微流體封裝微滴玻璃化保存。其中,噴射微滴玻璃化保存、生物打印微滴玻璃化保存及微流體封裝微滴玻璃化保存,是將新型的微滴產(chǎn)生技術(shù)與玻璃化保存技術(shù)相結(jié)合。因其能迅速產(chǎn)生大小均勻的微滴,具有高通量的特點[9-11],在低溫保存領(lǐng)域具有很好的發(fā)展前景。

1 有載體的微滴玻璃化保存

目前,最小體積法玻璃化保存的研究大都集中于有載體的微滴玻璃化保存,如開放式拉伸麥管法(open pulled straw,OPS)[1],半麥管法(Hemi-straw)[8],冷凍環(huán)法(Cryoloop)[8],石英毛細管法(quartz microcapillary,QMC)[3],Cryotop法[8],電鏡銅網(wǎng)法(electron microscopic grids,EMG)[12]等,如圖1所示?;谳d體的微滴玻璃化保存需靠載體影響傳熱,因此載體的選擇至關(guān)重要,通常選導(dǎo)熱性良好的材質(zhì)。通過合理設(shè)計載體幾何結(jié)構(gòu),使所容納的冷凍液體積盡可能少,以提高降溫速率。如EMG是以銅紗網(wǎng)作為冷凍載體,冷凍時,將小于1 uL含細胞的微滴滴在銅紗網(wǎng)上,然后將其直接投入液氮中以實現(xiàn)高的冷凍速率,冷卻速率約為3 000 ℃/min[13]。OPS[14]是利用虹吸原理將含有細胞的微滴吸入拉伸麥管細端,然后快速投入液氮中進行冷凍,降溫速率約16 000 ℃/min。Hemi-straw是將0.25 mL的麥管開口端剪成長1 cm,寬0.5 mm的薄片,冷凍時將含有細胞的冷凍液直接移到薄片上,該方法克服了OPS易漂浮的缺點。由于冷凍液與液氮接觸面增加,降溫速率明顯提升,超過20 000 ℃/min[12,15-16]。Cryotop采用一個很窄的塑料薄膜帶作為冷凍載體,連接一根硬塑料桿作為手柄,并帶有一個安全帽。冷凍時,含有細胞的微滴被加載在薄膜帶上,然后用毛細管將細胞周圍的溶液全吸走,直到留一層薄薄的膜足夠覆蓋細胞,迅速插入液氮冷凍。采用這種方法降溫速率可達40 000 ℃/min[17-19]。QMC是選取傳熱速率更好的石英材料制作微管,管外徑為0.2 mm,厚度為0.01 mm,可實現(xiàn)更快的降溫速率,超過250 000 ℃/min[5]。 Cryoloop是借助表面張力在尼龍線圈上形成一層冷凍液薄膜,由于缺少固體物的支持,樣本降溫速率高達700 000 ℃/min[20-21]。

(a)拉伸麥管法OPS[1];(b)半麥管法Hemi-straw[8];(c)冷凍環(huán)法Cryoloop[8];(d)石英毛細管法QMC[3];(e)Cryotop法[8];(f)電鏡銅網(wǎng)法EMG [12]。圖1 有載體的微滴玻璃化保存方法Fig.1 Methods of carrier-based droplets vitrification preservation

有載體的微滴玻璃化保存主要應(yīng)用于卵母細胞和胚胎的玻璃化保存。采用不同載體玻璃化保存的結(jié)果,如表1所示。可知玻璃化保存卵母細胞時,不同載體對卵母細胞的保存效果有很大差異。如 M. Kuwayama等[17-18]對牛卵母細胞玻璃化保存,相較于OPS,采用Cryotop保存的卵母細胞受精率和囊胚發(fā)育率更高,且紡錘體結(jié)構(gòu)和染色體形態(tài)更正常。J. K. Choi等[22]采用QMC玻璃化保存卵母細胞,相較于采用Hemi-straw[16],所用的CPAs濃度降低,且保存后卵母細胞的發(fā)展?jié)摿Ω?。有載體的微滴玻璃化保存也可用于干細胞等小體積細胞,如He Xiaoming等[5]采用QMC玻璃化保存鼠胚胎干細胞。但每次僅可對少量的細胞進行玻璃化保存,且均需手動操作,對用于再生醫(yī)學(xué)和組織工程等臨床需求量較大的細胞,有載體的微滴玻璃化保存方法往往不可行,應(yīng)用范圍受限。

表1 有載體的微滴玻璃化保存結(jié)果Tab.1 The results of carrier-based droplets vitrification

注:表中v/v為體積分數(shù),w/v為質(zhì)量濃度。

2 噴射微滴玻璃化保存

噴射微滴玻璃化保存,是利用裝置的噴嘴將含有細胞的懸浮液離散成微滴,然后在液氮中進行玻璃化保存。采用此方式噴射出的微滴呈無序狀態(tài)。U. Demirci等[23-26]曾提出采用聲學(xué)驅(qū)動微機械噴射器產(chǎn)生液滴,該噴射陣列的每個元素均由一個彎曲單晶硅圓薄膜構(gòu)成,膜中心刻蝕一個孔。通過聲波驅(qū)動壓電換能器,使膜發(fā)生共振位移,即可噴射出微滴。采用該裝置進行水噴射實驗,在0.47、1.24、2.26 MHz頻率下操作,產(chǎn)生的液滴直徑相應(yīng)為6.5、5.0、3.5 μm。該裝置產(chǎn)生的微滴尺寸微小,但缺點是當(dāng)噴射液體濃度增大時易導(dǎo)致噴嘴堵塞。隨后,U. Demirci等[27]又提出一種開放式無噴嘴噴射系統(tǒng)。該裝置由交錯的金屬環(huán)按需產(chǎn)生聲波,聲波在微流道中空氣和流體之間的界面聚焦,產(chǎn)生液滴。該裝置可產(chǎn)生直徑約37 μm的微滴,成功應(yīng)用于胚胎干細胞、成纖維細胞、AML-12肝細胞、人類Raji細胞和HL-1心肌細胞等不同類型細胞,且噴射后細胞活性均超過89.8%。裝置每秒可生成10 000個微滴,具有高通量特點。但是由于該裝置為開放式聚焦,聲波不宜形成徑向耦合,因此不利于穩(wěn)定噴射。

J. Samot等[28]提出了納升級噴射微滴玻璃化保存系統(tǒng)。該系統(tǒng)由氮氣流輸送裝置、已加載CPAs的細胞懸浮液注射裝置、薄膜收集裝置三部分構(gòu)成。噴嘴由200 μL移液槍頭和27G斜口針頭制作而成。其制作步驟是,距槍頭尖端2 cm處從側(cè)面插入27G針頭,槍頭尖端切去2 mm,針頭露出尖端2 mm。槍頭敞口端連接內(nèi)徑3.2 mm的連接管輸入氮氣流;27G針頭端輸入已加載好CPAs的細胞懸浮液,懸浮液注射速度由微注射泵控制。進行噴射實驗時,由氮氣流和含有細胞的懸浮液構(gòu)成共流,利用氮氣流將含有細胞的懸浮液吹打成微滴。產(chǎn)生的微滴用直徑8.5 cm聚乙烯薄膜接收,然后用鑷子夾取薄膜放入液氮中進行玻璃化。R. E. Assal 等[29]將該系統(tǒng)應(yīng)用于紅細胞玻璃化保存,研究氮氣流速、懸浮液注射速度、聚乙烯薄膜接收位置三個參數(shù)對微滴大小的影響。發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)獨饬魉僭O(shè)置為3 L/min、注射泵流速設(shè)置為200 μL/min、聚乙烯薄膜距噴嘴6~9 cm處時,此時收集到的液滴尺寸最小,微滴直徑(55±14) μm。然后將噴有微滴的聚乙烯薄膜浸入無菌液氮中進行玻璃化保存,結(jié)果顯示,在低濃度保護劑4.5%(v/v)四氫嘧啶中,含有紅細胞的微滴即可實現(xiàn)玻璃化,且復(fù)溫后細胞活性較高。Zhang X.等[30]將該系統(tǒng)應(yīng)用于卵母細胞保存,實現(xiàn)了卵母細胞的玻璃化保存。當(dāng)實驗條件設(shè)置氮氣流速為0.8 L/min時,可產(chǎn)生最優(yōu)尺寸的液滴,直徑為(140±58) μm。結(jié)果表明,減小微滴體積能降低玻璃化保存時所需的CPAs濃度,在1.4 mol/L乙二醇、1.1 mol/L DMSO和1 mol/L蔗糖條件下,即可實現(xiàn)卵母細胞玻璃化。采用該系統(tǒng)保存卵母細胞,細胞存活率較高,且孤雌激活后分裂率達96%,囊胚率達26%。

噴射微滴玻璃化保存系統(tǒng)產(chǎn)生的微滴足夠小,將其直接噴入液氮,降溫速率可明顯提升。冷卻速率超過105℃/min,是塑料麥管冷凍速率的40倍??擅黠@降低玻璃化保存時所需的CPAs濃度,避免了高濃度保護劑對細胞造成的滲透損傷和毒性損傷。然而,該系統(tǒng)尚存在不足之處,如R. E. Assal等[29]提出的系統(tǒng),僅用一個直徑為8.5 cm的聚乙烯薄膜接收含紅細胞的液滴,每次能夠處理的細胞量僅為80 μL。若單次接收時間過長,則會造成微滴疊加,微滴體積的增大不利于玻璃化保存。Zhang X.等[30]采用噴射微滴玻璃化保存卵母細胞時,易造成細胞丟失。

3 生物打印微滴玻璃化保存

生物打印技術(shù)是對生物材料,如活細胞、生長因子、基因、藥物等進行打印的一種技術(shù),可產(chǎn)生有序微滴。按驅(qū)動機制不同,可分為壓電噴墨打印、熱式打印、基于閥門打印、激光直寫打印、激光轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)打印等?,F(xiàn)已成功應(yīng)用于組織三維重建、再生醫(yī)學(xué)移植和診斷、藥劑學(xué)及高通量篩選、癌癥研究等[31]多個領(lǐng)域,并已逐步拓展到醫(yī)用低溫保存領(lǐng)域。

基于生物打印技術(shù),Xu Feng等[32]自主設(shè)計細胞打印機。該打印機以氣動壓力作為驅(qū)動機制,通過調(diào)節(jié)電磁閥開啟時間來控制微滴大小。實驗采取160滴每秒的速度對胚胎干細胞進行打印,通過合理控制液滴尺寸、細胞濃度及培養(yǎng)時間,最終形成統(tǒng)一尺寸的擬胚體。Shi Meng等[33]采用Xu Feng等[32]的打印技術(shù),設(shè)計了一款非接觸式玻璃化裝置。該裝置由細胞室、液氮室及中間的一層150 μm超薄高導(dǎo)熱速率銀膜構(gòu)成。實驗時,先采用Xu Feng等[32]的細胞打印機,將氣動壓力設(shè)定為0.03 MPa,在細胞室形成一個8×8的均勻液滴矩陣。然后向液氮室注入液氮,利用液氮沸騰和超薄銀膜熱傳遞,即可迅速實現(xiàn)細胞玻璃化。該裝置已成功實現(xiàn)NIH3T3細胞和hASCs細胞玻璃化保存,且避免了液氮對細胞造成的潛在污染。噴墨打印是利用壓電元件驅(qū)動流體體積壓縮,儲液罐內(nèi)壓力增加,導(dǎo)致細胞懸浮液通過噴嘴噴出微滴。U. Demirci等[34-35]基于噴墨打印技術(shù)開發(fā)出新型的生物打印裝置。裝置利用脈沖激勵時間控制微滴生成,產(chǎn)生的微滴均垂直滴入下方液氮中玻璃化。凍存細胞用直徑70 μm的細胞篩收集,并迅速轉(zhuǎn)移到解凍液中解凍。結(jié)果顯示,用類似于慢速冷凍所用的低濃度低溫保護劑,1.5 mol/L丙二醇和0.5 mol/L海藻糖即可實現(xiàn)玻璃化,復(fù)溫后細胞存活率超過90%。目前,該方法已經(jīng)成功應(yīng)用于多種動物細胞類型的玻璃化保存,如鼠肝細胞、3T3成纖維細胞、HL-1心肌細胞、小鼠胚胎干細胞和淋巴母細胞[34]。R. Dou等[36]同樣采用噴墨打印技術(shù),將含有小鼠成纖維細胞3T3和人類神經(jīng)祖細胞的懸浮液,以9×9的矩陣形式打印在聚合物底板上,微滴體積約380皮升,然后轉(zhuǎn)移到溫度為293 K的冰箱內(nèi)玻璃化。用DMSO作抗凍劑對3T3細胞進行玻璃化實驗,結(jié)果顯示解凍后細胞平均活性大于90%,所需的CPAs濃度小于0.8 mol/L。與其他玻璃化保存方法相比,所需的CPAs濃度明顯降低。對人類神經(jīng)祖細胞進行玻璃化保存,復(fù)蘇后細胞活性僅55%,但與采用傳統(tǒng)方法所獲得的細胞存活率具有可比性,所需的CPAs濃度也明顯降低。

生物打印技術(shù)能迅速產(chǎn)生大小均勻的液滴,精準(zhǔn)控制液滴噴射位置和方向,具有簡單性和敏捷性。然而在低溫保存領(lǐng)域,生物打印技術(shù)的應(yīng)用仍存在挑戰(zhàn),如生成微滴時,剪應(yīng)力、毛細管力等機械力均可能引起細胞變形;將細胞打印到接收面時,接觸面對細胞的沖擊力易造成細胞損傷等。因此,采用生物打印微滴玻璃化保存時,還需進一步優(yōu)化方案,如選擇合適的微滴產(chǎn)生機制、選擇具有生物相容性的噴頭及合理設(shè)計接收面等。

4 微流體封裝微滴玻璃化保存

微流體液滴生成技術(shù)是指將兩種不相融的流體,一種作為連續(xù)相,另一種作為分散相,將分散相以微小體積(10-15~10-9L)單元形式分散于連續(xù)相中,在表面張力與剪切力共同作用下,自發(fā)形成微滴[37]。微滴生成方式可分為被動法和主動法,被動法是通過控制微管道結(jié)構(gòu)及兩相流速來控制微滴生成;主動法是通過外場驅(qū)動力,如熱量、氣壓、壓電、微閥和磁場等,來生成微滴[38]。目前微流體技術(shù)已成功應(yīng)用于DNA、蛋白質(zhì)、酶的生化分析及細胞的篩選、病毒檢測等多個領(lǐng)域,逐步拓展到玻璃化保存領(lǐng)域。

Huang Haishui等[39]設(shè)計了一款5個入口的微流體聚焦裝置,由此制備細胞微膠囊。通道中間入口注含有細胞的懸浮液,兩側(cè)注海藻酸水溶液,利用海藻酸水溶液將細胞限制在所生成的微膠囊內(nèi)部。距聚焦口最近的兩側(cè)通氯化鈣溶液,運用瑞利-高原不穩(wěn)定性,含有細胞的懸浮液被連續(xù)流動的氯化鈣溶液封裝成微滴。在該流動條件下,形成的微滴具有高分散性,微膠囊直徑約220 μm。研究表明,少量的鈣離子能增加藻酸鹽基質(zhì)強度,有助于保持微膠囊玻璃化保存后的完整性[40]。采用該裝置封裝小鼠胚胎干細胞(mESCs)和人類脂肪干細胞(hADSCs)。于通道末端收集細胞微膠囊,然后用QMC法和OPS法玻璃化保存。結(jié)果表明,用1.5 mol/L丙二醇和0.5 mol/L海藻糖作為低溫保護劑即可實現(xiàn)玻璃化,且復(fù)溫后細胞活性大于80%。通過低溫顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)海藻酸鹽微膠囊能有效抑制復(fù)溫后反玻璃化現(xiàn)象發(fā)生。在采用微流體技術(shù)封裝細胞時,保證每個微滴中所含細胞數(shù)的均勻性是該技術(shù)的關(guān)鍵。M. Chabert等[41]設(shè)計了一種T型微流控裝置,該裝置運用純粹的動力學(xué)方法,在沒有任何外部傳感及反饋控制下,即可將細胞封裝成皮升級微滴。通道中間入口通含細胞的培養(yǎng)基,左右兩側(cè)通入油,以油作為連續(xù)相,在剪切流中可變形物體的橫向漂移和擠壓流中立體驅(qū)動分散作用下,每秒可對160個細胞進行連續(xù)封裝和排序。結(jié)果表明,封裝的微滴中僅含有一個細胞的純度為70%~80%,僅有1%的微滴可能為空液滴。J. F. Edd等[42]采用同樣的裝置對細胞進行封裝排序,并檢測細胞活性,92.9%的細胞膜保持完整性,對照組為96.2%。裝置每秒可產(chǎn)生14.9×103個皮升級液滴,明顯具有細胞封裝微滴體積小、通量高的特點。此外,在實現(xiàn)微流控芯片一體化方面,A. E. Sgro等[43]曾嘗試在微流體芯片上直接對B淋巴瘤細胞封裝冷凍。他提出在T型微通道的蛇形通道下游放置熱電制冷器,利用水溶液和不混溶油冰點差別大,通過熱電制冷器控制微流控芯片的部分溫度,直接凍結(jié)芯片上的微滴。該裝置在微流體芯片封裝微滴玻璃化保存一體化結(jié)構(gòu)設(shè)計上具有啟發(fā)性。

微流體封裝液滴玻璃化保存具有細胞封裝效率高、微滴體積小的優(yōu)點。然而,目前微流體封裝微滴玻璃化保存相關(guān)研究尚處于起步階段,仍面臨諸多挑戰(zhàn),如封裝的微滴體積可達到皮升級,易造成細胞缺氧,針對此問題,一種包含空氣供應(yīng)和多噴嘴出口的三維微流體裝置[44]正在研發(fā)中。在材質(zhì)選擇上,微流體芯片選用具有疏水性的聚二甲基硅氧烷制作,但仍面臨導(dǎo)熱受限,無法在芯片上直接實現(xiàn)玻璃化的問題。

5 總結(jié)與展望

最小體積法玻璃化保存為細胞長期有效儲存提供重要手段。本文綜述了最小體積法玻璃化保存的最新研究進展,包括有載體的微滴玻璃化保存、噴射納升級微滴玻璃化保存、生物打印微滴玻璃化保存、微流體封裝微滴玻璃化保存。其中,新型的微滴生成技術(shù),如噴射技術(shù)、生物打印技術(shù)、微流體封裝技術(shù),可迅速產(chǎn)生大小均勻、尺寸微小的液滴。將其與玻璃化保存相結(jié)合,有望解決高通量問題,且滿足自動化要求,將是未來最小體積法玻璃化保存的發(fā)展趨勢。

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