劉 鳴 王大英 張文全 徐佑龍 金惠根 劉宗軍

(上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院心內(nèi)科 上海 200062)

急性心肌梗死是臨床常見的危重癥,對急性閉塞血管行再灌注治療是挽救缺血心肌及改善臨床預后最有效的方法,但同時也會造成心肌的缺血再灌注損傷(ischemic-reperfusion injury,IRI),嚴重影響療效。不論是血流中斷、缺氧引起的心肌細胞壞死,還是再灌注后的氧化應激等機制引起的心肌損傷,或是本身即富含炎癥免疫成分的血流灌注,以上早期即可引發(fā)局部及全身的非特異性炎癥免疫反應,貫穿并直接影響心肌損傷及修復的全過程[1-3]。單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞(dendritic cell,DC)等炎癥細胞是IRI相關(guān)炎癥免疫反應的關(guān)鍵環(huán)節(jié),是識別損傷、調(diào)節(jié)免疫炎癥反應的主體[4]。早在1993年Zhang等[5]在大鼠心肌梗死模型的免疫組化研究中發(fā)現(xiàn)缺血梗死的心肌邊緣有大量DC浸潤,臨床研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死急性期患者外周血DC急劇減少[6-7],與早期預后有關(guān);但DC在梗死心肌的定量分析、在總體炎癥細胞中所占比例以及與時間相關(guān)的變化規(guī)律,仍缺乏相關(guān)研究。針對這一問題,我們采用小鼠心臟單個細胞懸液制備方法,在小鼠心臟IRI模型中對心肌DC進行定量分析,選擇CD11c作為流式細胞檢測的特異性標記,同時研究單核細胞的Ly6C標記,以期為IRI的相關(guān)免疫炎癥反應這一龐大炎癥機制網(wǎng)絡(luò)提供重要補充。

材 料 和 方 法

材料實驗動物:10～12周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠,由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供(批準號:SCXK滬2012-0002)。主要試劑及儀器:RPMI-1640培養(yǎng)基、膠原酶Ⅰ購自美國Gibco公司,DNase Ⅰ購自美國MBI公司,流式細胞抗體PE-Cy5 anti-mouse CD45、PE anti-mouse CD11c及同型對照購自美國eBioscience公司,FITC Rat Anti-Mouse Ly6C及同型對照購自美國BD公司;流式細胞儀購自美國BD公司。

動物模型制備小鼠經(jīng)乙醚麻醉后行氣管插管,連接呼吸機,設(shè)定呼吸機潮氣量200～300μL,頻率120次/min,連接心電圖。取左前胸部切開,逐層分離皮下組織,在第3肋間用胸廓撐開器暴露手術(shù)視野,打開心包,暴露心臟,以左心耳及肺動脈圓錐為標志尋找前降支,以8-0絲線在左心耳下1～2 mm處進針。假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎,IRI手術(shù)組穿線后繞兩圈打一個活結(jié),肉眼觀察結(jié)扎線至心尖部位的心肌變蒼白,活動減弱,心電圖出現(xiàn)特征性ST段抬高并與增寬的QRS波群融合,說明結(jié)扎成功。留取較長的活結(jié)線頭至胸外以備松解?？p合胸壁后繼續(xù)呼吸機輔助呼吸及乙醚麻醉,結(jié)扎30 min后拉胸外的活結(jié)線頭進行松解,心電圖ST段逐漸回落,證明心臟IRI模型制備成功(圖1)。分別在再灌注1、2、4和7天時摘取小鼠心臟制備心臟單個細胞懸液。每個實驗組3～7只小鼠。

心肌單個細胞懸液制備配置心臟消化液:在RPMI-1640培養(yǎng)基溶液,加入1.6 mg/mL膠原酶Ⅰ和0.2 mg/mL DNase,每個心臟標本用量約11 mL。小鼠心臟摘取后PBS沖洗去除血液,于2 mL離心管中加入1 mL心臟消化液,盡量剪碎;移至15 mL離心管中,加入10 mL心臟消化液,室溫放置60 min,間斷混勻。140目濾網(wǎng)過濾,收集濾過液于15 mL離心管中,114×g離心10 min,去上清,加入200μL PBS懸浮+2 mL紅細胞裂解液放置5 min,114×g離心5 min,去上清后用1 mL PBS懸浮。對心肌單個細胞懸液行細胞計數(shù)。

圖1 正常、缺血及再灌注小鼠心電圖

流式細胞檢測與分析策略以CD45標記白細胞(圖2A),選取CD45陽性細胞進一步以CD11c和Ly6C標記細胞亞群(圖2B,縱軸CD11c,橫軸Ly6C)。取200μL懸浮液同時加入CD45、CD11c、Ly6C抗體或同型對照,10 min后PBS洗1次,避光待流式細胞檢測,同型對照管只在最初測試抗體特異性時設(shè)置。獲取200 000～700 000個細胞(根據(jù)其中CD45陽性細胞比例調(diào)整)。

A:Leukocyte;B:DCs and monocyte subpopulation.

圖2假手術(shù)組及心臟IRI組術(shù)后不同時間點小鼠心臟單個細胞懸液的流式細胞檢測圖
Fig2Flowcytometryforsinglecellsuspensionsfrommice’sheartinthesham-operatedgroupandcardiacIRIgroupatdifferenttimepoints

結(jié) 果

細胞計數(shù)每個心臟標本制備所得的單個細胞懸液獲得的細胞總數(shù)為(1～2)×106個。

各組細胞的比例變化CD45陽性細胞占心肌細胞的比例、CD45陽性細胞中CD11c和Ly6C標記的4組細胞的相對比例如表1所示。對假手術(shù)組、不同缺血再灌注時間的IRI組進行組間比較,結(jié)果顯示以下指標在組間具有顯著差異:CD45細胞比例、CD11c+Ly6C-、CD11c+Ly6C+、CD11c-Ly6C+細胞相對比例(表1);CD11c-Ly6C-細胞相對比例在組間未見差異有統(tǒng)計學意義。變化規(guī)律如下:(1)CD45陽性細胞占總細胞數(shù)的比例在再灌注1天時即達到高峰,之后逐漸恢復至對照組水平(其中1天時為13.88%,較對照組的0.90%,P<0.05;2、4和7天時與對照組間差異無統(tǒng)計學意義。(2)CD45陽性細胞群中CD11c和Ly6C標記的細胞亞群的相對比例不同。對照組CD11c+Ly6C+細胞相對比例最低為6.87%、CD11c-Ly6C+最高為56.72%。小鼠心臟IRI模型中CD11c+Ly6C+DC動態(tài)變化最為明顯,持續(xù)升高(1、2和4天與對照組相比,P均<0.05),7天時恢復至對照組水平(P>0.05);與之相反,CD11c-Ly6C+單核細胞比例在再灌注后降低(2和4天分別與對照組相比,P均<0.05),7天時恢復至對照組水平(P>0.05);CD11c+Ly6C-DC相對比例的變化呈降低后再升高的趨勢(2和4天分別較1天升高,P均<0.05),7天時恢復至對照組水平(P>0.05);CD11c-Ly6C-細胞無顯著變化(組間比較P>0.05)。再灌注2天時CD11c+Ly6C-、CD11c+Ly6C+、CD11c-Ly6C+約各占CD45陽性細胞的1/3。

LeukocyteShamIRI 1 dIRI 2 dIRI 4 dIRI 7 dχ2PCD45+0.90±0.2513.88±10.70(1)10.68±3.863.44±1.610.87±0.5117.620.001Q1 (CD11c+Ly6C-)25.58±15.7011.73±1.8429.06±5.3640.73±9.0921.00±5.5812.590.013Q2 (CD11c+Ly6C+)6.87±3.3230.53±3.70(1)32.74±4.09(1)19.80±1.21(1)6.46±1.3018.250.001Q3 (CD11c-Ly6C+)56.72±19.9050.03±5.0830.36±5.00(1)30.80±9.77(1)57.83±5.8614.300.006Q4 (CD11c-Ly6C-)10.81±4.237.72±2.157.84±1.768.68±0.8814.70±3.247.550.109

(1)vs.Sham,P<0.05.

各組細胞占總細胞數(shù)的百分比變化CD11c、Ly6C標記的4組細胞在總心肌細胞中的百分比,即各組在CD45陽性細胞中的相對比例×CD45陽性細胞在總心肌細胞比例。對假手術(shù)組和不同時間點的IRI組進行組間比較,結(jié)果顯示各細胞亞群在總心肌細胞中的百分比差異均有統(tǒng)計學意義。再將IRI不同時間點的各組細胞亞群百分比與假手術(shù)組進行兩兩比較,在1～2天較對照組均有顯著升高(P<0.05),除1天時CD11c-Ly6C+單核細胞的7.06%較對照組的0.50%有升高趨勢(P=0.05,表2),各組的達峰時間在1～2天,7天時恢復至對照組水平(圖3)。

LeukocyteShamIRI 1 dIRI 2 dIRI 4 dIRI 7 dχ2PCD45+0.90±0.2513.88±10.70(1)10.68±3.863.44±1.610.87±0.5117.620.001Q1 (CD11c+Ly6C-)0.24±0.171.63±1.233.05±1.01(1)1.49±0.980.18±0.0916.910.002Q2 (CD11c+Ly6C+)0.06±0.034.18±3.11(1)3.46±1.240.69±0.370.05±0.0218.010.001Q3 (CD11c-Ly6C+)0.50±0.167.06±5.953.33±1.680.96±0.110.36±0.2118.430.001Q4 (CD11c-Ly6C-)0.096±0.0391.01±0.69(1)0.83±0.320.3±0.160.068±0.03916.940.002

(1)vs.Sham,P<0.05.

圖3 各組細胞占總細胞數(shù)的百分比變化Fig 3 Percentage of cell populations in total heart cells in the sham-operated and IRI mice

討 論

本實驗首次通過制備心肌組織的單個細胞懸液對小鼠心臟IRI模型的心肌DC進行了定量分析,經(jīng)流式細胞檢測明確其隨時間的變化規(guī)律。以CD45標記缺血損傷時浸潤心肌的白細胞,再以CD11c和Ly6C雙標記研究了浸潤細胞中的DC和單核細胞的標記漂移情況,定量、直觀、動態(tài)地表現(xiàn)出了心肌缺血1周的標記轉(zhuǎn)變。對照組小鼠的心肌單個細胞懸液中白細胞比例低(CD45陽性比例0.9%),以CD11c+和Ly6C+單陽性細胞為主(CD11c-Ly6C+占56.72%、CD11c+Ly6C-占25.58%、CD11c+Ly6C+占6.87%、CD11c-Ly6C-占10.81%)。IRI后CD45+細胞比例明顯增加(術(shù)后1天時13.88%),Ly6C和CD11c標記的4組細胞比例幾乎均顯著升高,1～2天時達峰,7天時恢復正常水平;在CD45+細胞中,CD11c和Ly6C雙標記的細胞亞群分析提示Ly6C+CD11c+雙陽性細胞升高最為明顯,相對比例在對照組為6.87%,術(shù)后2天時升至峰值32.7%,術(shù)后2天時和4天的相對比例亦均較對照組小鼠顯著升高,其他各細胞亞群的相對比例未見升高;由于該組細胞急劇升高,Ly6C+、CD11c+單陽性細胞的相對比例有下降,各組的相對比例在7天時恢復至對照組水平。CD11c+Ly6C+雙陽性細胞的急劇變化也是本研究的重要發(fā)現(xiàn)。

既往研究發(fā)現(xiàn),成年小鼠心臟消化后經(jīng)流式細胞檢測約56%為心肌細胞,27%為成纖維細胞,10%為血管平滑肌細胞,7%為內(nèi)皮細胞,而免疫炎癥細胞比例極低[8]。心肌缺血等損傷后白細胞向局部聚集浸潤,數(shù)量明顯增多。在本實驗中小鼠心臟缺血再灌注模型的心肌CD45陽性細胞計數(shù)在1天時達到高峰,達到對照組10余倍,之后減少,7天時恢復正常;在這一過程中CD11c+DC在心肌中也明顯增加,CD11c+Ly6C+細胞亞群在術(shù)后2天時達到峰值,提示DC在早期即參與IRI相關(guān)的免疫炎癥反應。既往小鼠心梗模型的心肌免疫熒光染色提示CD11c+DC在心梗后3天時增多,7天時達到高峰[9],較此次IRI模型中的達峰時間明顯延遲,考慮與不同的動物模型有關(guān)(心梗與缺血再灌注);病理研究提示DC主要聚集在梗死心肌及梗死邊緣,非梗死區(qū)域的心肌DC并無增加[5,9],心梗和IRI模型的心肌改變均為局灶性,既往心梗動物模型的DC分布規(guī)律可供參考,本實驗中未包括病理學研究。由于病理學研究易受取材誤差干擾,且無法選擇多種抗體標記,故本研究選擇將小鼠的完整心臟消化后獲得單個細胞懸液行流式細胞檢測,可以更為精確地對目的細胞亞群進行區(qū)分及定量研究。

缺血損傷相關(guān)的免疫炎癥反應中DC的來源、標記、功能仍存在爭議。心肌DC的來源可能為自外周遷移或細胞間相互轉(zhuǎn)換。動物實驗中經(jīng)嵌合體方法發(fā)現(xiàn)心梗后心肌CD11c+DC主要為自外周血遷移,去除DC導致心梗后28天小鼠的心功能下降,伴有白細胞、巨噬細胞、單核細胞的浸潤增多,促炎因子分泌增多,提示DC對心梗后炎癥反應、心肌重構(gòu)具有保護作用[9]。小鼠腦IRI模型中發(fā)現(xiàn)24 h時缺血壞死腦組織邊緣的DC增多,主要為組織內(nèi)固有的DC[10]。小鼠腎臟IRI模型研究則發(fā)現(xiàn)DC的促炎功能,證實同時表達巨噬細胞標記F4/80的DC是早期分泌TNF-α的主要來源[11]。我們的研究提示IRI相關(guān)炎癥發(fā)生后CD11c陽性細胞增多,細胞表面標記發(fā)生急劇變化;對照組小鼠心臟CD11c+Ly6C-較CD11c+Ly6C+細胞多,前者是后者的3～4倍,IRI后24 h比例發(fā)生逆轉(zhuǎn),同時表達單核細胞標記Ly6C的DC (CD11c+Ly6C+)明顯增多,是前者的2～3倍,除了外周血向心肌組織的遷移,重疊的細胞表面標記也提示可能存在細胞間相互轉(zhuǎn)變。在感染或炎癥性疾病的動物實驗中發(fā)現(xiàn),局部浸潤的單核細胞可轉(zhuǎn)化為炎癥性DC,表面標記為MHCⅡ+CD11b+CD11c+F4/80+Ly6C+,它同時與炎癥部位聚集的其他細胞,如巨噬細胞、單核細胞及其他種類的DC,存在表面標記的部分重疊。炎癥性DC可大量合成TNFα和iNOS參與炎癥反應[12-13]。本研究結(jié)果顯示CD11c+Ly6C+在IRI相關(guān)炎癥時明顯增多,相對比例最高,流式細胞檢測圖(圖2)提示細胞亞群之間相互延續(xù),DC與Ly6C標記的單核細胞關(guān)系密切,故除了自外周遷移,細胞轉(zhuǎn)換也是可信的來源之一。雖然實驗中沒有進行全面的細胞表面標記研究,但CD11c+Ly6C+這樣的標記組合也指向炎癥性DC。

本研究明確了CD11c+DC在小鼠心臟IRI模型中的動態(tài)變化,同時研究了單核細胞表面標記Ly6C,結(jié)果提示CD11c+Ly6C+DC在早期即明顯增多,提示可能存在DC與單核細胞的轉(zhuǎn)化,DC參與IRI免疫炎癥的機制和功能還需要進一步的研究。