鄧 穎 史偉浩 童進東 王鐵平 喬正東 余 波

(1復旦大學附屬浦東醫(yī)院血管外科,3科創(chuàng)中心 上海 201399; 2復旦大學附屬華山醫(yī)院普外科 上海 200040)

血管內膜增生是血管重建術(如球囊擴張血管成形術、支架植入術、血管移植等)后常見且嚴重的并發(fā)癥之一,常導致手術失敗。探索有效抑制血管內膜增生的方法是解決問題的關鍵。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)是一種綠茶提取物,近年來國內外學者對EGCG的作用機制進行了大量的研究,結果顯示EGCG具有抗炎癥反應、抗血管動脈粥樣硬化以及有效抑制腫瘤細胞侵襲和增殖等作用[1]。Lee等[2]研究發(fā)現EGCG能強有效地抑制血小板源性生長因子-BB (platelet-derived growth factor BB,PDGF-BB)刺激誘導的血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的有絲分裂。Orozco-Sevilla等[3]研究發(fā)現EGCG可以有效地阻止大鼠頸動脈損傷后的內膜增生。然而,對于EGCG抑制VSMC增殖和遷移的具體機制目前尚不明確。本研究擬觀察EGCG對PDGF-BB誘導的VSMC增殖和遷移的影響,并探索其可能的機制。

材 料 和 方 法

試劑與儀器DAPI(上海碧云天公司),多聚甲醛(國藥集團),胰蛋白酶、FBS、3%戊巴比妥鈉、DMEM(美國Gibco公司),青霉素-鏈霉素溶液(美國Sigma公司),α-球蛋白單克隆抗體(美國Dako Cytomation公司),山羊抗鼠IgG (美國Protein Tech Group公司),光學顯微鏡(德國Leica公司),SD大鼠(上海斯萊克動物公司),RTCAxCELLigence細胞功能分析儀DP系統,增殖實驗板E-Plate16,遷移實驗板CIM,CIM板夾具,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱(德國Eppendorf公司),PDGF-BB(以色列ProSpec-Tany TechnoGene公司),EGCG(美國ApexBio公司),α-氰基-(3,4-羥基)N-芐苯乙烯胺(AG490,美國Med Chem Express公司),Western blot及IP細胞裂解液(上海威奧生物科技有限公司)。抗體Jak2,Stat3,P- Stat3,Cyclin D1及二抗,HRP抗體(美國CST公司),ECL顯影液(美國Advansta公司),Omega Lum G凝膠成像系統(Omega Lum G,美國Aplegen公司)。

大鼠胸主動脈原代VSMC的提取與鑒定選取80～100 g雄性SD大鼠(清潔級),貼塊法分離培養(yǎng)胸主動脈中膜VSMC于10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中。待細胞生長后,用0.25%胰蛋白酶消化傳代,傳至3代進行細胞免疫熒光染色鑒定。

檢測EGCG對PDGF-BB誘導VSMC增殖的影響于實驗前1天饑餓細胞12 h,設置對照組和實驗組:對照組,PDGF-BB 10ng/mL,PDGF-BB 10 ng/mL+EGCG 10 μmol/L,PDGF-BB 10ng/mL+EGCG 50 μmol/L,PDGF-BB 10 ng/mL+EGCG 100 μmol/L,PDGF-BB 10 ng/mL+AG490 50 μmol/L。向E-Plate16的孔中加入50 μL各組溶液,將增殖板E-Plate16放置于細胞功能分析儀(RTCA)自動掃描,檢測接觸是否良好;開始檢測基線,確定所選擇的孔接觸正常,所有孔的Cell Index低于0.063為正常。取出E-Plate16,每孔中加入100 μL混合均勻的VSMC懸液,使每孔中細胞數目每100 μL含5 000個細胞。將E-Plate16置于超凈臺中室溫放置30 min,放入培養(yǎng)箱中。在系統自動掃描后,開始檢測各實驗組VSMC增殖曲線。

檢測EGCG對PDGF-BB誘導VSMC遷移的影響實驗前1天饑餓細胞12 h,對照組和實驗組設置同前。CIM板下室的孔中加入165 μL各組PDGF-BB液體后,裝配CIM板上室,在上室的孔中加入30 μL無血清培養(yǎng)基。將裝配好的CIM板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中平衡1 h。檢測接觸是否良好,開始進行基線檢測,所有孔的Cell Index低于0.063為正常。在上室的孔中加入100 μL混合均勻的VSMC懸液,使每孔中細胞數目為100 μL含5 000個細胞;置于超凈臺室溫放置30 min,上機檢測。

細胞總蛋白提取和Westernblot檢測根據增殖及遷移實驗結果,設置實驗組為:對照組(-),PDGF-BB 10 ng/mL,PDGF-BB 10 ng/mL +EGCG 50 μmol/L,PDGF-BB 10 ng/mL +AG490 50 μmol/L。其中對照組(-)和PDGF-BB 10 ng/mL+AG490 50 μmol/L實驗組干預時間為12 h,其他兩個實驗組干預時間為12 h和24 h。Western blot及IP細胞裂解液冰上裂解細胞,并加入PMSF,使其最終濃度為1 μmol/L。4 ℃條件下,轉速13×g,離心10 min后,取上清液。BCA法檢測蛋白濃度。取15 μL蛋白質樣品上樣,進行SDS-PAGE分離,轉印至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉2 h,加入對應一抗4 ℃孵育過夜,TBST清洗3次,1次10 min,加入二抗于室溫下孵育2 h,TBST清洗3次,ECL顯影液在凝膠成像系統顯影。

統計學分析采用SPSS 13.0統計軟件對結果進行分析,每項實驗均重復3次以上,各組間結果采用One-way ANOVA進行比較,以α=0.05 為檢驗水準。

結 果

大鼠胸主動脈原代VSMC鑒定細胞免疫化學染色后,顯微鏡下可見細胞胞質內大量與細胞長軸平行的纖維細絲,顏色為棕黃色,即為平滑肌 α肌動蛋白絲,且核形態(tài)卵圓形位置居中(圖1)。96%的VSMC肌動蛋白質表達陽性。免疫組化結果證實培養(yǎng)的細胞為VSMC且純度高,符合本次實驗所需細胞條件。

圖1 大鼠胸主動脈原代VSMC中α肌動蛋白的免疫化學染色(×200)Fig 1 Immunohistochemistry staining of α-SMA expression in primary VSMCs of thoracic aorta in rats (×200)

EGCG對PDGF-BB誘導VSMC增殖的影響xCELLigence RTCA細胞功能分析儀DP系統檢測結果顯示(圖2):實驗中各濃度EGCG持續(xù)干預12 h及24 h均能抑制PDGF-BB誘導的VSMC增殖(P<0.001);且50 μmol/L EGCG的抑制能力強于其他兩個濃度組(P<0.001);Jak2特異性抑制劑AG490明顯抑制PDGF-BB誘導的VSMC增殖(P<0.001);50 μmol/L EGCG的抑制能力強于AG490 (P<0.001)。

The cell index of EGCG and AG490 on the proliferation activity of VSMCs induced by PDGF-BB.The Cell Index was assessed with RCTA assay at 12 and 24 h after using EGCG and AG490.(1)P<0.001.

圖2EGCG和AG490干預后PDGF-BB誘導的VSMC增殖能力下降
Fig2TheabilityofVSMCsproliferationinducedbyPDGF-BBwasdescendedafterthetreatmentofEGCGandAG490

EGCG對PDGF-BB誘導VSMC遷移的影響xCELLigence RTCA細胞功能分析儀DP系統檢測結果顯示(圖3):實驗中各濃度EGCG持續(xù)干預12 h及16 h均能抑制PDGF-BB誘導的VSMC遷移(P<0.001);且50 μmol/L EGCG的抑制能力強于其他兩個濃度組(P<0.001);Jak2特異性抑制劑AG490明顯抑制PDGF-BB誘導的VSMC遷移(P<0.001);50 μmol/L EGCG的抑制能力強于AG490 (P<0.001)。

The cell index of EGCG and AG490 on the migration activity of VSMCs induced by PDGF-BB.The cell index was assessed with RCTA assay at 12 and 16 h after using EGCG and AG490.(1)P<0.001.

圖3EGCG和AG490干預后PDGF-BB誘導的VSMC遷移能力下降
Fig3TheabilityofVSMCsmigrationinducedbyPDGF-BBwasdescendedafterthetreatmentofEGCGandAG490

EGCG及AG490干預后細胞蛋白質水平Western blot檢測結果顯示:50 μmol/L EGCG的干預12 h及24 h后均能明顯下調PDGF-BB誘導后VSMC的Jak2蛋白質水平(圖4B,P<0.001);且EGCG干預12 h較干預24 h的作用更為明顯(圖4B,P<0.01);AG490能明顯下調VSMC的Jak2蛋白質水平(圖4B,P<0.001)。EGCG干預12 h能明顯下調PDGF-BB誘導后VSMC的Stat3蛋白質水平(P<0.001),且AG490能明顯下調VSMC的Stat3蛋白質水平(圖4C,P<0.001)。EGCG干預12 h及24 h后均能抑制VSMC的Stat3磷酸化水平,AG490能抑制VSMC的Stat3磷酸化水平(圖4D,P<0.001)。EGCG干預12 h及24 h后均能明顯下調PDGF-BB誘導后VSMC的Cyclin D1蛋白質水平(P<0.001),而AG490也能下調VSMC的Cyclin D1蛋白質水平,且EGCG下調VSMC的Cyclin D1蛋白質水平較AG490更為明顯(圖4E,P<0.001)。

討 論

動脈粥樣硬化性疾病已成為目前主要的死亡原因和致殘原因,也是心腦血管醫(yī)學面臨的長期而嚴峻的挑戰(zhàn)。目前,對于動脈粥樣硬化性疾病治療措施有開放手術治療(如頸動脈內膜剝脫術、冠狀動脈搭橋術、下肢血管自體及人工血管旁路移植術等)和微創(chuàng)治療,即血管腔內介入治療(如頸動脈支架植入術、冠脈球囊擴張血管成形術、冠脈支架植入術、下肢動脈球囊擴張血管成形術及下肢血管支架植入術等),而術后血管內膜增生所致的血管再狹窄是影響手術遠期通暢率的主要原因。有文獻報道在旁路移植術后1年內再狹窄或閉塞的發(fā)生率達30%～40%[4-5],而球囊擴張術后1年內再狹窄的發(fā)生率高達55.8%[6-7]。目前研究認為正常血管內膜損傷后VSMC增殖及遷移所致的內膜增生是血管再狹窄的主要原因,新生內膜的過程涉及一系列復雜的信號通路和生物效應,如炎癥、血栓形成、VSMC增殖遷移和細胞外基質沉積等[8-11]。

EGCG是一種綠茶提取物,近年來國內外研究者對EGCG的作用機制進行了大量的研究,結果顯示EGCG具有抗炎癥反應、抗血管動脈粥樣硬化以及強有效的抑制腫瘤細胞侵襲和增殖等作用,而這些作用可能涉及多種信號轉導通路,包括Jak/Stat、Mapk、PI3K/AKT等信號轉導通路[1,12]。而在血管內膜增生的過程中,Jak/Stat信號通路有重要的作用,有研究表明Jak2/Sak3參與調控大鼠頸動脈球囊損傷后的VSMC增殖過程,而Jak2特異性抑制劑AG490能有效地抑制Stat3的磷酸化水平,從而抑制VSMC的增殖以及內膜增生[13]。本研究中以PDGF-BB作為誘導劑刺激VSMC后,明顯上調了Jak2、Stat3蛋白質水平以及Stat3磷酸化水平,而Jak2/Stat3信號通路下游的Cyclin D1蛋白質水平也明顯上調,而加入AG490后上述蛋白質水平明顯被抑制,當利用EGCG干預后上述蛋白質水平也明顯下調,且EGCG對于Jak2、Stat3蛋白質水平以及Stat3磷酸化的下調與Jak2特異性抑制劑AG490相比較無明顯差異。EGCG對于Cyclin D1蛋白質水平的下調作用要強于AG490,其主要原因可能為EGCG同時抑制了其他信號轉導通路,具體機制需進一步深入研究。Orozco-Sevilla等[3]研究發(fā)現EGCG能抑制大鼠頸動脈球囊損傷后的內膜增生,本次研究結果與其一致,并提示機制可能是通過抑制Jak2/Stat3信號通路從而抑制VSMC增殖和遷移。

A:Western blot assay was performed to detect the protein expression of Jak2,Stat3,p-Stat3 and Cyclin D1 in VSMCs after the treatment of EGCG and AG490 and β-actin was used as an internal reference.B-E:Expression of protein Jak2,Stat3,p-Stat3 and Cyclin D1 (fold to control).(1)P<0.01.(2)P<0.001.

圖4EGCG和AG490干預后VSMC的Jak2,Stat3,Cyclin蛋白質表達以及Stat3蛋白質的磷酸化水平
Fig4TheproteinexpressionsofJak2,Stat3,CyclinD1andp-Stat3,proteinsinVSMCaftertreatmentwithEGCGandAG490

目前,針對抑制血管內膜增生進行了大量的研究,如藥物涂層支架的應用在一定程度上抑制了血管內膜增生,但是同時也延緩了血管內皮的修復,增加了遲發(fā)性血栓形成的可能性[14-15]。而EGCG作為一種植物提取物,安全性高,de la Torre等[16]利用EGCG加上認知訓練治療青少年唐氏綜合征,證明其安全有效。因此,深入研究EGCG抑制血管內膜增生的相關機制,將有助于為治療血管重建術后再狹窄提供新的方向。

綜上所述,本研究結果初步證明EGCG可能通過抑制Jak2/Stat3信號通路從而抑制VSMC細胞增殖和遷移。關于EGCG抑制血管內膜增生的研究大多數還處于細胞水平和動物水平,因此需要對其機制進行深入研究,以期為將來的臨床應用打下堅實的理論基礎。