馬 麗 余露山

(浙江大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室 杭州 310058)

CN128是由浙江大學(xué)藥學(xué)院藥物研究所自主研發(fā),于2017年經(jīng)CFDA批準進入臨床研究的一類新藥。CN128作為祛鐵藥物,適用于重型β型地中海貧血癥患者因治療過程中鐵元素隨輸血進入體內(nèi)產(chǎn)生的鐵過載癥,從而降低重型β型地中海貧血癥患者因鐵元素在心臟、肝、脾等臟器積累而造成的相應(yīng)臟器損傷、衰竭,甚至死亡[1-3]。根據(jù)中國藥典2015年版第四部通則0861中的規(guī)定,應(yīng)在CN128最終產(chǎn)物中檢測藥物生產(chǎn)過程中用到的所有有機溶劑的殘留量[4]。據(jù)此本研究建立了頂空GC法測定CN128中可能殘留的7種有機溶劑(乙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、環(huán)己烷和正庚烷)以及起始物料(氯化芐),共計8種。

材 料 和 方 法

儀器美國安捷倫6890N型氣相色譜儀和7694E型頂空進樣器。

試藥CN128原料藥(浙江大學(xué)藥學(xué)院自制,含量99.97%、98.62%和98.79%,批號:20121216、20121228和20130115);乙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、環(huán)己烷、正庚烷和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和氯化芐均為分析純(國藥集團)。

頂空GC測定方法色譜柱為Agilent HP-5毛細管色譜柱(5%二苯基-95%二甲基聚硅氧烷,30 m×0.25 mm×0.25 μm);檢測器為氫火焰離子化檢測器(FID);檢測器溫度250 ℃;程序升溫起始溫度為35 ℃,保持6 min,以50 ℃/min升溫至110 ℃,再以10 ℃/min升溫至220 ℃,保持3 min;進樣口溫度200 ℃;載氣氮氣;流速1.0 mL/min;分流比1∶1;進樣時間1 min。

溶液配制

定位溶液 分別精密稱取乙酸乙酯100 mg、二氯甲烷12 mg、乙醇100 mg、乙腈10 mg、正己烷5 mg、正庚烷95 mg、環(huán)己烷80 mg和氯化芐20 mg,置于裝有適量DMF的100 mL量瓶中,用DMF定容至刻度,搖勻,即得。

選擇性試驗溶液 精密稱取乙酸乙酯100 mg、二氯甲烷12 mg、乙醇100 mg、乙腈10 mg、正己烷5 mg、正庚烷95 mg、環(huán)己烷80 mg和氯化芐20 mg,加入裝有適量DMF的100 mL量瓶中,用DMF定容至刻度,搖勻,即得。

對照系列溶液 精密稱取乙酸乙酯500 mg、二氯甲烷60 mg、乙醇500 mg、乙腈50 mg、正己烷25 mg、正庚烷475 mg、環(huán)己烷400 mg和氯化芐100 mg,迅速加入已裝有適量DMF的10 mL量瓶中,定容至刻度,搖勻,得對照儲備溶液。精取上述對照儲備溶液1 500 μL,用DMF稀釋至50 mL,作為標準待測液1;精取標準待測液1 830 μL,用DMF稀釋至1 mL,作為標準待測液2;精取標準待測液1 750 μL,用DMF稀釋至1 mL,作為標準待測液3;精取標準待測液1 500 μL,用DMF稀釋至1 mL,作為標準待測液4;精取標準待測液1 330 μL,用DMF稀釋至1 mL,作為標準待測液5。以上系列標準待測液中各有機溶劑的濃度分別為:乙酸乙酯0.495、0.750、1.125、1.240和1.500 mg/mL,二氯甲烷0.060、0.090、0.135、0.149和0.180 mg/mL,乙醇0.495、0.750、1.125、1.240和1.500 mg/mL,乙腈0.040、0.060、0.090、0.010和0.120 mg/mL,正己烷0.029、0.044、0.065、0.072和0.087 mg/mL,正庚烷0.495、0.750、1.125、1.240和1.500 mg/mL,環(huán)己烷(0.380、0.580、0.870、0.960和1.160 mg/mL)和氯化芐0.099、0.150、0.225、0.249和0.300 mg/mL。

供試品溶液 取CN128約0.2 g,置頂空瓶中,加DMF溶液1.0 mL,壓蓋,溶解后搖勻,作為供試品溶液。照上述色譜條件頂空進樣測定。

結(jié) 果

專屬性試驗分別取定位溶液和限量對照溶液,按“頂空GC測定方法”項下色譜條件進樣,記錄色譜圖(圖1B)。結(jié)果表明,空白溶劑無干擾;各殘留溶劑均能有效分離,相鄰溶劑峰之間的最小分離度(乙醇和乙腈)為2.5,符合驗證方案要求(分離度≥1.5),結(jié)果見表1。

線性與檢測限、定量限試驗分別取對照系列溶液,按“頂空GC測定方法”項下色譜條件進樣,以峰面積為Y值,標準品濃度為X值,計算各有機溶劑的回歸方程及相關(guān)系數(shù)。采用逐步稀釋法,以信噪比為3(S/N=3)測得各有機殘留溶劑的最低檢測限(limit of detection,LOD),以信噪比不小于10(S/N≥10)測得各有機殘留溶劑的最低定量限(limit of quantity,LOQ),結(jié)果見表2。

A:Blank;B:Selective test solution (1-ethanol,2-acetonitrile,3-dichloromethane,4-hexane,5-ethyl acetate,6-cyclohexane,7-heptane,8-DMF,9-benzyl chloride);C:Test solution.

圖1 典型色譜圖Fig 1 Typical chromatograms

精密度試驗選擇性試驗溶液平行配制5份,按“頂空GC測定方法”項下色譜條件進樣,計算各殘留溶劑峰面積的相對標準偏差(relative standard deviation,RSD),要求RSD≤5.0%,結(jié)果見表3。

回收率試驗精密稱取本品0.2 g,置頂空瓶中,分別加入上述線性標準待測液1 830、750和500 μL,用N,N-二甲基甲酰胺稀釋至1 mL,壓蓋,溶解后即得回收率試驗溶液。照上述條件測定,每個濃度測定3份。結(jié)果顯示,乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醇、乙腈、正己烷、正庚烷、環(huán)己烷和氯化芐的平均回收率分別為110.67%、98.22%、98.58%、115.40%、110.22%、116.85%、108.01%和111.86%;RSD分別為0.69%、1.04%、0.37%、1.31%、1.46%、0.98%、1.00%和4.27 %。

表2 線性試驗結(jié)果,LOD及LOQTab 2 Results of linerarity test,LOD and LOQ

LOD:Limit of detection;LOQ:Limit of quantity.

樣品測定取供試品溶液,按“頂空GC測定方法”項下色譜條件進樣,記錄色譜圖(圖1C)。結(jié)果表明,3批樣品中均未檢出乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、正庚烷、環(huán)己烷和氯化芐;乙醇殘留含量為0.004%、0.004%及0.004%;乙腈殘留含量為0.013%、0.023%及0.023%。

表3 精密度試驗結(jié)果Tab 3 Results of precision

討 論

考察基質(zhì)對殘留溶劑的影響采用標準加入法和外標法對所測有機溶劑做線性方程,并依據(jù)標準加入法所得線性方程計算加樣回收率,計算所得的乙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、環(huán)己烷、正庚烷的加樣回收率在80%～120%,說明樣品基質(zhì)對殘留溶劑的揮發(fā)沒有影響,因此采用外標法測定供試品中殘留溶劑含量是可行的。

頂空條件優(yōu)化分別考察了頂空瓶平衡溫度(80、90、100和120 ℃)和頂空瓶平衡時間(30和45 min)對各殘留溶劑靈敏度的影響。結(jié)果表明,80 ℃時對照品溶液中未檢測到氯化芐;90和100 ℃時對照品溶液中各峰的峰面積沒有明顯區(qū)別,120 ℃時二氯甲烷峰面積不穩(wěn)定。因此最終選擇頂空瓶平衡溫度為90 ℃;兩個平衡時間下對各溶劑的色譜峰峰面積沒有明顯區(qū)別,因此最終選擇頂空瓶平衡時間為30 min。