姚幫本, 焦 芮, 葉應(yīng)旺

(1.安徽省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,安徽合肥 230051;2.合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,安徽合肥 230009)

克羅諾桿菌(Cronobacter spp.)屬于腸桿菌科,是一種革蘭氏陰性、周身鞭毛、無(wú)芽孢兼性厭氧粗短桿菌。該菌在生活中較為常見(jiàn),主要寄生于人和動(dòng)物的腸道中,易引發(fā)新生兒腦膜炎、菌血癥及壞死性小腸結(jié)腸炎等嚴(yán)重疾病[1-3]。至2002年,美國(guó)流行病調(diào)查數(shù)據(jù)表明,新生兒感染克羅諾桿菌的概率為十萬(wàn)分之一,而感染后的死亡率達(dá)到20% ～50%[4-5]?？肆_諾桿菌具有極強(qiáng)的逆境耐受性,在自然界中的分布極其廣泛,從多種食物原材料、半成品、生產(chǎn)器材等中都分離到該菌[5-9]。截止目前,克羅諾桿菌在自然界的污染來(lái)源仍不清楚,因此,開(kāi)展不同食品中的污染調(diào)查及預(yù)防控制,對(duì)保障食品安全意義重大。

克羅諾桿菌生物膜形成是其在載體表面生活時(shí)所采取的一種獨(dú)特的生活方式,它是細(xì)菌在不利環(huán)境中自我保護(hù)的一種本能反應(yīng)[10]。鞭毛是細(xì)菌的主要運(yùn)動(dòng)器官,細(xì)菌往往通過(guò)它移向更適宜生長(zhǎng)的環(huán)境,避開(kāi)一些有害無(wú)益的影響因子[10]。菌膜的形成與鞭毛運(yùn)動(dòng)性都會(huì)使細(xì)菌朝著更加耐藥、更加易繁殖的方向發(fā)展,所以這兩者之間的相關(guān)性日益受到重視[11]。有關(guān)鞭毛運(yùn)動(dòng)特性促進(jìn)細(xì)菌菌膜形成的相關(guān)報(bào)道已有很多。研究發(fā)現(xiàn),運(yùn)動(dòng)缺陷型的銅綠假單胞菌在其菌膜形成的初始階段黏附載體的能力有所下降[12]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),生物膜形成能力下降是由于突變基因PA5017抑制了該菌鞭毛運(yùn)動(dòng)性與趨化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[13]。除此之外,在枯草芽孢桿菌、創(chuàng)傷弧菌及大腸埃希菌的突變株中均發(fā)現(xiàn)這種由于鞭毛運(yùn)動(dòng)缺陷而導(dǎo)致菌膜形成障礙的實(shí)例[14-16]。本研究主要對(duì)合肥各大超市中水產(chǎn)品進(jìn)行隨機(jī)抽樣,運(yùn)用改良的國(guó)標(biāo)方法及16S r RNA基因鑒定方法確定其中克羅諾桿菌的檢出率,研究分離菌株的生物膜形成能力與菌株鞭毛運(yùn)動(dòng)性之間的關(guān)系?？肆_諾桿菌菌膜的形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,鞭毛的運(yùn)動(dòng)特性是否與生物膜的形成有著某些必然聯(lián)系還待考證。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

試劑：緩沖蛋白質(zhì)胨水(BPW)、改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(mLST)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)、酵母提取粉、瓊脂粉、D型葡萄糖,均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;結(jié)晶紫、乙酸,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;2.5%戊二醛固定液,購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司;PCR mix、TAE緩沖液、溴化乙啶,購(gòu)自上海生工生物工程有限公司;DNA marker(DL 2000)、DNA提取試劑盒,購(gòu)自天根生化科技有限公司;LIVE/DEAD baclight bacterial viability kit試劑盒,購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司。

材料：水產(chǎn)干制品,購(gòu)自合肥市各大超市;96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,購(gòu)自上海百研生物技術(shù)有限公司。6 mm×6 mm細(xì)胞爬片,購(gòu)自晶安生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

10.0 ～1 000.0μL各種規(guī)格移液槍,深圳市福田區(qū)銘川儀器儀表經(jīng)營(yíng)部;酶標(biāo)儀,美國(guó)Thermo公司;LMS710型激光共聚焦顯微鏡,德國(guó)Zeiss公司;Bio-rad型梯度PCR儀、LDZX-30KBS型高壓滅菌鍋,上海申安公司;SCILOGEX型臺(tái)式離心機(jī),美國(guó)賽洛捷克公司;UTP-313型電子天平,上海菲克蘇公司;JB-CJ-1FD型超凈臺(tái),蘇州蘇凈公司;天能凝膠成像儀、SU8020型場(chǎng)發(fā)式掃描電鏡,日本日立公司;ZHWY-103B型搖床,上海智城公司;DHG-9070A型電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海昕?jī)x公司;電子游標(biāo)卡尺,上海美耐特有限公司;SHP-80型恒溫培養(yǎng)箱,上海森信公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品調(diào)查方案

采樣時(shí)間：2015年6月29日—9月10日;采樣地點(diǎn)：安徽省合肥市各大型超市。

共6批次120份樣品,主要為超市中散裝與包裝的干制海產(chǎn)品。

計(jì)劃采樣的前一天,配制實(shí)驗(yàn)所需的各種培養(yǎng)基以及對(duì)一些處理樣品的必需品進(jìn)行滅菌。早上9時(shí)去超市采樣,此時(shí)超市剛開(kāi)始營(yíng)業(yè),可以盡可能排除一些人為及環(huán)境因素的影響。

樣品的預(yù)處理：采樣后及時(shí)將其帶回實(shí)驗(yàn)室,首先進(jìn)行編號(hào),隨后裁樣(有些干制水產(chǎn)品很大,需將其用滅過(guò)菌的剪刀剪成小塊),再裝入無(wú)菌的密封袋中進(jìn)行密封保存。需要保存在相對(duì)低溫且干燥的地點(diǎn),以待下一步鑒定時(shí)使用。

1.3.2 樣品中克羅諾桿菌污染檢測(cè)

克羅諾桿菌的篩選檢測(cè)流程依照 GB 4789.40—2016[17]中阪崎腸桿菌微生物學(xué)檢驗(yàn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。由于調(diào)查樣品的特殊性及對(duì)實(shí)驗(yàn)的特殊要求,對(duì)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的某些細(xì)節(jié)進(jìn)行了更改。操作步驟如下：

1)增菌。無(wú)菌環(huán)境下準(zhǔn)確稱(chēng)取3.0 g樣品,加入到50 mL BPW中,放在100 mL的三角瓶中搖勻,隨后放置在180 r/min搖床中,37℃下培養(yǎng)20 h。

2)初步篩菌。將萬(wàn)古霉素(1 mg/mL)經(jīng)過(guò)0.22μm孔徑的水系濾膜過(guò)濾,按照國(guó)標(biāo)與月桂基硫酸鹽培養(yǎng)基混合。取1 mL 1)中的增菌液轉(zhuǎn)移至10 mL mLST中,放置于搖床中以180 r/min,44℃恒溫培養(yǎng)24 h。

3)分離。取上一步的培養(yǎng)物在克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基平板上劃線,放置在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。觀察顯色培養(yǎng)基平板上是否存在呈藍(lán)綠色的典型菌落。

4)鑒定。在每個(gè)顯色培養(yǎng)基平板中間位置挑取1～5個(gè)典型及可疑菌落進(jìn)行甘油保存。

5)菌落PCR。取篩選出的菌種于TSA上劃線過(guò)夜培養(yǎng),用牙簽挑取少量單菌落于EP管中。挑取菌體不易過(guò)多,EP管中可見(jiàn)淡淡痕跡即可,挑取菌體量過(guò)多反而易干擾實(shí)驗(yàn),造成非特異性擴(kuò)增等不良后果。

6)PCR反應(yīng)體系及電泳條件。PCR反應(yīng)基于gluA基因設(shè)計(jì)引物[18]。 E-F：5'-ggcggagccgaataactg-3';E-R：5'-cgtgccctgcatgagaaaa-3'。

PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：94℃,預(yù)變性10 min;94℃,變性45 s,58℃,退火45 s,72℃延伸1 min,共35個(gè)循環(huán);72℃,延伸7 min結(jié)束反應(yīng)。

PCR體系組成：2×Taq PCR Master Mix(20 μL),E-F和E-R各0.2μmol/L,模板DNA 1μL,雙蒸水17μL。

電泳條件：取菌落 PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物5μL及DNA Marker 5μL,點(diǎn)樣于含有核酸染料溴化乙啶的1%瓊脂糖凝膠梳子孔中,加入1×電泳緩沖液TAE,120 V電泳約為20～30 min,通過(guò)凝膠成像儀觀察,并進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.3.3 分離菌株的生物學(xué)特性研究

1.3.3.1 分離菌株菌膜形成能力測(cè)定

將1.3.2中鑒定出的克羅諾桿菌分離株經(jīng)過(guò)TSB的擴(kuò)增培養(yǎng)后,在TSA上劃線后放置在恒溫培養(yǎng)箱37℃倒置培養(yǎng),隨后挑取單菌落接種于5 mL的TSB中進(jìn)行過(guò)夜活化。取分離株過(guò)夜活化后的菌液以1∶100的比例與新鮮TSB混合,混合均勻后轉(zhuǎn)移至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng),每孔加樣200μL。每種濃度均在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h。每種濃度重復(fù)3～6次,并設(shè)置無(wú)菌液的新鮮培養(yǎng)基為空白對(duì)照組。培養(yǎng)后的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的處理步驟如下：

1)棄去96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液,使用無(wú)菌生理鹽水反復(fù)清洗未貼壁的浮游細(xì)菌3次;

2)將清洗好的細(xì)胞培養(yǎng)板置于60℃的恒溫鼓風(fēng)烘箱中固定1 h;

3)在固定好的細(xì)胞培養(yǎng)板的每個(gè)處理孔中加入200μL的0.1%結(jié)晶紫染液(配制好的結(jié)晶紫應(yīng)避光保存)避光染色30 min;

4)將染過(guò)色的細(xì)胞培養(yǎng)板用0.90%無(wú)菌生理鹽水清洗3～6次,盡量將染壁的結(jié)晶紫洗干凈;

5)室溫風(fēng)干后溶解于33%的乙酸中(現(xiàn)測(cè)現(xiàn)配現(xiàn)加原則),若不能立刻測(cè)量則風(fēng)干后直接放置于4℃冰箱中;

6)溫和震蕩細(xì)胞培養(yǎng)板并置于酶標(biāo)儀下測(cè)定吸光度,測(cè)定波長(zhǎng)為590 nm。

1.3.3.2 分離菌株菌膜觀察

1)電鏡觀察分離菌株的菌膜生長(zhǎng)情況。將活化過(guò)的菌液以1∶100的比例與新鮮TSB混合均勻,轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔加入2 mL。24孔細(xì)胞培養(yǎng)板預(yù)先放入直徑為6 mm無(wú)菌的細(xì)胞爬片作為黏附載體。每種濃度均在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h。每種濃度重復(fù)3～6次,并設(shè)置無(wú)菌液的新鮮培養(yǎng)基為空白對(duì)照組。培養(yǎng)結(jié)束后,菌膜的掃描電鏡樣品前處理步驟如下：

①先緩慢沿壁吸取細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基后棄去,用無(wú)菌PBS輕輕沖洗細(xì)胞培養(yǎng)板3次,在清洗過(guò)程中可以輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板洗去浮游菌;

②清洗完畢后加入2.5%戊二醛過(guò)夜固定,固定時(shí)間不少于6 h;

③將固定后的樣品用無(wú)菌PBS溶液輕輕沖洗3次;

④乙醇梯度脫水,乙醇的體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%、100%,樣品加入每個(gè)濃度的乙醇后需脫水放置10 min,每個(gè)濃度重復(fù)2次;

⑤將乙醇脫水后的樣品放置于-20℃冰箱中預(yù)冷不少于4 h;

⑥將預(yù)冷后的樣品置于冷凍干燥機(jī)中12 h,取出后放置于干燥器中;

⑦樣品噴金100 s后,利用場(chǎng)發(fā)式掃描電鏡在3 000倍下掃描拍攝。

2)激光共聚焦觀察分離株的菌膜生長(zhǎng)情況。首先培養(yǎng)分離菌株的菌膜,具體菌膜培養(yǎng)方法及條件參照1.3.3.2中的1)。菌膜激光共聚焦樣品前處理步驟如下：

①將培養(yǎng)后3個(gè)時(shí)間段的各組模型中培養(yǎng)液取出,用無(wú)菌的生理鹽水輕輕洗滌細(xì)胞板中細(xì)胞爬片3次,緩慢搖晃除去浮游細(xì)菌。

②在細(xì)胞培養(yǎng)板中加入配制好的熒光染液(1 mL混合熒光染液的比例為：994μL PBS+3μL染液1+3μL染液2),37℃恒溫培養(yǎng)箱避光條件下培養(yǎng)15 min。

③將染色后細(xì)胞爬片用無(wú)菌生理鹽水洗滌3次,洗去染料。

④將處理好的細(xì)胞爬片取出,倒置于0.17 mm厚的載玻片上。置于激光共聚焦顯微鏡下,采用藍(lán)光激發(fā),拍照。Syto9染料呈綠色熒光,表示活菌;碘化丙啶PI染料呈現(xiàn)紅色熒光,表示死菌。根據(jù)比例可以觀察細(xì)菌菌落大致形成情況。

1.3.3.3 分離菌株運(yùn)動(dòng)能力測(cè)定

篩選菌株運(yùn)動(dòng)能力的測(cè)定主要使用兩種培養(yǎng)基,第一種是游動(dòng)性培養(yǎng)基(swimming motility),第二種是泳動(dòng)性培養(yǎng)基(swarming motility)。11號(hào)分離株過(guò)夜擴(kuò)菌后,在TSA劃線培養(yǎng)出單菌落。用牙簽輕輕點(diǎn)擊單菌落,隨后分別點(diǎn)擊到swimming motility和swarming motility上,且點(diǎn)擊在培養(yǎng)基上的次數(shù)必須保證相同。將兩種培養(yǎng)基放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),swimming motility及swarming motility分別培4 h和16 h即可。兩種培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中均不可疊加放置。

具體培養(yǎng)基配制如下：

1)游動(dòng)性培養(yǎng)基(swimming motility)。細(xì)菌用胰蛋白胨,10 g/L;酵母提取粉,5 g/L;瓊脂粉,0.15%。加蒸餾水定容至1 L,121℃濕熱滅菌20 min。需要測(cè)定克羅諾桿菌游動(dòng)性之前,加熱凝固的培養(yǎng)基,融化后冷卻至50℃左右倒平板,平板的厚度約為4 mm左右,冷卻凝固后備用。由于培養(yǎng)基中瓊脂粉較少,屬于軟平板,所以移動(dòng)平板時(shí)需要柔和平穩(wěn)移動(dòng),不可傾斜和倒置。

2)泳動(dòng)性培養(yǎng)基(swarming motility)。營(yíng)養(yǎng)肉湯,8 g/L;D-葡萄糖,5 g/L;瓊脂粉,0.5%。加蒸餾水定容至1 L,115℃濕熱滅菌30 min。需要測(cè)定克羅諾桿菌泳動(dòng)性之前,加熱凝固的培養(yǎng)基,融化后冷卻至50℃左右倒平板,平板的厚度約為3 mm左右,冷卻,干燥過(guò)夜,因培養(yǎng)基屬于半固體,平板不可倒置。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種分離與鑒定結(jié)果分析

克羅諾桿菌在顯色培養(yǎng)基生長(zhǎng)及顯色情況見(jiàn)圖1?？肆_諾桿菌區(qū)別于其他腸桿菌的特性之一是該菌具有α-葡萄糖苷酶活性,這種活性會(huì)使其在培養(yǎng)基上產(chǎn)生黃色菌落,但與此同時(shí)產(chǎn)生的4-硝基苯酚會(huì)影響結(jié)果[19-20]。Iversen等[21]通過(guò)在培養(yǎng)基中加入顯色基團(tuán)Xα-GlcA,配制成克羅諾桿菌的特異性顯色培養(yǎng)基,使得該菌在培養(yǎng)基中顯藍(lán)綠色(圖中圓圈部分)。由圖1可見(jiàn)藍(lán)綠色的單菌落,120個(gè)調(diào)查樣品共有37個(gè)樣品有藍(lán)綠色菌落,此次調(diào)查初篩時(shí)目的菌株的檢出率為30.83%。每個(gè)顯色培養(yǎng)基中挑取3～5個(gè)單菌落過(guò)夜活化后用甘油保存。共保存了129個(gè)疑似克羅諾桿菌菌落,以待用作后續(xù)的鑒定工作。

圖1 克羅諾桿菌在顯色平板上的藍(lán)綠菌落(圓圈中)形態(tài)Fig.1 Shape of Cronobacter spp.on chromogenic medium

圖2 克羅諾桿菌屬gluA鑒定結(jié)果Fig.2 Identification results of gluA for Cronobacter spp.

為防止假陽(yáng)性與假陰性,因此設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照,本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了一個(gè)已知的克羅諾桿菌G362作為對(duì)照。疑似菌株的DNA擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn),23個(gè)菌株有目的條帶(673 bp),檢出率為17.83%。陸幸兒等[22]在廣東省各超市共328家對(duì)10種食物(包括冰淇淋、熟肉、面包、飲用水、調(diào)味品、堅(jiān)果等)進(jìn)行取樣調(diào)查,最后檢出阪崎克羅諾桿菌54株,總檢出率達(dá)到6.4%,小于17.83%。兩者都是從各大超市隨機(jī)采集樣品,調(diào)查結(jié)果說(shuō)明,該菌對(duì)海產(chǎn)干制品的污染率較高。海產(chǎn)干制品中含鹽量較高,卻仍有較高的檢出率,這可能與該菌的耐高滲透壓有關(guān)。Breeuwer等[23]的研究結(jié)果表明,克羅諾桿菌確實(shí)能耐受極端滲透壓和干燥環(huán)境。

2.2 分離菌株的生物學(xué)特性分析

2.2.1 分離菌株菌膜形成能力分析

細(xì)菌形成生物膜是為了適應(yīng)生存環(huán)境而產(chǎn)生的多糖類(lèi)物質(zhì),該物質(zhì)黏附于載體(生物或非生物)表面,菌體包被于自身所產(chǎn)生的質(zhì)地不均一的基質(zhì)中,從而形成一種完全不同于浮游細(xì)菌生長(zhǎng)模式的細(xì)菌群體[10]。這種菌膜結(jié)構(gòu)就如同一種“保護(hù)屏障”,對(duì)宿主的免疫系統(tǒng)的抵抗性有著顯著的影響,是發(fā)生慢性感染的因素之一[24]。

23株克羅諾桿菌分離株的菌膜形成能力見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn),編號(hào)為11的分離株菌膜形成能力尤為突出。菌膜形成能力的強(qiáng)弱在某種程度上可以表示菌株對(duì)外來(lái)不利因素的抵抗能力的強(qiáng)弱,因此將編號(hào)為11號(hào)的分離株待定為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)菌株。

2.2.2 11號(hào)分離株菌膜形成能力觀察

圖3 克羅諾桿菌分離菌株菌膜的形成能力Fig.3 Biofilm formation abilities of Cronobacter spp.strains

圖4 掃描電鏡表征的11號(hào)分離株的菌膜形成能力Fig.4 Biofilm formation ability of No.11 strain using scanning electron microscopy

細(xì)菌菌膜的形成是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程,包括細(xì)菌起始的黏附、菌膜黏附期、生長(zhǎng)期、成熟期、播散期等一系列階段[25]。分離株的菌膜形成見(jiàn)圖4、圖5。由圖4與圖5可看出,隨著時(shí)間的不斷延長(zhǎng),在一定時(shí)間段間,菌膜形成的厚度增加且死菌的比例也逐漸增加。另外還可觀察到生物膜中間存在空隙與孔道,有研究認(rèn)為該孔道為細(xì)菌正常新陳代謝的重要通道,分布著多糖和蛋白質(zhì)等物質(zhì)[1]。除此之外,由圖4可觀察到分離株在不同時(shí)間段時(shí)菌膜的生長(zhǎng)情況。24 h時(shí),菌膜形成的初始階段,菌體大量繁殖并且開(kāi)始聚集黏附在載體表面;當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到48 h時(shí),可觀察到成片的菌膜,菌膜結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)固,中間的空隙較少,此時(shí)菌膜形成量達(dá)到最大值;隨著時(shí)間的繼續(xù)推移,72 h的培養(yǎng)后,菌膜開(kāi)始裂解,釋放其中的菌體。圖5結(jié)果基本上與圖4一致,24 h時(shí)菌體呈鮮綠色,說(shuō)明此時(shí)菌體生長(zhǎng)較為旺盛,黏附載體的能力也較強(qiáng),并開(kāi)始有成膜的趨勢(shì);48 h時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)死菌但也是菌膜生成量最大的時(shí)候,在激光共聚焦下出現(xiàn)成塊和成片的黃綠色菌膜;當(dāng)11號(hào)分離株培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到72 h時(shí),此時(shí)Syto9染料所表征的綠色活菌比例下降,而PI所表征的紅色死菌比例大大上升,而此時(shí)菌膜已經(jīng)裂解,菌體被釋放出來(lái),已無(wú)成片完整的黃綠色菌膜。

2.2.3 分離株運(yùn)動(dòng)性分析

圖5 激光共聚焦顯微鏡表征的11號(hào)分離株的菌膜形成能力Fig.5 Biofilm formation ability of No.11 strain using confocal laser scanning microscopy

圖6 克羅諾桿菌分離株的游動(dòng)性Fig.6 Swimming motilityies of Cronobacter spp.

圖7 克羅諾桿菌分離株的泳動(dòng)性Fig.7 Swarming motility of Cronobacter spp.

圖8 克羅諾桿菌在運(yùn)動(dòng)培養(yǎng)基中的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)Fig.8 Shape of Cronobacter spp.in motility medium

鞭毛是細(xì)菌的主要運(yùn)動(dòng)器官,細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)往往有一定的趨向性,大多數(shù)細(xì)菌會(huì)依賴(lài)鞭毛運(yùn)動(dòng)到更適宜生長(zhǎng)的方向,從而擁有更充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),而避開(kāi)有害的環(huán)境[10]。分離株的運(yùn)動(dòng)情況見(jiàn)圖6至圖8。由圖6至圖8可知,8號(hào)菌株與18號(hào)菌株在swimming motility上培養(yǎng)4 h后形成的菌落圈分別達(dá)到23株分離株的最大值(55.75 mm)與最小值(32.14 mm);而11號(hào)菌株與16號(hào)菌株在swarming motility上培養(yǎng)16 h后形成的菌落圈分別達(dá)到23株分離株的最大值(14.02 mm)與最小值(7.85 mm)。

鞭毛的運(yùn)動(dòng)性與菌體菌膜的形成有一定關(guān)系。通過(guò)比較8株大腸埃希菌菌毛基因的表達(dá)和生物膜形成相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性與菌膜的形成存在對(duì)應(yīng)關(guān)系,運(yùn)動(dòng)性越強(qiáng)的菌株,其生物膜形成能力相對(duì)越強(qiáng)[16];而Caiazza等[25]研究發(fā)現(xiàn),SadB蛋白缺陷菌株運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng),菌膜形成能力反而減弱。

此次調(diào)查取樣中,所篩選的23株克羅諾桿菌分離株生物膜形成與其運(yùn)動(dòng)能力之間的關(guān)系不是很顯著,可能是由于克羅諾桿菌菌膜生成情況受到多種因素的影響。鞭毛的運(yùn)動(dòng)性雖然在一定程度上可以使菌體朝向高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)處移動(dòng),盡量避開(kāi)不利因素,但是在細(xì)菌黏結(jié)在載體表面時(shí),運(yùn)動(dòng)性又會(huì)抑制其形成穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)[11]。

3 結(jié) 論

抽樣調(diào)查了120個(gè)海產(chǎn)干制樣品,運(yùn)用改良的國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法與分子水平鑒定分離株,發(fā)現(xiàn)其中克羅諾桿菌的檢出率為17.83%,表明海產(chǎn)干貨中克羅諾桿菌具有較高的污染率。進(jìn)一步研究了23個(gè)分離菌株的菌膜形成能力與運(yùn)動(dòng)能力之間的關(guān)系,結(jié)果表明,11號(hào)菌株的菌膜形成能力最強(qiáng)并且有較強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)性,但克羅諾桿菌菌膜形成與其鞭毛運(yùn)動(dòng)性之間的關(guān)系還未明確,詳細(xì)的分子機(jī)制尚待深入研究。