龍爽等

【摘要】目的：探討冷凍切片制作流程中容易出現(xiàn)的問(wèn)題和對(duì)策，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，旨在提高冷凍切片質(zhì)量。方法：回顧性分析我院2011年11月-2017年12月接收的術(shù)中冷凍樣本1071例，由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師閱片，為冷凍切片判讀分兩級(jí)，即優(yōu)良片和差片。結(jié)果：統(tǒng)計(jì)本組冷凍切片優(yōu)良率為98.7%。結(jié)論：冷凍切片質(zhì)量受很多因素影響，病理技師只有通過(guò)不斷地研究和總結(jié)，有利于病理醫(yī)師迅速地作出正確的病理診斷。

【關(guān)鍵詞】冷凍切片；問(wèn)題；對(duì)策；提高質(zhì)量

冷凍切片在病理工作中是一種重要的制片法，將新鮮組織經(jīng)過(guò)急速低溫冷凍、變硬后切成薄片再經(jīng)染色等步驟，制成便于光鏡觀察的組織切片技術(shù)。它與常規(guī)石蠟制片相比，突出的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、迅速省時(shí)、易于光鏡下觀察，因此在外科手術(shù)中廣泛應(yīng)用Ⅲ。同時(shí)冷凍切片能良好地保存脂肪、類脂質(zhì)及各種酶的活性。本文結(jié)合安岳縣人民醫(yī)院2011年11月-2017年12月接收的術(shù)中送檢冷凍樣本1071例，針對(duì)冷凍切片出現(xiàn)的問(wèn)題進(jìn)行分析，現(xiàn)總結(jié)如下。

1資料與方法

1.1一般資料

收集安岳縣人民醫(yī)院自2011年11月-2017年12月接收門診或住院患者術(shù)中冷凍切片病理檢查1071例。本組男女比例151：920，年齡9-87歲，平均（47±5）歲。所有患者均自愿選擇術(shù)中快速冷凍切片病理檢查，簽署知情同意書，一式兩份。

1.2材料

（1）OCT支持劑；

（2）潔凈的玻片；

（3）1%鹽酸乙醇分化液；

（4）蘇木精染液、醇溶性伊紅液；

（5）梯度乙醇、透明劑、中性樹膠。

1.3儀器

德國(guó)徠卡CM1950恒溫箱冷凍切片機(jī)，美的EG720KG4-NA型號(hào)的微波爐。

1.4方法

1.4.1預(yù)先準(zhǔn)備

病理技師提前1小時(shí)將冷凍切片機(jī)箱體和冷凍頭溫度降至-22℃左右；預(yù)冷樣本頭；調(diào)試儀器，確認(rèn)運(yùn)轉(zhuǎn)正常；預(yù)冷95%乙醇固定液；過(guò)濾蘇木精染液并預(yù)熱至37℃。

1.4.2冷凍樣本接收

病理科認(rèn)真核對(duì)手術(shù)室送檢的新鮮樣本，核對(duì)無(wú)誤后，詳細(xì)記錄患者的基本信息，冷凍組織名稱和冷凍病理編號(hào)，樣本件數(shù)，接收樣本時(shí)間，送檢人和驗(yàn)收人雙簽名。

1.4.3取材

病理醫(yī)師檢查送檢樣本，選擇2-3塊具有代表性的組織塊，與病理技師交接。

1.4.4包埋與切片

技師將組織塊放置在樣本頭上，滴加少量OCT支持劑，立即將其置于冷凍切片機(jī)內(nèi)速冷區(qū)域，并放上冷凍錘。待組織與冷凍錘分離，即可開始切片。將凍好組織塊的樣本頭在切片機(jī)夾頭上夾緊，以對(duì)角線作為切入口，粗修至最大切面；分別選擇切片厚度分別為6微米和4微米（除脂肪組織選擇15微米的切片厚度外），快速細(xì)修2-3次后，分別切出完整的切片兩張，按照載玻片左側(cè)6微米、右側(cè)4微米的切片附貼原則，將兩張厚度不同的切片附貼在同一張編好號(hào)的載玻片上。

1.4.5固定與染色

將冷凍切片立即放入95%冷乙醇中固定1min，水洗數(shù)s，按規(guī)范進(jìn)行快速HE染色。

1.4.6封固與交接

冷風(fēng)干燥切片，中性樹膠封固，粘貼標(biāo)簽。再次核對(duì)無(wú)誤后與病理醫(yī)師交接，記錄交接時(shí)間。整個(gè)制片時(shí)間共計(jì)約15

1.5判讀結(jié)果

由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師閱片，為冷凍切片評(píng)估分兩級(jí)，即優(yōu)良片和差片。

優(yōu)良片評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)為：切片完整，厚度4～6μm，厚薄均勻，無(wú)褶無(wú)刀痕，冰晶小或無(wú)冰晶。染色核漿分明，紅藍(lán)適度，透明潔凈，封裱美觀。單件樣本冰凍切片制片總時(shí)間≤15分鐘。

差片評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)為：切片不完整，過(guò)厚、有皺褶、刀痕、大顆粒冰晶。細(xì)胞變形、核漿模糊不清、紅藍(lán)對(duì)比差。組織模糊、封裱不美觀。影響病理診斷。

2結(jié)果

本組冷凍切片優(yōu)良率為98.7%。

3討論

術(shù)中快速冷凍病理診斷是病理醫(yī)師最具風(fēng)險(xiǎn)的急診工作，而高質(zhì)量的冷凍切片是病理診斷的重要基礎(chǔ)，因此病理技師要提高冷凍切片的質(zhì)量，除了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ鲬B(tài)度外，還需要熟練掌握冷凍切片制作環(huán)節(jié)中的注意事項(xiàng)、問(wèn)題和相應(yīng)的處理對(duì)策腳。

（1）樣本自身因素。冷凍樣本要求必須新鮮，嚴(yán)禁沾水或液體浸泡。但是偶爾會(huì)出現(xiàn)人為意外情況，病理技師要準(zhǔn)確判斷樣本受損程度并糾正改善組織情況。①少量液體附于樣本表面，只需用吸水紙或干紗布吸掉水分即可；②大量液體如血液或囊液浸泡，盡量選擇樣本浸泡少的位置選取組織塊，吸掉水分后，按照規(guī)范制作冷凍切片；③固定液浸泡的樣本，則用蒸餾水或生理鹽水清洗多次，吸干組織表面水分，放在樣本頭上，加OCT支持劑，稍凝結(jié)后入液氮罐內(nèi)5分鐘后，取出在冷凍切片機(jī)上切片。

（2）取材。病理技師要與取材醫(yī)師積極溝通，取材時(shí)要特別注意：①取材臺(tái)面和器械保持干燥，切忌用水沖洗樣本；刀具鋒利，避免人為造成組織擠壓；要注意避開線結(jié)、鋼釘、結(jié)石、骨或鈣化等會(huì)導(dǎo)致切片破碎或刀痕的異物；同時(shí)要避免在有大量出血壞死的區(qū)域選材。②選取的冷凍組織塊平整且大小厚薄適宜，20mm×20mm×3mm，厚度不超過(guò)4mm，太厚會(huì)延長(zhǎng)冷凍時(shí)間；若是囊壁樣組織須切成長(zhǎng)條狀，卷曲成U形并豎立包埋；若是過(guò)于碎小冷凍組織，如直徑<2mm者，建議取消冷凍切片。若有包膜、微小病灶或特定切面等，病理醫(yī)師必須與病理技師明確交接，詳細(xì)說(shuō)明；病理技師需及時(shí)溝通病理醫(yī)師，充分理解醫(yī)師意圖，制成符合要求的冷凍切片。

（3）包埋。新鮮冷凍組織在包埋時(shí)正確應(yīng)用速冷區(qū)、OCT支持劑和冷凍錘非常重要。一般先在預(yù)冷的樣本頭滴加少許包埋劑，因低溫使包埋劑稍凝結(jié)發(fā)白，快速將組織塊放上輕壓，使組織處于同一水平切面，再覆蓋少許支持劑。然后將樣本頭置于冷凍切片機(jī)速冷區(qū)，并放上冷凍錘使組織平整，并加快冷凍速度。有研究證明：急速冷凍，可以防止或減少冰晶的出現(xiàn)。碎小組織包埋時(shí)，建議先用OCT支持劑在樣本頭上做一個(gè)冷凍臺(tái)，粗修成一個(gè)帶平臺(tái)的樣本頭備用。然后將碎小樣本放置在平臺(tái)上，覆蓋OCT支持劑。這種方法可以使所有的組織都在同一個(gè)水平面上，有利于完整切片。

（4）冷凍溫度的選擇、冷凍速度和冷凍時(shí)間，對(duì)于冷凍切片都非常關(guān)鍵。大量文獻(xiàn)顯示，不同組織適宜不同溫度：例如富于脂肪的纖維脂肪組織、乳腺組織、皮膚組織及脂肪腫瘤為-40～35℃，質(zhì)地柔韌的組織為-18～25℃，質(zhì)地偏脆軟的組織為-18～20℃，碎小組織則為-15～18℃。而在基層病理科的實(shí)際工作中，一個(gè)病例取材可能有多個(gè)不同組織的樣本，技師不可能為每一個(gè)樣本更改冷凍溫度，通常是設(shè)置為-22℃左右，因此難以制作出最佳的冷凍切片。

急速冷凍與緩慢冷凍的區(qū)別：有研究指出，急速低溫冷凍組織時(shí)，細(xì)胞內(nèi)液和細(xì)胞外液同時(shí)結(jié)冰，形成玻璃狀態(tài)，鏡下表現(xiàn)為細(xì)胞的形態(tài)保存良好，無(wú)收縮，無(wú)冰晶或細(xì)小冰晶，利于顯微鏡下觀察病變。而緩慢降溫導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)液的水分子向細(xì)胞外游離聚集，然后凝結(jié)成冰晶，細(xì)胞發(fā)生膨脹和機(jī)械性擠壓，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化；染色過(guò)程升溫時(shí)，冰融化留下空洞，顯微鏡下見(jiàn)大小不一的空洞，形狀頗似核偏位的脂肪細(xì)胞或印戒樣細(xì)胞，嚴(yán)重影響冷凍診斷的正確性。

（5）切片：一般來(lái)說(shuō)，病理技師選擇組織塊的對(duì)角線作為切入口，同時(shí)注意“留根”，即切片時(shí)注意不要將組織全部切掉，讓其稍有一點(diǎn)連結(jié)，然后用毛筆由上至下把組織撥平整，載玻片附貼。另外，本文作者一般制作2套冷凍切片，1套做染色，另1套則在固定液中備用，當(dāng)需要重新染色時(shí)，可以節(jié)約時(shí)間。

（6）脫片：快速HE染色中，切片經(jīng)歷驟冷驟熱和水洗作用，或載玻片有灰塵、霉菌等雜質(zhì)，或切片太厚，可能出現(xiàn)掉片。因此制作冷凍切片時(shí)一定要用潔凈的玻片，必要時(shí)可采用冷風(fēng)干燥切片、防脫載玻片、或利用漂烘儀烤片等方法防止脫片。

（7）靜電：有文獻(xiàn)探討冷凍切片附貼的靜電現(xiàn)象，建議病理技師切片時(shí)減少毛筆刷掃切片臺(tái)，或摘下橡膠手套后附貼切片，但是，由于新鮮樣本可能帶有可被傳播的感染源，病理技師須遵循標(biāo)準(zhǔn)預(yù)防措施，做好個(gè)人防護(hù)，因此本文作者不支持此種做法。

（8）固定：我科采用95%冷乙醇作為固定液。95%乙醇具有價(jià)格低廉、穿透力強(qiáng)、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)；且對(duì)比甲醇、甲醛等試劑，無(wú)毒副作用，是非常合適的固定液。預(yù)先冷卻乙醇，可以減少因溫差掉片的可能性。

（9）染色與封固中出現(xiàn)的問(wèn)題：因病理技師操作不當(dāng)或時(shí)間不足，可能出現(xiàn)染色不佳、脫水不佳、封固不佳等問(wèn)題。有相關(guān)文獻(xiàn)詳細(xì)探討過(guò)這些問(wèn)題的原因分析和應(yīng)對(duì)措施，本文作者就不贅述了。

總之，冷凍切片質(zhì)量受很多因素影響，有一定的局限性，病理技師只有通過(guò)不斷地研究和總結(jié)，才能制作出高質(zhì)量的冷凍切片，有利于病理醫(yī)師迅速地作出正確的病理診斷，滿足臨床需求，節(jié)省患者就醫(yī)時(shí)間。