尤洪科 尹永華 文博

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬深圳沙井醫(yī)院泌尿外科 518104 廣東深圳

膀胱癌(bladder cancer)在我國(guó)發(fā)病率遠(yuǎn)高于前列腺癌和腎癌，位于泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤第一位[1]。針對(duì)膀胱癌的分子預(yù)后研究可以進(jìn)一步制定腫瘤的個(gè)體化治療和隨訪監(jiān)測(cè)方案。然而，由于既往腫瘤分子預(yù)后研究需要大樣本量的腫瘤標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，工作量大、時(shí)間長(zhǎng)而且研究成本非常高，因此，目前臨床上能用于判斷膀胱癌預(yù)后的生物標(biāo)記物比較少。生物信息學(xué)是近年來非常熱門的研究工具，結(jié)合龐大且可信度高的基因檢測(cè)和腫瘤信息數(shù)據(jù)庫(kù)，為探索膀胱癌預(yù)后分子標(biāo)記提供了極大的方便[2, 3]。

泛素特異肽酶3(ubiquitin specific peptidase 3, USP3)最早于1999年被發(fā)現(xiàn)，基因定位于人類染色體15q22.3，分子量為59 kd，它也是目前已知的第二個(gè)能夠裂解泛素-脯氨酸結(jié)合的泛素特異蛋白酶，維持基因組的穩(wěn)定性[4, 5]。研究表明，USP3可以通過去泛素化調(diào)節(jié)目的蛋白的表達(dá)水平，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6, 7]。然而，到目前為止關(guān)于USP3在膀胱癌中的表達(dá)和作用尚未見相關(guān)研究報(bào)道。本課題首先運(yùn)用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)比較USP3基因在正常膀胱組織和膀胱癌中的差異性表達(dá)，并利用免疫印跡試驗(yàn)、定量PCR和免疫組化進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)合美國(guó)癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)，分析USP3預(yù)測(cè)膀胱癌預(yù)后的作用以及作用機(jī)制，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人膀胱癌細(xì)胞系T24和J82以及人正常尿路上皮細(xì)胞SV-HUC-1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海典型培養(yǎng)物保藏中心。胎牛血清、Opti-DMEM高糖無血清培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；F12K培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。10例人膀胱癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織均選自寶安區(qū)第二人民醫(yī)院集團(tuán)總院泌尿外科2015～2017年手術(shù)切除樣本，標(biāo)本均經(jīng)我院兩位病理專家進(jìn)行病理證實(shí)，采集前經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者知情同意。Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)；熒光定量PCR試劑盒(美國(guó)Roche公司)；免疫組化試劑盒(丹麥DAKO公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；一抗兔抗USP3(美國(guó)Abcam公司)；一抗兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗羊抗兔IgG(美國(guó)CST公司)；超敏ECL發(fā)光試劑盒(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

細(xì)胞培養(yǎng)：人膀胱癌細(xì)胞系T24和J82細(xì)胞用含10%的胎牛血清的Opti-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，而人正常尿路上皮細(xì)胞SV-HUC-1用含10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基培養(yǎng)。所有細(xì)胞均在37.5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)熒光定量PCR：按Trizol說明書抽提細(xì)胞總RNA，對(duì)所得的RNA進(jìn)行濃度、純度和完整性的檢測(cè)。然后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃ 1 s。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，GAPDH作內(nèi)參。采用2-△△CT法進(jìn)行計(jì)算。USP3引物正義鏈序列5' CAAGCTGGGACTGGTACAGAA3'，反義鏈序列5' GCAGTGGTGCTTCCATTTACTT 3'；GAPDH引物正義鏈序列5' AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC3'；反義鏈序列5' TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3'。

免疫蛋白印跡試驗(yàn)(Western Blot)：向細(xì)胞加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30 min。4℃，12 000 g離心30 min，將上清移至新的EP管。然后對(duì)所得的蛋白液進(jìn)行BCA法測(cè)濃度。配制8%的分離膠和5%的濃縮膠，按30 g每孔的上樣量恒壓電泳。然后將蛋白電轉(zhuǎn)至NC膜后，用5%的脫脂奶粉封閉。將目的條帶孵育在USP3(1∶1 000，Abcam)和GAPDH(1∶1000，CST)一抗中4℃過夜。第2天再孵育二抗1 h，然后用超敏ECL發(fā)光液進(jìn)行曝光。曝光儀器采用Syngene Box自動(dòng)曝光儀(Cambridge, UK)。

免疫組織化學(xué)試驗(yàn)：免疫組化采用SP法，DAB染色。嚴(yán)格按照DAKO免疫組化試劑盒來檢測(cè)。常規(guī)脫蠟，水化，3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，枸櫞酸鹽緩沖液行微波抗原修復(fù)。山羊血清封閉，滴加USP3多克隆抗體(1∶100)4℃過夜，滴加生物素標(biāo)記二抗孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，透明，中性樹膠封片。

生物信息學(xué)分析：①USP3基因表達(dá)預(yù)測(cè)：采用Oncomine在線數(shù)據(jù)庫(kù)(www.oncomine.org)比較USP3基因在正常膀胱組織和膀胱癌組織中的表達(dá)差異；②USP3基因與生存分析：采用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)研究USP3基因表達(dá)高低與膀胱癌生存時(shí)間和復(fù)發(fā)率的關(guān)系(https://cancergenome.nih.gov/)；③USP3作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)：利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)USP3相互作用蛋白(https://string-db.org/)；④KEGG Pathway分析：采用生物學(xué)通路數(shù)據(jù)庫(kù)(www.genome.jp)在線預(yù)測(cè)USP3及相關(guān)作用蛋白的KEGG Pathway；⑤GO富集分析：利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)找到富集USP3及相關(guān)作用蛋白的GO分類條目，尋找它們可能的功能(http://www.geneontology.org/)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)USP3基因在膀胱癌和正常膀胱組織中的表達(dá)

利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)檢索比較膀胱癌和正常膀胱組織中USP3基因表達(dá)的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)共有三組研究符合標(biāo)準(zhǔn)(圖1)。從圖1可見，三組研究的結(jié)果都顯示淺表性膀胱癌和浸潤(rùn)性膀胱癌組織中USP3的mRNA水平均明顯高于正常膀胱組織中的表達(dá)(P<0.05)。

2.2 驗(yàn)證USP3在膀胱癌組織和癌旁組織中表達(dá)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證USP3在膀胱癌中的表達(dá)，我們選取了10例膀胱癌及對(duì)應(yīng)的癌旁組織進(jìn)行驗(yàn)證。從PCR檢測(cè)可以觀察到膀胱癌中USP3的mRNA水平要明顯高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織，兩者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2A)。另外，免疫組化結(jié)果也可看出膀胱癌組織中USP3的蛋白含量也高于癌旁正常組織(圖2B)。

2.3 比較USP3在膀胱癌細(xì)胞株和正常尿路上皮細(xì)胞株中的表達(dá)

我們同樣利用Western Blot和熒光定量PCR在細(xì)胞水平上比較USP3在膀胱癌細(xì)胞株和正常尿路上皮細(xì)胞株中蛋白和mRNA的表達(dá)水平。Western Blot結(jié)果可以觀察到膀胱癌細(xì)胞株T24和J82中USP3蛋白含量明顯高于對(duì)照組的正常尿路上皮細(xì)胞株SV-HUC-1(圖2C)。而PCR結(jié)果也驗(yàn)證了膀胱癌細(xì)胞株T24和J82中USP3的mRNA水平明顯高于對(duì)照組的正常尿路上皮細(xì)胞株SV-HUC-1，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2D)。以上結(jié)果說明USP3在膀胱癌中高表達(dá)，很可能一個(gè)癌基因。

2.4 利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析USP3基因表達(dá)高低與膀胱癌總生存期和復(fù)發(fā)率的關(guān)系

USP3表達(dá)高低對(duì)膀胱癌總生存期和復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)的結(jié)果見圖3。生存曲線顯示USP3高表達(dá)組的預(yù)后明顯低于USP3低表達(dá)組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3A)，提示USP3可以作為膀胱癌的一個(gè)預(yù)后標(biāo)記物。另外，雖然USP3高表達(dá)組與低表達(dá)組之間的復(fù)發(fā)率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但結(jié)果顯示USP3高表達(dá)組膀胱癌的復(fù)發(fā)率高于低表達(dá)組(圖3B)。

圖1 USP3基因表達(dá)數(shù)據(jù)

圖2 USP3在膀胱癌細(xì)胞株和正常尿路上皮細(xì)胞株中的表達(dá)

圖3 USP3表達(dá)對(duì)膀胱癌總生存期和復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)結(jié)果

2.5 USP3作用機(jī)制預(yù)測(cè)

為探討USP3可能的作用機(jī)制，我們利用STRING蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示極可能與USP3發(fā)生相互作用的蛋白有10個(gè)(圖4)。對(duì)上述10個(gè)蛋白進(jìn)行GO富集分析，提示USP3相互作用蛋白的主要功能包括組蛋白去泛素化、染色體構(gòu)建、組蛋白修飾(相對(duì)于背景P<0.001)，見表1。另外對(duì)USP3相互作用蛋白進(jìn)行KEGG Pathway分析，結(jié)果顯示與USP3相互作用的蛋白涉及系統(tǒng)性紅斑狼瘡、酗酒、病毒性致癌、基底轉(zhuǎn)錄因子(P<0.05，相對(duì)于背景差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，見表2。

圖4 與USP3發(fā)生相互作用的蛋白

GO ID類別數(shù)目檢錯(cuò)率GO:0016578組蛋白去泛素化43.72e-06GO:0006325染色質(zhì)構(gòu)成73.58e-05GO:0051276染色體構(gòu)成70.000198GO:0016570組蛋白修飾50.000643GO:0031647蛋白穩(wěn)定性調(diào)節(jié)40.00268GO:0043966組蛋白H3 乙?；?0.00322GO:0070647通過小蛋白連接或去除進(jìn)行蛋白修飾50.0192

表2 USP3預(yù)測(cè)交集基因的KEGG Pathway分析

3 討論

膀胱癌作為我國(guó)最常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤，嚴(yán)重影響人民的生命健康。隨著目前對(duì)膀胱癌診斷技術(shù)的發(fā)展(包括影像學(xué)、分子診斷學(xué)等)，越來越多的膀胱癌能在早期被診斷出來，并且接受手術(shù)治療。但是膀胱癌具有復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)，對(duì)于膀胱癌患者術(shù)后是否需要進(jìn)一步干預(yù)以及如何制定個(gè)體化隨訪方案可能影響患者最終的預(yù)后。因此，尋找有效的膀胱癌預(yù)后標(biāo)記物尤為重要。但是，由于膀胱癌預(yù)后標(biāo)記物的探索成本高和隨訪驗(yàn)證時(shí)間長(zhǎng)，所以相對(duì)于數(shù)量充足的膀胱診斷標(biāo)志物(如膀胱腫瘤抗原、核基質(zhì)蛋白22、端粒酶等)，目前有效的膀胱癌預(yù)后標(biāo)記物非常少。然而，隨著生物信息學(xué)的發(fā)展以及全球癌癥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的共享，利用大樣本的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)合驗(yàn)證使尋找膀胱癌預(yù)后標(biāo)記物成為可能。

泛素-蛋白酶體途徑是一個(gè)具有多種功能的蛋白翻譯后修飾的途徑，可以通過調(diào)節(jié)泛素化和去泛素化控制蛋白的表達(dá)水平及信號(hào)通路的活化，參與人體內(nèi)多種細(xì)胞生命活動(dòng)[8]。而這個(gè)途徑包含了泛素化和去泛素化。泛素化涉及的酶包括泛素激活酶、泛素結(jié)合酶和泛素蛋白連結(jié)酶；而發(fā)揮去泛素化作用的酶則包括泛素特異肽酶、去泛素化酶和泛素C端降解酶[9]。泛素特異肽酶既可以裂解泛素與多肽的結(jié)合，又可以裂解轉(zhuǎn)錄后蛋白與泛素的連接[4]。到目前為此，已知的泛素特異肽酶家族成員有22個(gè)，而泛素特異肽酶3(USP3)屬于其中一員。雖然USP3在1999年被發(fā)現(xiàn)，但是目前相關(guān)的研究比較少。研究發(fā)現(xiàn)USP3是組蛋白H2A的去泛素化酶，調(diào)節(jié)DNA雙鏈斷裂時(shí)泛素依賴的DNA修復(fù)[5, 10]。現(xiàn)在大部分的研究集中于USP3對(duì)泛素化作用的過程，探討USP3與腫瘤的關(guān)系的文章非常少。而已有大量研究表明泛素特異肽酶家族的其他成員(如USP9、USP22)與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11, 12]。另外，有文獻(xiàn)報(bào)道USP3的表達(dá)與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6]。而我們的研究是首次通過生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)USP3與膀胱癌密切聯(lián)系，并分析了其作為預(yù)后標(biāo)記物的可能性及機(jī)制。

本課題利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中大樣本量的數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，結(jié)合我們的驗(yàn)證結(jié)果，膀胱癌中的USP3的表達(dá)水平明顯高于正常膀胱組織，無論是在細(xì)胞中還是組織中，提示USP3可能是一種膀胱癌的腫瘤相關(guān)蛋白。然后利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)USP3的表達(dá)與生存期及復(fù)發(fā)率的關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)USP3表達(dá)越高，患者生存期越短，呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，提示USP3可能具有評(píng)估膀胱癌患者生存預(yù)后的作用。而USP3作為一個(gè)膀胱腫瘤相關(guān)蛋白，如何參與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討，而我們的研究結(jié)果為USP3作用網(wǎng)絡(luò)的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)提供了一定的研究思路。