陳繼英 劉超逸 王朔 徐文娣 黃海嬌 姜靜

(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學)，哈爾濱，150040)

歐洲白樺(Betulapendula)廣泛分布于歐亞大陸和北美，其種內變種裂葉樺(B.pendula‘Dalecarlica’)葉片邊緣呈掌狀深裂，具有極高的觀賞價值[1]，是人們喜愛的園林綠化樹種之一[2-3]。近年來，人們通過對擬南芥(Arabidopsisthaliana)、苜蓿(Medicagotruncatula)、白菜(Brassicarapassp.chinensis)等研究，對植物葉緣缺刻變異的遺傳機理逐漸明晰起來，認為葉緣缺刻的形成與生長素的極性運輸產生濃度梯度密切相關[4-10]。有研究證明在植物生長素信號通路中通過可逆磷酸化作用調節(jié)生長素運輸，其中,PPP家族絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶在植物激素信號轉導途徑中發(fā)揮重要作用[11-12]。蛋白激酶和蛋白磷酸酶介導蛋白質的可逆磷酸化是信號轉導的重要機制之一，是生物體內普遍存在的調控細胞信號轉導過程的重要作用方式，根據(jù)以前的研究表明,蛋白磷酸酶參與了ABA、病原侵染、脅迫及發(fā)育信號轉導途徑[13]。

研究團隊為了挖掘控制葉緣缺刻性狀的關鍵基因，以裂葉樺不同發(fā)育時期葉脈組織為材料，構建了基因表達調控網(wǎng)絡，TOPP1(TypeOneProteinPhosphatase1)就是第一層網(wǎng)絡中的轉錄調控因子之一。根據(jù)底物的特異性差異和對特定抑制劑的反應不同，絲氨酸和蘇氨酸蛋白磷酸酶可分為1型(PP1)和2型(PP2)[14]，1型絲氨酸與蘇氨酸蛋白磷酸酶(PP1s)與植物生長和發(fā)育的各種過程有關，在所有的植物物種中，PP1s由多基因家族編碼[15]。PP1s是一大組絲氨酸和蘇氨酸蛋白磷酸酶，在擬南芥中，PP1s被稱為1型蛋白磷酸酶(TOPPs)，先前的研究確認了8個擬南芥的PP1s基因(TOPP1-TOPP8)[15]。以往的研究表明，它們調節(jié)胚胎發(fā)育和藍光依賴的氣孔開放。水稻(Oryzasativa)中PP1基因的過表達可以增強植物的耐鹽性[16]。擬南芥中研究表明，TOPP1是ABA信號通路的一個新的組件，TOPP1基因與它的調節(jié)蛋白AtI-2(ArabidopsisInhibitor-2)負調控ABA信號[17]。然而TOPP1基因在調節(jié)木本植物生長和發(fā)育的分子機制的研究尚不明確。

為了研究白樺(B.platyphylla×B.pendula)BpTOPP1基因的功能，實驗采用qRT-PCR方法進行BpTOPP1的時空表達特性分析，同時以白樺的cDNA為模板克隆BpTOPP1基因并構建35S啟動子驅動的過表達載體，通過農桿菌介導合子胚的方法進行白樺的遺傳轉化。擬探討B(tài)pTOPP1基因在白樺葉發(fā)育過程中的作用。

1 材料與方法

基因定量分析所需的材料取自東北林業(yè)大學白樺育種基地3年生歐洲白樺(對照)和裂葉樺無性系的不同個體，取材部位是歐洲白樺和裂葉樺的第1～4片葉片(L1～L4)，取材時間為5月至9月初，每隔15 d取一次材料，其中6月21日是按組織部位取材，分別采集2個無性系不同單株的頂芽(B)、第1～4片葉片(L1～L4)、嫩莖(S1～S3)、木質部(X)、根(R)、葉脈(P1～P4)、葉柄(V1～V4)等，材料采集后每個無性系相同組織部位混樣后分3～4份包裝并迅速放入液氮中，帶回實驗室置于超低溫冰箱-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

基因克隆材料取自白樺組培苗葉片,白樺遺傳轉化受體為本實驗室保存的白樺優(yōu)樹成熟種子。

1.1 BpTOPP1基因的生物信息學分析與預測

利用ExPASy網(wǎng)站(http://web.expasy.org/protparam/)對BpTOPP1基因進行氨基酸的理化性質分析，登陸NCBI網(wǎng)頁，用BlastP程序對BpTOPP1基因的氨基酸序列進行比對、構建進化樹。

1.2 BpTOPP1的qRT-PCR

利用Primer 5.0軟件設計白樺BpTOPP1基因及內參引物，并利用NCBI網(wǎng)站上的BLAST程序進行基因序列的比對，進而保證引物特異性(表1)，所用引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 qRT-PCR引物序列

采用北京百泰克生物技術有限公司的植物總RNA提取試劑盒將所取的試驗材料提取總RNA，并用ReverTre Ace? qPCR RT Kit(Toyobo，Ltd，Osaka，Japan)反轉錄試劑盒將mRNA反轉錄為cDNA,將cDNA稀釋10倍后用作qRT-PCR的模板[18],以18S rRNA作為內參擴增BpTOPP1基因。反應體系為：2×SBYR Green PCR Master Mix 10 μL,PCR Forward Primer(10 μL/L)1 μL,PCR Reverse Primer(10 μL/L)1 μL,模板(cDNA溶液)2 μL,加入ddH2O補足到20 μL。PCR反應條件:95 ℃ 3 min預變性,然后以95 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s、57 ℃ 40 s進行40個循環(huán)，最后95 ℃ 1 min、55 ℃ 30 s、95 ℃ 30 s,進行溶解曲線分析。在ABI 7500定量PCR儀上完成qRT-PCR，3次重復，用2-ΔΔCt的方法對定量結果進行分析[19-24]。

1.3 BpTOPP1基因的遺傳轉化

BpTOPP1基因通過雙酶切的方法進行載體構建(圖1)，采用農桿菌介導合子胚法進行BpTOPP1基因的遺傳轉化，將切好的白樺無菌合子胚置于DO600=0.5左右的工程菌液中侵染3～5 min，置于暗處進行共培養(yǎng)(WPM+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA)2～3 d，隨后進行選擇培養(yǎng)(WPM+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+50 mg/L潮霉素+200 mg/L頭孢霉素)，2～3周后陸續(xù)產生抗性愈傷組織，20 d后將抗性愈傷轉至分化培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)(WPM+0.8～1.0 mg/L 6-BA+50 mg/L GA3+50 mg/L潮霉素+200 mg/L頭孢霉素)，待其長出不定芽后進行繼代培養(yǎng)(WPM+0.8L～1.0 mg/L 6-BA+50 mg/L潮霉素+200 mg/L頭孢霉素)[25-26]，20～30 d后不定芽生長至3～5 cm時，轉入生根培養(yǎng)基(WPM+0.2 mg/L IBA)中，獲得白樺潮霉素抗性株系。

圖1 植物表達載體示意圖

1.4 轉基因植株的分子檢測

利用BioTeke新型快捷植物基因組DNA提取試劑盒提取轉基因白樺和WT葉片的DNA。以各株系DNA為模版，以BpTOPP1-F1(5’-GGGGTACCATGGAACCTGCAGTCCTGGA-3’)、BpTOPP1-R1(5’-GCTCTAGAATCACTAGGCTTAGCTGCAGCTG-3’)為引物，進行PCR鑒定。以各株系葉片cDNA為模板，以BpTOPP1-F、BpTOPP1-R為引物，以18 S為內參進行qRT-PCR，3次重復。通過2-ΔΔCT法計算BpTOPP1基因在各株系中的相對表達量。

1.5 生長性狀的調查

采用組培技術擴大繁殖獲得的轉基因及對照白樺，2017年5月中旬將組培生根苗移栽至育苗盤中，每個株系移栽50株，在同年9月中旬時進行葉綠素調查，用手持型葉綠素儀(SPAD502，Japan)測定轉基因株系和對照株系的葉綠素質量分數(shù)，選取功能葉進行測定，每個株系測10株，每株測3次重復。在9月末植物停止生長后，每個株系分別選擇10株生長一致的苗木，取第4片功能葉進行葉面積、葉寬和葉長的調查，并對這10株苗木進行苗高和地徑調查。

2 結果與分析

2.1 BpTOPP1基因的生物信息學

利用ExPASy網(wǎng)站(http://web.expasy.org/protparam/)對BpTOPP1基因以及其家族基因進行氨基酸的理化性質分析，結果表明BpTOPP1轉錄因子基因編碼氨基酸為313個，分子式為C1603H2487N427O461S20，分子質量為35 758.16 u，原子總數(shù)為4 998。通過白樺轉錄組測序得到BpTOPP1基因的全長序列，用NCBI上的ORF finder對該序列進行分析，該基因包含1個942 bp的開放閱讀框，終止密碼子為UGA，該基因包含4個外顯子和3個內含子。通過NCBI找出擬南芥(Arabidopsisthaliana)的PP1s氨基酸序列，與白樺的BpTOPP1的全長氨基酸序列繪制進化樹(圖2)，結果顯示：白樺BpTOPP1與擬南AtTOPP6和AtTOPP4氨基酸序列同源性最高。

圖2 BpTOPP1進化樹分析

2.2 BpTOPP1基因在野生型歐洲白樺和裂葉樺中的表達模式

為了更好的了解BpTOPP1基因在白樺生長發(fā)育過程中的作用，試驗分析了BpTOPP1基因在歐洲白樺和裂葉樺中的表達模式。不同組織器官qRT-PCR結果顯示，在歐洲白樺中，只有L2葉片的BpTOPP1基因呈現(xiàn)上調表達，其表達量是對照的2.03倍；該基因在其他組織部位中均呈現(xiàn)顯著下調表達(P<0.05,F=1 307)，其表達量的平均值低于對照的84.13%(圖3)。在裂葉樺中，該基因在第3幼莖及L1～L4葉柄呈上調表達，其表達量平均值是對照的1.83倍，在V2葉脈中該基因的表達量無明顯差異；而在其他組織部位均呈現(xiàn)下調表達，其表達量的平均值低于對照的62.88%(圖3)。通過測定BpTOPP1基因在兩種樺樹中的表達量，推測該基因與白樺葉片的生長發(fā)育相關。

植物組織部位

為了能更進一步了解BpTOPP1基因在白樺的生長發(fā)育過程中的作用，試驗又分析了不同時期BpTOPP1基因在裂葉樺和歐洲白樺葉片中的表達，結果見圖4。若以5月5日兩種樺樹的第4片葉為對照，測定BpTOPP1基因的表達量，qRT-PCR結果顯示，在不同的時期，BpTOPP1基因在兩種樺樹中均表達，在5月5和8月22日時，裂葉樺中該基因的表達量顯著高于歐洲白樺，分別是歐洲白樺的4.24和11.1倍，而在7月21日時，該基因的表達量在歐洲白樺中顯著高于裂葉樺，是裂葉樺的10.72倍。

日期

2.3 35S::BpTOPP1轉基因白樺的獲得

采用雙酶切的方法構建了BpTOPP1過表達載體，以野生型白樺的cDNA為模板，分別用KpnI和XbaI對BpTOPP1基因及1300質粒進行雙酶切，將酶切純化后的BpTOPP1與載體質粒1300進行連接，獲得重組質粒，命名為35S::BpTOPP1。

BpTOPP1基因的遺傳轉化采用農桿菌介導合子胚的方法，將選取的種子在自來水下沖洗2～3 d，待種子充分吸水飽滿后，即將露出芽點時，在超凈工作臺中對種子進行表面消毒。在無菌培養(yǎng)皿中縱切合子胚，去掉種皮，將切好的合子胚置于已經(jīng)活化好的含有35S::BpTOPP1的工程菌液中，侵染白樺合子胚后共培養(yǎng)，然后進行選擇培養(yǎng)。20 d后將獲得的抗性愈傷組織轉至分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，10～15 d長出抗性不定芽后轉至繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)，30 d后長出潮霉素抗性叢生苗，10～15 d可以獲得生根苗，將生根苗移栽至育苗盤中，獲得35S::BpTOPP1轉基因白樺6個株系，命名為TO-1…TO-6(圖5)。

2.4 35S::BpTOPP1轉基因白樺的分子檢測

試驗獲得6個35S::BpTOPP1遺傳轉化子，分別提取潮霉素抗性株系的1年生苗木的總DNA，以中間載體質粒1300為陽性對照，WT為陰性對照，同時設水對照，對潮霉素抗性植株進行PCR擴增檢測(圖6)。結果顯示，6個35S::BpTOPP1潮霉素抗性株系均在在942 bp處擴增出了單一條帶，而WT株系沒有擴增出條帶(圖6)，因此可以初步判斷，外源目的基因已經(jīng)整合到白樺基因組中。

1.DNA Marker DL2000；2.陽性對照；3.陰性對照；4.水對照；泳道5～10為35S::BpTOPP1轉基因的白樺。

為了檢測外源基因在轉基因白樺體內的穩(wěn)定性遺傳，對1年生的轉基因白樺進行RT-PCR檢測，結果顯示(表2)，35S::BpTOPP1轉基因白樺中BpTOPP1基因的相對表達量均顯著高于WT(P<0.05,F=17 970)，6個株系中該基因的平均表達量是WT的8.12倍,其中TO-6株系中BpTOPP1基因的相對表達量最高，表達量是WT的18.75倍，可以進一步說明外源BpTOPP1基因在轉基因白樺組織細胞中能夠過量表達。

表2 轉基因和非轉基因對照白樺中BpTOPP1基因的表達特性

注：表中數(shù)據(jù)是平均值±標準差，數(shù)據(jù)后同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.5 35S::BpTOPP1轉基因白樺的表型特征

對35S::BpTOPP1轉基因白樺進行表型觀察，結果發(fā)現(xiàn)，6個轉基因白樺株系葉片延遲脫落(圖7A)，對相同時期的第1片葉進行觀察發(fā)現(xiàn)，轉基因植株的第1片葉正處于生長期(圖7C、D)，而WT植株的第1片葉已經(jīng)發(fā)育成成熟葉片，葉片表面革質化(圖7B)；掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，轉基因株系葉脈上分布較多表皮毛(圖7D、F)，而WT株系葉脈上則少見表皮毛(圖7E)。

A.轉基因株系和非轉基因對照株系的葉片脫落情況；B.非轉基因對照白樺的第一片葉；C、D.轉基因白樺的第一片葉；E.非轉基因對照白樺葉脈的表皮毛；F、G.轉基因白樺葉脈的表皮毛。

2.6 35S::BpTOPP1轉基因植株生長形狀

獲得的6個1年生的35S::BpTOPP1轉基因株系，可以觀察到轉基因株系的葉片變小(表3)，轉基因植株與WT株系差異明顯,葉面積平均值為21.32，低于WT葉面積的42.2%(P<0.05，F(xiàn)=298.531)，對轉基因株系進行葉片長度和寬度調查，轉基因株系的葉片長度和寬度也顯著低于WT，其葉片長度的平均值是5.74 cm，低于WT葉片長度的30.42%(P<0.05，F(xiàn)=1 519),其葉片寬度的平均值是4.41 cm，低于WT葉片寬度32.31%(P<0.05，F(xiàn)=837.846)(表3)。

表3 1年生BpTOPP1轉基因白樺的葉面積及葉片長寬

注：表中數(shù)據(jù)是平均值±標準差，數(shù)據(jù)后同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

轉基因白樺苗高、地徑及葉綠素質量分數(shù)比較，對1年生的6個35S::BpTOPP1轉基因白樺進行苗高和地徑的方差分析，結果顯示，2個性狀在株系間的差異均達到了顯著水平,在苗高生長方面，6個轉基因株系均顯著低于WT株系，其平均苗高為WT的80.28%，其中轉基因株系TO-2的苗高最矮，僅為WT的57.41%(P<0.05，F(xiàn)=118.902)；在地徑生長方面，除TO-1株系外，其他5個轉基因株系地徑均顯著高于WT株系，其中TO-5株系地徑高于WT的12.16%(P<0.05，F(xiàn)=53.424)；葉綠素相對質量分數(shù)調查顯示，轉基因株系TO-2、TO-4、TO-5和TO-6等4個轉基因株系顯著高于WT株系(P<0.05，F(xiàn)=34.319)，其均值高于WT的1.05倍，TO-1、TO-3轉基因株系與WT株系差異不明顯(表4)。

表4 1年生BpTOPP1轉基因白樺的苗高地徑及葉綠素比較

注：表中數(shù)據(jù)是平均值±標準差，數(shù)據(jù)后同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 結論與討論

葉片是植物體營養(yǎng)器官中對環(huán)境變化最為敏感的器官，是植物進行光合作用和蒸騰作用的主要器官[27-29]。其形態(tài)、結構和生理特性易受水分、溫度、光照等環(huán)境因素的影響，不同環(huán)境條件下植物的葉片形態(tài)結構差異很大,如:強光生境下，植物葉片小而厚、葉片內部柵欄組織發(fā)達；弱光條件下，葉片形態(tài)大而薄、比葉質量??；高溫環(huán)境下，植物體現(xiàn)出葉片較厚、氣孔密度大、比葉面積增加等適應特征[30-31]。本研究克隆的BpTOPP1基因，該基因在木本植物中研究較少，在擬南芥研究證明，TOPPS基因參與植物的生長和發(fā)育的各個過程，主要在根、蓮座葉和花中表達[15]，擬南芥TOPP4基因在幼苗中是高表達的，而且該基因在葉片中形成表皮扁平細胞相互交錯起到關鍵作用，通過抑制TOPP4基因的表達量會出現(xiàn)矮化的表型[32-33]。本研究發(fā)現(xiàn)，在相同條件下過表達株系中BpTOPP1基因的表達量較非轉基因對照有明顯的提高；過表達株系的葉片面積、葉長和葉寬均顯著小于野生型對照；因此，認為該基因對于白樺葉片的生長發(fā)育起到重要的作用。對獲得轉基因白樺的生長性狀進行調查發(fā)現(xiàn)，其高生長比較緩慢，顯著低于野生型對照植株，BpTOPP1基因在參與葉發(fā)育調控的同時是否也參與調控植物的高生長，其調控途徑如何，這些還需深入研究。

歐洲白樺和裂葉樺的時空表達分析表明：在分部位表達中，BpTOPP1基因在歐洲白樺L2葉中的表達量顯著高于其他組織，其表達量高于對照的103.36%，在裂葉樺中該基因主要在葉脈中呈現(xiàn)上調表達，其平均值為對照的1.97倍；在時序表達中，7月21日時BpTOPP1基因在歐洲白樺中的表達量達到峰值，在5月5日和8月22日時該基因在裂葉樺中的表達量較高。根據(jù)該基因在兩種樺樹時空表達分析推測該基因與葉發(fā)育相關。

目前，在植物中已確定了多種蛋白激酶和蛋白磷酸酶，其中蛋白磷酸酶和蛋白激酶一樣能對生物體內的有關代謝起重要的調節(jié)作用[34]。在擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)ABA信號轉導通路的新的組成部分，即1型蛋白磷酸酶1(TOPP1)及其調控蛋白AtI-2，它們在ABA信號轉導通路中起負調控作用，而這種抑制可通過AtI-2加強[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著植物停止生長，轉基因白樺出現(xiàn)葉片延遲脫落的現(xiàn)象，因此推測BpTOPP1基因在在ABA信號轉導通路中起作用。

本研究主要對BpTOPP1過表達轉基因白樺及非轉基因對照進行表型分析，探討B(tài)pTOPP1基因與白樺生長發(fā)育的關系，為揭示該基因在白樺生長和葉發(fā)育中行使的功能提供參考。當然，植物的葉發(fā)育過程中涉及到多條基因的調控，基因間的關系也極其復雜，因此我們團隊將繼續(xù)探討B(tài)pTOPP1基因在葉片的生長發(fā)育過程中的作用，進一步闡明BpTOPP1基因的功能。