劉欣穎 劉寶光 王志鳳 劉慧子 李偉 姜立泉

(林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

木材是植物次生生長所形成的木質(zhì)化組織，是制漿造紙、建筑和生物質(zhì)能源的重要原材料，是不可或缺的可再生資源[1-2]。木材的形成過程包括維管形成層分化形成次生木質(zhì)部以及木質(zhì)部中細(xì)胞壁的加厚[3-5]。前人的研究發(fā)現(xiàn)，該發(fā)育過程受到不同水平的分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，其中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是一個非常關(guān)鍵的調(diào)控環(huán)節(jié)[6]。研究轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控木材形成分子機(jī)制能夠?yàn)樘岣呱稚a(chǎn)力提供一條嶄新且精確的遺傳改良途徑[7-8]。

NAC和MYB等家族轉(zhuǎn)錄因子在木質(zhì)部發(fā)育中起著重要調(diào)控作用[9]。在擬南芥中MYB46和MYB83是SND1的下游基因能夠激活次生壁生物合成相關(guān)基因表達(dá)[10-12]。SND1在楊樹中有4個同源基因PtrSND1-A1、A2、B1和B2，并且PtrSND1-B1能夠直接激活MYB46的同源基因PtrMYB2和PtrMYB21的表達(dá)[13-14]。楊樹的PtrMYB2/3/20/21、桉樹的EgMYB2和松樹的PtMYB4參與調(diào)控木材形成中次生壁的生物合成[15-16]。通過對毛白楊的研究表明，PtoMYB216參與調(diào)控木材形成中木質(zhì)素的生物合成[17]。PtoMYB170過表達(dá)情況下增加木質(zhì)素含量并導(dǎo)致木質(zhì)部次生細(xì)胞壁增厚[18]。PtoMYB156過表達(dá)情況下抑制次木質(zhì)部中纖維細(xì)胞的細(xì)胞壁增厚并且導(dǎo)致其纖維素、木質(zhì)素和木聚糖含量下降[19]。桉樹中EgMYB1通過EgH1.3的組蛋白修飾在木材形成中抑制木質(zhì)部合成并且降低木質(zhì)素含量[20]。總之，MYB轉(zhuǎn)錄因子在參與木質(zhì)部發(fā)育過程中扮演了必不可少的角色[21]。

本團(tuán)隊(duì)通過收集毛果楊不同組織進(jìn)行RNA-seq分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PtrMYB161在木質(zhì)部特異性表達(dá)。同時，利用激光顯微切割技術(shù)收集木質(zhì)部不同類型細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq分析，結(jié)果顯示該基因在纖維細(xì)胞中高豐度表達(dá)。以上結(jié)果說明該基因可能在木質(zhì)部發(fā)育過程中起著調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)以PtrMYB161為研究對象，對其在木質(zhì)部發(fā)育過程中的表達(dá)調(diào)控進(jìn)行初步探索。

1 材料與方法

以室溫室內(nèi)人工培養(yǎng)的毛果楊(Populustrichocarpa)為材料進(jìn)行材料收集與農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化。膠回收、質(zhì)粒提取試劑盒購自QIAGEN公司(美國)；PCR擴(kuò)增有關(guān)試劑、DNA marker、限制性內(nèi)切酶Xba I和Sac I、T4 DNA ligase購自NEB(中國北京)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和pENTR/D-topo試劑盒購自invitrogen公司，pfu高保真酶購自Aglient公司，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master 購自羅氏公司，大腸桿菌TOP10感受態(tài)、農(nóng)桿菌GV3101以及pBI121載體為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1 PtrMYB161基因特異表達(dá)

對溫室生長4個月大的毛果楊木質(zhì)部、韌皮部、葉片、頂芽和形成層進(jìn)行收集，并利用激光顯微切割方法對纖維細(xì)胞、導(dǎo)管細(xì)胞和形成層細(xì)胞分別進(jìn)行收集。對以上組織細(xì)胞進(jìn)行RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測序分析。

1.2 PtrMYB161基因克隆和表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!search)所公布的mRNA序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)PtrMYB161pE-F/R(表1)，用質(zhì)粒提取試劑盒對毛果楊木質(zhì)部的總RNA進(jìn)行提取并反轉(zhuǎn)錄作為模板，進(jìn)行目標(biāo)基因擴(kuò)增，將純化后的PCR產(chǎn)物連接至pENTR載體，選取陽性克隆命名為Pentr-PtrMYB161-1，由生物公司進(jìn)行測序。將得到的具有目的片段的質(zhì)粒再經(jīng)過引物PtrMYB161pBI121-F/R(表1)進(jìn)行擴(kuò)增，利用XbaⅠ、SacⅠ將擴(kuò)增后的產(chǎn)物和pBI121載體質(zhì)粒雙酶切，膠回收后的產(chǎn)物連接T4載體并用引物35S-F和PtrMYB161pBI121-R(表1)驗(yàn)證陽性克隆，命名為pBI121-PtrMYB161-1，送至生物公司測序。

表1 引物序列

注：TCTAGA是Xba I；GAGCTC是Sac I。

1.3 PtrMYB161基因亞細(xì)胞定位

成功構(gòu)建PtrMYB161基因融合綠色熒光蛋白(GFP)瞬時表達(dá)載體，并利用氯化銫—溴化乙錠超高速梯度密度離心方法進(jìn)行質(zhì)粒提取，利用團(tuán)隊(duì)已建立的毛果楊木質(zhì)部原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，對PtrMYB161轉(zhuǎn)錄因子蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析，質(zhì)粒與細(xì)胞核定位的瞬時表達(dá)載體(H2A:mCherry)各5 μL與毛果楊木質(zhì)部分離出來的原生質(zhì)體100 μL進(jìn)行共轉(zhuǎn)化，并過夜培養(yǎng)，次日通過熒光顯微鏡進(jìn)行鏡檢觀察。

1.4 轉(zhuǎn)基因毛果楊獲得及分子水平分子檢測

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對3周大長勢健康的毛果楊的第2、3莖節(jié)進(jìn)行浸染并選出抗性株系進(jìn)行DNA水平檢測，利用引物35S-PtrMYB161mid-F/R(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對得到陽性植株進(jìn)行擴(kuò)繁。

經(jīng)過qRT-PCR檢測PtrMYB161基因在RNA水平的表達(dá)情況，利用RNA提取試劑盒對獲得的陽性轉(zhuǎn)基因植株RNA提取，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用野生型cDNA作為對照組，Actin作為內(nèi)參基因。利用引RT-PCR-PtrMYB161-F/R(表1)，對野生型和轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行RT-PCR檢測。反應(yīng)完畢后，根據(jù)2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[22]。

1.5 過表達(dá)轉(zhuǎn)基因毛果楊的表型觀察

選取轉(zhuǎn)基因株系中表達(dá)量最高的株系和同時期的對照組野生型毛果楊各3棵，同時移栽到土里，在相同條件下進(jìn)行觀察，培養(yǎng)120 d后，對植株的高度、葉面積、莖節(jié)長度以及莖直徑進(jìn)行測量，并利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行差異性統(tǒng)計(jì)分析。并對轉(zhuǎn)基因株系和對照組野生型毛果楊同時選取第8莖節(jié)進(jìn)行石蠟切片并染色進(jìn)行表型觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 PtrMYB161基因在不同組織中差異表達(dá)

為了解PtrMYB161基因在毛果楊中不同組織中的表達(dá)差異，分別對溫室生長4個月大的毛果楊形成層、木質(zhì)部、韌皮部、葉片和頂芽進(jìn)行收集，并利用激光顯微切割對木質(zhì)部中的纖維細(xì)胞、導(dǎo)管細(xì)胞和形成層細(xì)胞進(jìn)行收集，并分別對以上5種組織和3種收集的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果如表2所示：組織水平上PtrMYB161基因在木質(zhì)部特異表達(dá)，在形成層、韌皮部、葉片和頂芽中微弱的表達(dá)，在細(xì)胞水平上PtrMYB161基因主要在纖維細(xì)胞中表達(dá)，推測PtrMYB161基因可能參與調(diào)控木質(zhì)部發(fā)育進(jìn)而影響楊樹次生生長。

2.2 PtrMYB161全長基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建

以野生型毛果楊木質(zhì)部為材料，利用RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA提取，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，進(jìn)行擴(kuò)增，獲得條帶清晰單一且與PtrMYB161基因預(yù)期的大小相一致。將帶有目的片段的陽性克隆進(jìn)行測序，測序結(jié)果通過DNAstar軟件進(jìn)行比對分析，結(jié)果表明克隆片段與目的基因完全相同，將測序正確的菌液命名為Pentr-PtrMYB161-1，根據(jù)植物過表達(dá)載體pBI121的圖譜進(jìn)行PtrMYB161過表達(dá)載體的構(gòu)建。比對序列結(jié)果顯示植物表達(dá)載體構(gòu)建成功。利用液氮凍融法將pBI121-PtrMYB161質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，檢驗(yàn)陽性克隆，保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 PtrMYB161基因在不同組織中特異表達(dá)

2.3 PtrMYB161亞細(xì)胞定位結(jié)果分析

轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核行使功能，為了解PtrMYB161基因是否是典型的轉(zhuǎn)錄因子，是否定位在細(xì)胞核，現(xiàn)構(gòu)建了PtrMYB161基因融合綠色熒光蛋白(GFP)瞬時表達(dá)載體。利用超高速梯度密度離心提取高純度的PtrMYB161:sGFP質(zhì)粒，將提取出的PtrMYB161:sGFP質(zhì)粒與實(shí)驗(yàn)室已有的細(xì)胞核定位的瞬時表達(dá)載體(H2A:mCherry)，共同進(jìn)行毛果楊木質(zhì)部原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化。結(jié)果如圖1所示：PtrMYB161基因融合GFP發(fā)出的綠色熒光與細(xì)胞核定位的H2A基因融合mCherry發(fā)出的紅色熒光完全重疊，重疊區(qū)域顯示出黃色的光。這一結(jié)果表明：PtrMYB161轉(zhuǎn)錄因子定位在細(xì)胞核，具有轉(zhuǎn)錄因子的典型特征。

綠色為PtrMYB161:sGFP定位信號；紅色為H2A:mCherry核定位Marker；黃色為PtrMYB161融合GFP發(fā)出的綠色熒光與細(xì)胞核定位的H2A融合mCherry發(fā)出的紅色熒光完全重疊。

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的獲得及分子水平鑒定

用含有pBI121-PtrMYB161的農(nóng)桿菌GV3101浸染毛果楊莖段，利用引物35S-F和35S-PtrMYB161mid-R (表1)對提取出的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖2)，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示的結(jié)果表示抗性植株中均含有目的基因，說明帶有PtrMYB161基因的pBI121過表達(dá)載體質(zhì)粒成功整合到毛果楊基因組中。

M.DNA Marker DL 2000；P.含有PtrMYB161的pBI121載體質(zhì)粒作為陽性對照；1～6.6個抗性植株的DNA水平PCR條帶；W.野生型毛果楊DNA結(jié)果作為陰性對照；H.ddH2O作為陰性對照。

利用qRT-PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)基因植株中的PtrMYB161基因的過表達(dá)水平進(jìn)行鑒定，分別提取苗齡4周的6個轉(zhuǎn)基因株系和相同培養(yǎng)狀況的3株野生型無菌苗的第3片葉子總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用基因特異性引物RT-PCR-PtrMYB161F/R(表1)，進(jìn)行熒光定量PCR。檢測結(jié)果如表3所示：轉(zhuǎn)基因毛果楊(L1-L6)與野生型毛果楊(W1-W3)相比，轉(zhuǎn)基因植株均為PtrMYB161過表達(dá)植株，其中轉(zhuǎn)基因L5株系過表達(dá)水平最高，相比于野生型過表達(dá)了5 000倍；L1和L6株系相對于野生型過表達(dá)了3 000多倍；L3和L4株系相對于野生型過表達(dá)了1 000多倍；L2株系相對于野生型過表達(dá)水平較低，過表達(dá)了500倍。由于L5株系表達(dá)最高，因此選擇該株系對PtrMYB161過表達(dá)后的表型進(jìn)行觀察，本研究選擇移栽3棵L5和3棵WT到土中，進(jìn)行下一步表型觀測。

2.5 轉(zhuǎn)基因株系表型性狀

對PtrMYB161過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，在相同時間和條件下培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株相比，轉(zhuǎn)基因株系的植株高度、葉片面積、莖節(jié)長度和莖直徑與野生型植株相比明顯變矮、變小，莖段木質(zhì)部層數(shù)與野生型相比明顯減少，相同視野下，轉(zhuǎn)基因植株莖段纖維細(xì)胞與導(dǎo)管細(xì)胞數(shù)量明顯少于野生型纖維細(xì)胞與導(dǎo)管細(xì)胞數(shù)量選取土培約120 d的3棵L5轉(zhuǎn)基因株系和3棵野生型植株，對其莖節(jié)長度、葉片面積和莖直徑進(jìn)行測量，利用SPSS 21.0軟件，通過檢驗(yàn)的方法對其差異顯著性進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3，轉(zhuǎn)基因植株與野生型相比植株高度、莖節(jié)長度、莖直徑和葉片面積顯著變小(表4)，并對同期種植到土中的L5和野生型第8莖節(jié)進(jìn)行石蠟切片并染色觀察發(fā)現(xiàn)，在第8莖節(jié)中的L5次生壁細(xì)胞的層數(shù)明顯少于同期種植的野生型如圖4(A、B)，并且在相同視野下野生型植株木質(zhì)部中纖維細(xì)胞與導(dǎo)管細(xì)胞的數(shù)量明顯大于L5植株木質(zhì)部中纖維細(xì)胞與導(dǎo)管細(xì)胞的數(shù)量。上述觀測結(jié)果表明過表達(dá)PtrMYB161基因顯著的影響了毛果楊木質(zhì)部發(fā)育和毛果楊的生長發(fā)育。

表3 轉(zhuǎn)基因植株熒光定量PCR檢測

注：表中數(shù)據(jù)相對表達(dá)水平±標(biāo)準(zhǔn)誤；WT1、WT2、WT3.野生型毛果楊；L1～L6. 6個轉(zhuǎn)基因毛果楊植株。

表4 轉(zhuǎn)基因毛果楊表型的統(tǒng)計(jì)

注：表中數(shù)據(jù)“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”；** 表示L5和WT間存在極顯著差異(p<0.01)。

A.移栽到土中的轉(zhuǎn)基因植株(WT.野生型植株作為對照；L5.轉(zhuǎn)基因植株)；B.葉片大小比較(WT.野生型植株第6片葉子作為對照；L5.轉(zhuǎn)基因植株第6片葉子)；C.莖段長度比較(WT.野生型植株第6莖節(jié)作為對照；L5.轉(zhuǎn)基因植株第6莖節(jié))。

A.野生型對照組第8莖節(jié)石蠟切片 B.L5第8莖節(jié)石蠟切片

3 結(jié)論與討論

本研究通過毛果楊的組織特異性分析發(fā)現(xiàn)PtrMYB161基因在毛果楊各個部位和木質(zhì)部的不同細(xì)胞類型中均有不同程度表達(dá)，其中在木質(zhì)部和纖維細(xì)胞中表達(dá)豐度最高，這暗示著PtrMYB161基因可能參與調(diào)控木質(zhì)部發(fā)育及纖維細(xì)胞形成[23]。在對PtrMYB161亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)其定位在細(xì)胞核，這為功能未知的轉(zhuǎn)錄因子研究提供了初步線索[24-25]。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證PtrMYB161基因是否與木質(zhì)部發(fā)育有關(guān)，本研究通過構(gòu)建過表達(dá)載體獲得過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株并對其進(jìn)行表型和切片觀察分析，過量表達(dá)PtrMYB161基因植株的株高、葉面積、莖節(jié)長度和莖直徑明顯小于同期野生型對照組，這一現(xiàn)象很有可能說明過表達(dá)的PtrMYB161導(dǎo)致木質(zhì)素的異位沉積[23]，并且轉(zhuǎn)基因組的木質(zhì)部層數(shù)、纖維細(xì)胞明顯小于同期野生型對照組，這說明在木質(zhì)部和纖維細(xì)胞中特異表達(dá)的PtrMYB161基因可能通過參與調(diào)控木質(zhì)部或纖維細(xì)胞形成進(jìn)而影響毛果楊生長發(fā)育[26]。

在木本植物中，許多參與次生壁合成調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)被鑒定出來，目前研究重點(diǎn)主要在MYBs、NACs等轉(zhuǎn)錄因子[27]，PtrMYB161屬于MYB轉(zhuǎn)錄因子家族，已有研究報(bào)道PtrMYB161是PtrWND基因的下游調(diào)控因子[28]。PtrMYB161在擬南芥中的同源基因AtMYB52已有報(bào)道其參與調(diào)控次生細(xì)胞壁合成，AtMYB52基因過表達(dá)會影響參與次生壁合成相關(guān)基因表達(dá)[29]。PtrMYB161具有與AtMYB52類似的功能，在毛果楊次生壁合成方面發(fā)揮著重要調(diào)控作用。此外，有研究報(bào)道AtMYB52過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株對ABA敏感，響應(yīng)干旱脅迫和鹽脅迫[30]。因此，這也暗示著PtrMYB161也有可能參與調(diào)控毛果楊對干旱、鹽等逆境脅迫存在響應(yīng)。后續(xù)研究中，我們將除了通過對PtrMYB161啟動子活性分析，下游靶基因鑒定等進(jìn)一步解析其調(diào)控毛果楊木質(zhì)部發(fā)育的作用機(jī)制，也將研究干旱脅迫條件下該基因?qū)γ麠钅举|(zhì)部發(fā)育的影響。

本研究中我們發(fā)現(xiàn)PtrMYB161基因在木質(zhì)部特異表達(dá)，并且主要在纖維細(xì)胞中特異表達(dá)，過量表達(dá)PtrMYB161基因?qū)е罗D(zhuǎn)基因植株矮小、木質(zhì)部面積減少，表明該基因在毛果楊木質(zhì)部發(fā)育中起著至關(guān)重要的調(diào)控作用，為深入研究其分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。