付 瑩， 皮 杰，趙玉蓉，王紅權(quán)

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長沙 410128；2.湖南應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，湖南常德 415000；3.水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南常德 415000）

在當(dāng)前的集約化養(yǎng)殖模式和日益嚴(yán)重的環(huán)境污染下，水體常常出現(xiàn)氨氮大量積累。大多數(shù)硬骨魚類對(duì)氨氮毒性非常敏感，水體中高濃度氨會(huì)導(dǎo)致魚血液中氨氮含量升高，影響魚類的呼吸系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，從而抑制魚類生長、降低魚體免疫力、阻礙魚體能量代謝和離子平衡（Qian 等 ，2016；Schram 等 ，2014；Braissant 等 ，2013；強(qiáng)俊等，2011）。因此，尋找一種能有效緩解氨氮毒性的營養(yǎng)添加劑迫在眉睫。α-酮戊二酸（α-KG）是三羧酸循環(huán)中重要的代謝中間產(chǎn)物，同時(shí)也是連接機(jī)體內(nèi)碳-氮代謝的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。大量研究表明，α-KG能夠調(diào)節(jié)機(jī)體氮代謝 （魏玉強(qiáng)，2015），促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)的蛋白質(zhì)合成 （Yao等，2012；王蕾等，2010），提高動(dòng)物生長性能（余親平等，2010；胡泉舟，2008）；緩解動(dòng)物在應(yīng)激狀態(tài)下的能量代謝障礙（Li等，2010；劉堅(jiān)等，2009），為機(jī)體供能；并維持動(dòng)物腸道健康（胡泉舟等，2008；Kristensen等，2002），提高機(jī)體免疫力（宋方杰等，2016；王連生等，2016）。

Rh糖蛋白（Rhesus glycoproteins）是一類廣泛存在于真細(xì)菌、原生生物和動(dòng)物體內(nèi)的蛋白。大量研究表明，Rh糖蛋白在魚類氨轉(zhuǎn)運(yùn)的過程中有著重要的作用，能介導(dǎo)氨的轉(zhuǎn)運(yùn)和排泄 （Sinha等，2013；Nakada等，2007； Hung等，2007）。熱休克蛋白（HSP）是細(xì)胞受到各種刺激后誘導(dǎo)產(chǎn)生的一組應(yīng)激蛋白，對(duì)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，HSP70在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、提高細(xì)胞對(duì)應(yīng)激原的耐受性和促進(jìn)免疫反應(yīng)等方面 （楊震國，2010；Srivastava 等，2002；Jacquiersarlin 等，1994；Welch等，1991）具有重要作用。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）是一類能調(diào)節(jié)目標(biāo)基因表達(dá)的核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄因子 （劉美蓮，2001），在心血管保護(hù)、炎癥形成的抑制、免疫的調(diào)節(jié)、胰島素抵抗的治療和細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用（Vosper等，2002；Berger等，2002）。

研究表明，日糧中添加α-KG能夠顯著影響HSP70和PPARγmRNA在草魚鰓、腎、脾臟和肝臟中的表達(dá)（梁健等，2014b）；并且在急性氨氮脅迫的條件下，日糧α-KG能夠顯著影響草魚體內(nèi)Rhag和Rhcg2的表達(dá)，對(duì)草魚的急性氨氮脅迫有一定緩解作用（梁健，2014a），但對(duì)草魚慢性氨氮脅迫的相關(guān)研究還鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)擬探究飼料中添加α-KG對(duì)慢性氨氮脅迫下草魚（Ctenopharyngodonidellus） 腎 中 Rhag、Rhcg1、Rhcg2、HSP70和PPARγmRNA在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)及其規(guī)律，以期為草魚的健康養(yǎng)殖和綠色環(huán)保飼料開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼糧 根據(jù)草魚配合飼糧標(biāo)準(zhǔn)（SCT 1024-2002）配制基礎(chǔ)飼糧，配方及營養(yǎng)成分見表1。研究表明，草魚飼糧中α-KG的最宜添加量為7.5 g/kg（Wang 等，2016；梁健 2014a）。 因此，本試驗(yàn)以7.5 g/kgα-KG等量替代基礎(chǔ)飼糧中次粉，配制α-KG飼糧。用逐級(jí)擴(kuò)大法將飼料原料均勻混合，制成直徑2 mm的顆粒料，自然風(fēng)干后置于-20℃保存?zhèn)溆?。?KG購自湖北遠(yuǎn)成集團(tuán)，純度99.8%。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及分組 試驗(yàn)用草魚購自湘陰巨豐漁業(yè)有限公司，飼養(yǎng)于容積為250 L的塑料桶。選取體格相近的健康草魚270尾 [初始體重為（24.79±0.11）g]，隨機(jī)分成 3個(gè)處理組，分別為 C組 （對(duì)照組，養(yǎng)于曝氣后自來水中并飼喂基礎(chǔ)飼糧）；T1組（氨氮組，養(yǎng)于氨氮濃度為18.37 mg/L的水中并飼喂基礎(chǔ)飼糧）和T2組（α-KG組，養(yǎng)于氨氮濃度為18.37 mg/L的水中并飼喂0.75%α-KG飼糧），每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)桶，每個(gè)重復(fù)桶放養(yǎng)30尾魚。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平

1.3 飼養(yǎng)管理 草魚氨氮安全濃度為3.06 mg/L（梁健，2014a），T1和T2處理所設(shè)氨氮濃度為安全濃度的6倍，即18.36 mg/L，通過10 g/L的氯化銨母液調(diào)制。養(yǎng)殖試驗(yàn)在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水族基地進(jìn)行，所有試驗(yàn)用魚提前適應(yīng)試驗(yàn)環(huán)境和飼料。正式試驗(yàn)期間，每天上午9：00和下午17：00投喂飼糧，進(jìn)食完成后吸出殘餌和糞便，然后換水（約1/3體積），添加氯化銨母液、氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液以維持試驗(yàn)所需要的氨氮濃度和pH。每天定期監(jiān)測水體氨氮濃度、溫度和pH，養(yǎng)殖桶24 h連續(xù)充氧。試驗(yàn)期間各組的氨氮含量實(shí)測值分別為：C 組 （1.51±0.083）、T1組（18.71±0.617） 和T2組 （18.26±0.398）， 水溫為（27.25 ± 2.51）℃，pH 為（6.55 ± 0.29）。

1.4 樣品采集 采樣時(shí)間分別為第1、7、42天。每次采樣時(shí)，每桶隨機(jī)選取體重接近的4尾魚，經(jīng)MS222麻醉后用2.5 mL無菌注射器尾靜脈采血，用1 g/L的肝素鈉溶液抗凝，3500 g、4℃離心10 min，取上層血漿于-40℃保存?zhèn)溆?。將草魚置于冰上，用滅菌的解剖工具取腎和中腸，分別用滅菌的錫箔紙包好后放液氮中速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 血氨的測定 血氨的測定采用高效液相色譜-四級(jí)桿離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行，由北京質(zhì)譜醫(yī)學(xué)研究有限公司完成，血氨含量以μmol/L表示。

1.6 基因表達(dá)分析

1.6.1 引物設(shè)計(jì)及合成 參照陳亮 （2011）的方法，以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）mRNA序列作為內(nèi)參基 因 ， 根 據(jù) NCBI 中 草 魚 Rhag、Rhcg1、Rhcg2、HSP70和PPARγ基因序列登錄號(hào) （分別為KJ141203、KJ141202、KJ141205、GU475146 和GU997136）設(shè)計(jì)引物（表2）。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.6.2 總RNA的提取及cDNA合成 采用TaKaRaMiniBEST Universal RNA Extraction（TaKaRa，China）提取總 RNA，所有過程均在無菌操作臺(tái)上嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行。使用核酸蛋白質(zhì)儀檢測總RNA的質(zhì)量和濃度，使用1%的瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性，完整性好且A260/A280值為1.8～2.0的總RNA用于cDNA合成。cDNA合成按照TaKaRaPrimeScriptTM RT reagent Kit With gDNA Eraser（TaKaRa，China）操作說明書進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用SYBR GreenⅠ染料法，按照SYBR Premix EX TaqTMⅡ （TaKaRa，China） 操作說明書在CFX96熒光定量PCR儀（Bio-Rad，USA）進(jìn)行定量分析。反應(yīng)體系為：10 μL SYBR Premix EX TaqⅡ，2 μL稀釋后的cDNA模板，上、下游引物（10μmol/L）各0.8μL，ddH2O 6.4μL，反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 30 s；95 ℃5s，60℃40 s，35個(gè)循環(huán)；熔解曲線程序?yàn)閺?5℃升溫到95℃，每5 s增加0.5℃。數(shù)據(jù)收集使用CFX manager software 3.1（Bio-Rad，USA）。

1.6.4 擴(kuò)增效率的檢測 將多個(gè)樣品的cDNA各取1μL混勻后，進(jìn)行10倍系列稀釋，選取6個(gè)梯度進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)，根據(jù)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果，β-actin、Rhag、Rhcg1、Rhcg2、HSP70 和 PPARγ 的擴(kuò)增效率分別為 96%、100.4%、98.3%、99.7%、103%、101%，符合實(shí)時(shí)熒光定量PCR中雙Ct法對(duì)擴(kuò)增效率的要求（唐永凱等，2008）。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 用公式 2-（ΔΔCt）（唐永凱等，2008）計(jì)算各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan氏多重比較，試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，差異顯著水平為P＜0.05。

表2 所用引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 α-KG對(duì)氨氮脅迫下草魚血氨含量的影響由圖1可知，1 d時(shí)，氨氮脅迫及飼糧α-KG的添加均可顯著影響草魚血氨含量（P＜0.05）。其中，T1組血氨含量較對(duì)照組顯著升高（P＜0.05），而T2組血氨含量顯著降低（P＜0.05）。7、42 d時(shí)，三組間血氨含量均無顯著差異。

2.2 α-KG對(duì)氨氮脅迫下草魚腎Rh糖蛋白mRNA表達(dá)量的影響 由表3可知，腎RhagmRNA表達(dá)量在氨氮脅迫后第1天和42天三組間存在顯著差異。第1天時(shí)，氨氮脅迫下草魚腎RhagmRNA的表達(dá)顯著上調(diào) （P＜0.05），而T2組腎RhagmRNA表達(dá)量與C和T1組相比均無顯著差異。第42天時(shí)，與對(duì)照組相比，氨氮脅迫顯著上調(diào)草魚腎中Rhag mRNA的表達(dá)，而α-KG的添加使T2組草魚腎中Rhag mRNA表達(dá)量較T1組顯著增加。此外，氨氮脅迫后7 d，T1組與對(duì)照組腎Rhcg1 mRNA表達(dá)量無顯著差異，α-KG的添加顯著下調(diào)腎Rhcg1 mRNA表達(dá)（P＜0.05）。第42天時(shí)，氨氮脅迫使腎Rhcg1 mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)，而α-KG的添加對(duì)氨氮脅迫下腎Rhcg1 mRNA表達(dá)量無顯著影響。三組間腎Rhcg2 mRNA表達(dá)量在氨氮脅迫第1、7和42天均無顯著差異。

圖1 α-KG對(duì)氨氮脅迫下草魚血氨含量的影響

2.3 α-KG對(duì)氨氮脅迫下草魚腎HSP70和PPARγ mRNA表達(dá)量的影響 由表4可知，草魚腎中PPARγmRNA表達(dá)量在第1、7和42天三組間均無顯著差異，HSP70 mRNA表達(dá)量在第1和7天時(shí)三組間存在顯著差異（P＜0.05）。第1天時(shí)，與對(duì)照組相比，氨氮脅迫草魚腎中HSP70 mRNA表達(dá)量無顯著影響，而α-KG的添加使T2組草魚腎中HSP70 mRNA表達(dá)較T1組顯著上調(diào)（P＜0.05）。第7天時(shí)，T1組草魚腎中HSP70 mRNA表達(dá)量較對(duì)照組顯著下降（P＜0.05），T2組草魚腎中HSP70 mRNA表達(dá)較T1組無顯著差異。

3 討論

3.1 α-KG對(duì)氨氮脅迫下草魚腎Rh糖蛋白mRNA表達(dá)量的影響 大量研究表明，Rh糖蛋白能作為水生動(dòng)物的氨轉(zhuǎn)運(yùn)載體，介導(dǎo)和促進(jìn)NH3的轉(zhuǎn)運(yùn)及排泄（Braun 等，2009；Weihrauch 等，2009；Nakada等，2007），對(duì)水生動(dòng)物的氨轉(zhuǎn)運(yùn)起著重要作用。本試驗(yàn)中，氨氮脅迫后1d，T1組草魚腎RhagmRNA表達(dá)量顯著提高，而α-KG的添加能夠緩解RhagmRNA表達(dá)量顯著提高。這可能說明氨氮脅迫后1d，草魚血氨含量顯著升高，機(jī)體通過提高RhagmRNA表達(dá)量的途徑來增加體內(nèi)氨的轉(zhuǎn)運(yùn)，有利于魚體應(yīng)對(duì)氨氮脅迫。而α-KG的添加使T2組血氨含量較T1組顯著降低，機(jī)體內(nèi)氨氮毒性減小，從而草魚腎中Rhag mRNA表達(dá)量降低，這與梁健等（2014b）的結(jié)論一致。氨氮脅迫7 d后，T1組Rhcg1 mRNA表達(dá)量與對(duì)照組無顯著差異，但T2組Rhcg1 mRNA的表達(dá)量較T1組顯著降低。這可能是因?yàn)榘钡{迫7 d后，草魚體內(nèi)血氨含量下降，體內(nèi)氨氮毒性降低，因而T1組Rhcg1mRNA的表達(dá)量與對(duì)照組無差異，魚體對(duì)氨的轉(zhuǎn)運(yùn)有所降低。而T2組Rhcg1mRNA表達(dá)量的顯著降低，這可能是腎臟是動(dòng)物體代謝產(chǎn)生氨的器官（郭琿，2008），而α-KG的添加能降低腎臟內(nèi)氨的產(chǎn)生，以應(yīng)對(duì)氨氮毒性，因而Rhcg1對(duì)內(nèi)源性氨的轉(zhuǎn)運(yùn)降低。在長期氨氮脅迫的相關(guān)研究中，許多研究均表明長期氨氮脅迫會(huì)對(duì)水生生物的生長、氨基酸代謝、鰓組織的形態(tài)以及免疫應(yīng)答等 （黎慶等，2015；Schram等，2010；Pinto 等，2007；Foss等，2004） 造成負(fù)面影響。本試驗(yàn)中，氨氮脅迫42d后，T1組和T2組Rhag和Rhcg1 mRNA的表達(dá)量均顯著升高。這可能表明草魚在長期氨氮毒性的影響下，機(jī)體需要提高氨的轉(zhuǎn)運(yùn)，以應(yīng)對(duì)可能造成的負(fù)面影響。

3.2 α-KG對(duì)氨氮脅迫下草魚腎HSP70和PPARγmRNA表達(dá)量的影響 HSP70作為HSP家族中最主要的一類，在保護(hù)細(xì)胞免受損傷、增強(qiáng)機(jī)體對(duì)應(yīng)激原的耐受性、促進(jìn)機(jī)體免疫反應(yīng)等（Srivastava等，2002；Jacquiersarlin 等，1994；Welch 等，1991）多個(gè)方面具有重要作用。Nakano等（2002）研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)潮間帶杜父魚體內(nèi)HSP70含量及mRNA表達(dá)量較高時(shí)，機(jī)體的抗應(yīng)激能力更強(qiáng)。本試驗(yàn)中，氨氮脅迫1 d后，T1組草魚腎中HSP70 mRNA表達(dá)量無顯著變化，而α-KG能夠顯著上調(diào)HSP70 mRNA的表達(dá)。這可能說明草魚對(duì)氨氮脅迫的調(diào)節(jié)能力有限，而外源α-KG能夠通過上調(diào)草魚氨氮脅迫下HSP70 mRNA的表達(dá)，提高應(yīng)激耐受力和免疫力，從而保護(hù)魚體。氨氮脅迫7 d后，T1組和T2組HSP70 mRNA表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低。這可能是因?yàn)榘钡{迫7 d后，草魚已經(jīng)出現(xiàn)一定程度的適應(yīng)，從而HSP70 mRNA的表達(dá)下調(diào)。氨氮脅迫42 d后，T1組和T2組HSP70 mRNA的表達(dá)量與對(duì)照組相比無顯著差異，這可能是魚體應(yīng)對(duì)長期氨氮毒性的一種適應(yīng)性調(diào)節(jié)。

表3 飼料中添加α-KG對(duì)氨氮脅迫下草魚腎Rh糖蛋白mRNA表達(dá)量的影響

表4 飼料中添加α-KG對(duì)氨氮脅迫下草魚腎HSP70和PPARγmRNA表達(dá)量的影響

4 結(jié)論

氨氮脅迫下，飼糧α-KG的添加能夠有效緩解草魚前期血氨含量的升高，并調(diào)節(jié)氨氮脅迫下Rhag、Rhcg1和HSP70的mRNA表達(dá)量，有利于草魚應(yīng)對(duì)慢性氨氮脅迫。