甘 雨，馬 進(jìn)，袁 媛，喬 敏，包玉龍，王 菲

遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧 沈陽 110034

近年來，缺血性腦血管疾病發(fā)生率、致殘率和死亡率逐年攀升，探究其發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療藥物具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，而制備理想、穩(wěn)定的動(dòng)物模型是研究該類疾病的重要途徑。目前，制備局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷姆椒ㄓ卸喾N，包括開顱機(jī)械閉塞法、微栓子栓塞法、氣囊栓塞法、光化學(xué)誘導(dǎo)血栓形成法、線栓法等［1］。其中線栓法因具有不開顱、創(chuàng)傷小、梗塞部位明確、缺血及再灌注時(shí)間可控等優(yōu)點(diǎn)［2］，而成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛應(yīng)用的良好載體，現(xiàn)將線栓法模型效果及制作經(jīng)驗(yàn)報(bào)告如下：

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量260～280 g，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001。飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(遼)2012-0003，溫度 20～23℃，相對(duì)濕度 50%～60%。

1.2主要試劑與儀器水合氯醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20150508)；2，3，5- 氯化三苯基四氮唑(TTC，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20150310)；4%多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20151214)；栓線(北京西濃科技有限公司，產(chǎn)品貨號(hào)：2838-4A)；JKDP-2型電熱培養(yǎng)恒溫箱(廈門醫(yī)療電子儀器廠)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組 將SD大鼠44只隨機(jī)分為假手術(shù)組18只和模型組26只。

1.3.2 模型制備 參照Longa等［3］及文獻(xiàn)［4］方法，采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。3%水合氯醛［300 mg/kg(體質(zhì)量)]腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠仰臥位固定于操作臺(tái)上，頸前區(qū)消毒，采用頸部正中縱行切口，鈍性分離肌肉及筋膜，充分暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)，仔細(xì)分離迷走神經(jīng)。再依次剝離頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)。結(jié)扎ECA，夾閉ICA，再結(jié)扎CCA，于CCA分叉部下方約10 mm處剪一小口，插入線栓，松開夾閉ICA的微動(dòng)脈夾，將線栓緩慢送入ICA，直至遇有輕微阻力為止，此時(shí)線栓插入深度(18.0±0.5)mm。外留線栓涂黑(便于再灌注時(shí)拔線)，縫合切口。2小時(shí)后行再灌注，即將線栓抽至CCA內(nèi)，大腦中動(dòng)脈恢復(fù)血供。假手術(shù)組不插入線栓，頸部手術(shù)及血管處理同模型組。

1.4評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.4.1 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 分別于術(shù)后2小時(shí)及3、7、14天觀察大鼠行為和神經(jīng)功能狀況，并參照文獻(xiàn)［5］方法對(duì)大鼠神經(jīng)功能障礙進(jìn)行評(píng)分。0分：活動(dòng)正常，無神經(jīng)功能缺陷；1分：提尾懸空時(shí)，左側(cè)前肢內(nèi)收，不能完全伸展；2分：爬行時(shí)身體向左側(cè)旋轉(zhuǎn)(追尾征)；3分：爬行時(shí)身體向左側(cè)傾倒；4分：無法自發(fā)行走并伴有意識(shí)水平下降。模型組評(píng)分1～3分者納入研究，同時(shí)排除蛛網(wǎng)膜下腔出血和未到觀察時(shí)間點(diǎn)死亡大鼠。

1.4.2 腦梗死面積比測(cè)定 分別于術(shù)后3、7、14天2組各取3只大鼠，麻醉后斷頭取腦，腦組織置于-20℃冰箱中冷凍20分鐘，去除嗅球、小腦和低位腦干。自額極每間隔2 mm連續(xù)做5個(gè)腦組織冠狀切片，分別為 A、B、C、D、E 片，迅速置于2%TTC溶液中，37℃恒溫避光孵育30分鐘，期間每5分鐘翻動(dòng)1次。染色后拍照，置4%多聚甲醛溶液中固定。以最大缺血斷面C片計(jì)算腦梗死面積百分比，用Image J 1.47圖像分析軟件計(jì)算C片梗死區(qū)面積和非梗死區(qū)面積，為避免右側(cè)大腦因缺血性水腫帶來的誤差，采用Swanson法計(jì)算梗死面積百分比。腦梗死面積百分比=(S1-Sr)/2S1×100%(S1：C片健側(cè)總面積；Sr：C片患側(cè)非梗死區(qū)面積)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以(±s)表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分與死亡率假手術(shù)組大鼠全部存活。模型組大鼠術(shù)中死亡3只，術(shù)后1～3天死亡3只，術(shù)后4～7天死亡2只，總死亡率為29.6%(8只死亡動(dòng)物未列入神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的統(tǒng)計(jì)分析)。假手術(shù)組大鼠死亡率低于模型組(χ2=4.86，P＜0.05)。假手術(shù)組大鼠各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分均為0分。模型組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表1。

表1 2組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較(±s) 分

表1 2組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較(±s) 分

組別 只數(shù) 術(shù)后2小時(shí) 術(shù)后3天 術(shù)后7天 術(shù)后14天假手術(shù)組 18 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型組 18 1.94±0.80 1.61±0.78 1.50±0.67 1.33±0.52 t 10.29 8.76 7.76 6.27 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 TTC染色觀察與腦梗死面積比測(cè)定經(jīng)TTC染色后，假手術(shù)組大鼠腦組織左右半球均紅染，未見明顯梗死灶(圖1-A)；模型組大鼠右側(cè)大腦半球有局限的缺血梗死灶(蒼白區(qū)域)，主要分布在額葉、頂葉、部分顳葉皮層。模型組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)腦梗死面積百分比與假手術(shù)組同期比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表2、圖1。

表2 2組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)腦梗死面積百分比(±s) %

表2 2組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)腦梗死面積百分比(±s) %

組別 只數(shù) 術(shù)后3天 術(shù)后7天 術(shù)后14天假手術(shù)組 18 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型組 18 32.61±0.76 29.50±4.03 13.32±3.24 t 74.32 12.68 7.12 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

圖1 2組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)腦梗死面積(TTC染色)

3 討論

自上世紀(jì)八十年代，Koizumi J等［6］首創(chuàng)不開顱經(jīng)CCA插入線栓制備大腦中動(dòng)脈閉塞缺血模型以來，經(jīng)30余載不斷改進(jìn)，目前已成為實(shí)驗(yàn)性腦缺血研究最常用的造模方法。但該法仍不盡完善，如：制備過程復(fù)雜，手術(shù)難度大；動(dòng)物品系及體質(zhì)量要求嚴(yán)格；穩(wěn)定性欠佳，易受栓線種類、規(guī)格、頭端處理等諸多因素影響，想制備穩(wěn)定性好、可靠性高的模型尚存在一定困難［7］。本研究選用SD大鼠，采用經(jīng)頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)端插線的方法制備大鼠腦缺血再灌注模型。結(jié)果顯示用此法制備腦缺血再灌注模型具有缺血部位恒定、可靠性高等特點(diǎn)。

3.1 線栓的選擇線栓是決定模型制備成功與否的關(guān)鍵，線栓的直徑、硬度、弧度及頭端處理是重要影響因素［8］。本研究選用北京西濃科技有限公司生產(chǎn)的2838-4A型線栓，該線栓為單絲尼龍線，頭端燒熔為半球形，前端包被多聚賴氨酸，直徑(0.38±0.02)mm，由于其直徑均一，弧度及硬度適中，大大提高了模型制備的成功率和腦缺血范圍的穩(wěn)定性，同時(shí)也節(jié)約了線栓制作及精選的時(shí)間，為快速、優(yōu)質(zhì)完成研究提供了保障。

3.2 大鼠的選擇大鼠的品系和體質(zhì)量是影響模型成功與否的重要指標(biāo)［9］。SD大鼠腦血管解剖特點(diǎn)與人類相似，生理機(jī)能變異較小，梗死灶恒定，重復(fù)性好。大鼠體質(zhì)量偏小(250 g以下)，頸動(dòng)脈較細(xì)，插線困難，且易損傷血管；體質(zhì)量偏大(300 g以上)，顱內(nèi)動(dòng)脈較粗，不能完全阻塞大腦中動(dòng)脈［10］。因此，體質(zhì)量260～280 g的SD大鼠血管變異小，生命耐受力強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)易于控制。

3.3插線的技巧ECA和ICA要充分暴露，結(jié)扎ECA盡量靠近分叉處，而夾閉ICA盡量靠近遠(yuǎn)端，當(dāng)打開微血管夾時(shí)，在ICA的栓線足夠長(zhǎng)可避免血流將栓線從血管內(nèi)沖出。插線時(shí)鼠頭部歪向左側(cè)，使栓線的弧面朝向內(nèi)上方，大概與水平面呈45°，有利于進(jìn)線。

3.4插線的深度在術(shù)前準(zhǔn)備時(shí)用細(xì)標(biāo)記筆在18 mm處作標(biāo)記，進(jìn)線時(shí)遇到阻力，倘若已達(dá)到18 mm，立即停止進(jìn)線，以免造成蛛網(wǎng)膜下腔出血；倘若不足18 mm，應(yīng)緩慢退出2～3 mm，調(diào)整栓線的角度再進(jìn)線。

3.5線栓外留殘端處置殘端最好涂上黑色，拔線時(shí)更容易分辨，殘端要盡量保留長(zhǎng)一些，因?yàn)榇笫笄逍驯汩_始活動(dòng)，易使殘端縮進(jìn)肌肉內(nèi)。另外拔出線栓動(dòng)作要輕柔，防止拉斷血管而無法再灌注或全部拔出造成大出血。

總之，要建立理想、穩(wěn)定和可靠的標(biāo)準(zhǔn)化腦缺血再灌注模型，必須注重細(xì)節(jié)，不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)。本研究對(duì)Longa法制作的大鼠局灶性腦缺血模型作了一些改進(jìn)，并通過神經(jīng)行為學(xué)、TTC染色觀察進(jìn)行驗(yàn)證，獲得了滿意的效果，可為研究缺血性腦血管疾病的發(fā)病過程及治療藥物評(píng)價(jià)提供保障。