段洪超，王慶超，張 杰黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150009

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種關(guān)節(jié)軟骨退行性骨關(guān)節(jié)疾病，被稱為老年性關(guān)節(jié)炎、增生性關(guān)節(jié)炎、退行性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)病、肥大性關(guān)節(jié)炎等，是中老年人常見的進(jìn)展性骨關(guān)節(jié)疾病。臨床表現(xiàn)為功能障礙、疼痛。重癥患者表現(xiàn)為關(guān)節(jié)殘廢，比如髖、膝及脊柱等的殘廢［1］。在我國OA的致殘率為51%［2-3］，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。有文獻(xiàn)報(bào)道［4-5］丹參注射液能有效降低實(shí)驗(yàn)性兔模型關(guān)節(jié)液中白細(xì)胞介素1及腫瘤壞死因子的水平，且兔膝軟骨細(xì)胞破壞程度明顯低于造模組，表明丹參關(guān)節(jié)內(nèi)注射能有效治療OA?？虑嗟龋?］發(fā)現(xiàn)丹參注射液在治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎方面取得和透明質(zhì)酸鈉類似的療效，而且還可大幅度提高患者的生活質(zhì)量。本研究從分子生物學(xué)角度探討丹參注射液促進(jìn)OA軟骨細(xì)胞修復(fù)的機(jī)制，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康4周齡雄性新西蘭大白兔24 只，體質(zhì)量(1.2±0.1)kg，平均 1.2 kg，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)GLP中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(黑)2013-004，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(黑)2013-012。

1.2藥物丹參注射液(正大青春寶制藥，批號(hào)：1704133，規(guī)格：10 mL/ 支)；DMEM 培養(yǎng)基(武漢普諾賽Procell生命科技有限公司)；胎牛血清(Amresco公司)；Ⅱ型膠原酶(Invitrogen公司)；胰蛋白酶(上海書吉生物科技有限公司)；甲苯胺藍(lán)(上海紫一試劑廠)；MTT(四甲基偶氮噻唑藍(lán)，北京華越洋生物科技有限公司)；cDNA第一鏈合成試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)；丙烯酰胺(鄭州鴻祥化工有限公司)；甲叉雙丙烯酰胺(大連美侖生物科技有限公司)；引物合成(武漢金開瑞生物工程有限公司)；磷酸酶抑制劑(上海朝瑞生物科技有限公司)；RIPA裂解液(上海威奧生物科技有限公司)；兔抗GAPDH 37KD(北京中杉生物科技有限公司)；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗，兔抗p-erk 42、44KD，兔抗p-p38 43KD(均購自上?？婆d生化試劑有限公司)。

1.3儀器5424小型高速離心機(jī)(Eppendorf中國有限公司)；utrao-SM 800全自動(dòng)酶標(biāo)儀(上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司)；SLAN-96P型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(上海宏石醫(yī)療科技有限公司)；MPK5000電轉(zhuǎn)儀(上海智巖科學(xué)儀器有限公司)；My Cycler型PCR儀(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)；ZF-6型紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)；Bio Spectrometer分光光度計(jì)(艾本德中國有限公司)；HE-120型水平電泳儀(上海實(shí)生細(xì)胞生物技術(shù)有限公司)；DHG-9030A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海之信儀器有限公司)；CQT-191IR型CO2恒溫培養(yǎng)箱(蘇州珀西瓦爾實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；PC500型流式細(xì)胞儀(貝克曼庫爾特公司)；ZD-9556型水平搖床(金壇盛藍(lán)儀器制造有限公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 兔軟骨細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

1.4.1.1 兔軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 1)將空氣栓塞注入兔耳緣靜脈，處死后消毒。2)無菌條件下切取股骨髁和脛骨平臺(tái)關(guān)節(jié)軟骨，PBS緩沖液漂洗3次，剪成1 mm大小，PBS重復(fù)漂洗，剪碎的軟骨放置于離心管內(nèi)，加PBS緩沖液，靜止后棄上清液，加2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%胰蛋白酶,37℃條件下消化30分鐘。加入2 mL DMEM培養(yǎng)基Ⅰ，3 000 r/min離心3分鐘，棄去上清液，加入4 mL混合消化液，37℃消化至第2天。加入等量DMEM培養(yǎng)基Ⅰ，吹打均勻。3 000 r/min離心5分鐘，加入DMEM培養(yǎng)基Ⅱ重懸細(xì)胞沉淀，接種到無菌培養(yǎng)皿中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48小時(shí)后根據(jù)細(xì)胞貼壁情況，每3天更換培養(yǎng)液1次。使用倒置顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞生長情況，等細(xì)胞匯合成片，分布在大部分培養(yǎng)皿，細(xì)胞密度大約80%左右，棄培養(yǎng)液，PBS漂洗1次，加1～2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞。顯微鏡下，消化1～2分鐘，觀察可見細(xì)胞相互分離變圓，消化完成后，棄胰酶溶液，加培養(yǎng)基，制成單細(xì)胞懸液，按1∶3的比例傳代，飽和濕度條件下擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.4.1.2 細(xì)胞的鑒定 通過甲苯胺藍(lán)染色法鑒定軟骨細(xì)胞。將已分布細(xì)胞的玻片用PBS溶液漂洗3次，3 min/次；用4%的多聚甲醛固定玻片15分鐘，用PBS溶液漂洗3次，3 min/次；入水浴鍋預(yù)熱60℃，使用甲苯胺藍(lán)染液染色30分鐘，雙蒸水洗3次；95%乙醇分化，脫色，顯微鏡下背景清楚即可；100%酒精脫水，二甲苯透明，置于通風(fēng)櫥條件下，干燥后中性樹膠封片；鏡下觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)。1.4.2 MTT法檢測(cè)2～5代細(xì)胞增殖曲線 取良好生長的第2～5代軟骨細(xì)胞，接種于96孔板中，取濃度為10%胎牛血清(FBS)的DMEM溶液培養(yǎng)24小時(shí)；通過無FBS的DMEM溶液培養(yǎng)24小時(shí)消化軟骨細(xì)胞，加濃度為10%FBS的DMEM溶液培養(yǎng)，每代細(xì)胞設(shè)定為6孔，分別于第1～10天；棄去培養(yǎng)溶液，使用PBS溶液10 μL漂洗1次，每孔加入濃度為0.5%MTT溶液20 μL，37℃孵育4小時(shí)，棄去MTT溶液，使用PBS溶液10 μL漂洗1次，加入體積為200 μL的二甲基亞砜(DMSO)溶液，37℃振蕩10分鐘；設(shè)定酶標(biāo)儀波長570 nm，檢測(cè)OD值，記錄數(shù)據(jù)，繪制第2～5代細(xì)胞的生長曲線。

1.4.3 建立細(xì)胞活性的時(shí)效及量效關(guān)系

1.4.3.1 梯度時(shí)間法優(yōu)化丹參注射液干預(yù)軟骨細(xì)胞活性的時(shí)效關(guān)系 取良好生長的第3代軟骨細(xì)胞，接種于96孔板中，取濃度為10%FBS的DMEM溶液培養(yǎng)24小時(shí)；加入含丹參注射液終濃度為0、50 μg/L含10%FBS的DMEM溶液中培養(yǎng)，每組細(xì)胞設(shè)定為6孔，培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)。棄去培養(yǎng)基，使用PBS溶液10 μL漂洗1次，每孔加入濃度為0.5%MTT溶液20 μL，37℃孵育4小時(shí)，棄去MTT溶液，使用PBS溶液10 μL漂洗 1 次，加入體積為 200 μL的 DMSO溶液，37℃振蕩10分鐘，使結(jié)晶溶解。設(shè)定酶標(biāo)儀波長570 nm，檢測(cè)OD值，記錄數(shù)據(jù)，找到丹參注射液對(duì)軟骨細(xì)胞活性的時(shí)效關(guān)系。

1.4.3.2 梯度濃度法優(yōu)化丹參注射液干預(yù)軟骨細(xì)胞活性的量效關(guān)系 取良好生長的第3代軟骨細(xì)胞，接種于96孔板中，取濃度為10%FBS的DMEM溶液培養(yǎng)24小時(shí)；加入含丹參注射液終濃度為0、25、50、100、200、400 μg/L含 10%FBS 的 DMEM 溶液中培養(yǎng)，每組細(xì)胞設(shè)定為6孔，培養(yǎng)72小時(shí)。棄去培養(yǎng)基，使用PBS溶液10 μL漂洗1次，每孔加入濃度為0.5%MTT溶液20 μL，37℃孵育4小時(shí)，棄去MTT溶液，使用PBS溶液10 μL漂洗1次，加入體積為200 μL的DMSO溶液，37℃振蕩10分鐘，使結(jié)晶溶解。設(shè)定酶標(biāo)儀波長570 nm，檢測(cè)OD值，記錄數(shù)據(jù)，找到丹參注射液對(duì)軟骨細(xì)胞活性的量效關(guān)系。

1.4.4 RT-PCR法檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞Bcl-2、Bax的表達(dá)

1.4.4.1 T-RNA的提取 第3代軟骨細(xì)胞→加1mL Trizol溶液反復(fù)吹打→轉(zhuǎn)入1.5 mLEP管中→顛倒混勻5次，放置5分鐘→加三氯甲烷200 μL，顛倒混勻10次，放置15分鐘→4℃條件下，12 000 r/min離心15分鐘，管內(nèi)分4層→轉(zhuǎn)上層水相(約500 μL)于1.5 mL EP管中→加入等體積異丙醇(約500 μL)，顛倒混勻10次，放置10分鐘→4℃條件下，12 000 r/min離心10分鐘，棄上清液，可見貼壁薄層及白色的RNA→加75%乙醇1 mL→4℃條件下，7 500 r/min離心5分鐘，棄上清液，干燥10分鐘→加20 μL純凈水溶解RNA→核酸蛋白檢測(cè)儀驗(yàn)證抽取是否成功→逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.4.4.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及條件見表1—2。

表1 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

表2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件

1.4.4.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 查詢新西蘭兔相關(guān)基因序列，輸入引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)上、下游引物序列，將其進(jìn)行對(duì)比，上、下游引物匹配率均為100%。

1.4.4.4 PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)體系及條件見表3—4。

表3 PCR反應(yīng)體系

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，同組干預(yù)前后采用配對(duì)t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1第2～5代細(xì)胞的增殖曲線第1天各代細(xì)胞OD值沒有顯著差異(P＞0.05)，第2天增殖緩慢，第3天逐漸加快增殖，第4天進(jìn)入生長期，第5、6天增殖變慢，第7、8天增殖進(jìn)入平臺(tái)期，第9、10天增殖抑制。OD值隨細(xì)胞傳代呈減低趨勢(shì)，第2、3 代高于第 4、5 代，但沒有顯著差異(P＞0.05)，見圖1。

圖1 各組軟骨細(xì)胞增殖曲線

2.2優(yōu)化丹參注射液干預(yù)細(xì)胞活性的時(shí)效關(guān)系2組干預(yù)24小時(shí)OD值沒有顯著差異(P＞0.05)，干預(yù)48小時(shí)OD值中劑量組大于對(duì)照組(P＜0.05)，干預(yù)72、96小時(shí)OD值中劑量組明顯大于對(duì)照組(P＜0.01)，中劑量組干預(yù)72小時(shí)OD值顯著大于24、48、96小時(shí)(P＜0.05)，故選擇細(xì)胞干預(yù)72小時(shí)作為以后實(shí)驗(yàn)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，見表5。

表5 梯度時(shí)間法優(yōu)化丹參注射液干預(yù)軟骨細(xì)胞活性的時(shí)效關(guān)系(±s)

表5 梯度時(shí)間法優(yōu)化丹參注射液干預(yù)軟骨細(xì)胞活性的時(shí)效關(guān)系(±s)

注：與對(duì)照組相比，＊表示P＜0.01，□表示P＜0.05；與同組干預(yù)前比較，△表示P＜0.05，#表示P＜0.01

組別 干預(yù)前 干預(yù)后24 h 干預(yù)后48 h 干預(yù)后72 h 干預(yù)后96 h對(duì)照組 0.19±0.03 0.27±0.02△ 0.38±0.03△ 0.51±0.04# 0.48±0.03#中劑量組 0.20±0.02 0.29±0.02△ 0.39±0.02□△ 0.57±0.02＊# 0.51±0.03＊#

2.3優(yōu)化丹參注射液干預(yù)細(xì)胞活性的量效關(guān)系第3代軟骨細(xì)胞用不同丹參注射液終濃度的10%FBS DMEM溶液干預(yù)，干預(yù)前細(xì)胞OD值沒有明顯差異(P＞0.05)；干預(yù) 72 小時(shí)候后，400、200、100、50、25 μg/L濃度細(xì)胞的OD值顯著大于0 μg/L濃度OD 值(P＜0.01)；50 μg/L濃度細(xì)胞 OD 值顯著大于400、200、100、25 μg/L 濃度OD 值(P＜0.01)；100 μg/L濃度的細(xì)胞 OD值顯著大于 400、200、25μg/L濃度OD 值(P＜0.01)；100 μg/L濃度細(xì)胞OD值與50μg/L濃度細(xì)胞OD值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表6。

表6 梯度時(shí)間法優(yōu)化丹參注射液干預(yù)軟骨細(xì)胞活性的量效關(guān)系(±s)

表6 梯度時(shí)間法優(yōu)化丹參注射液干預(yù)軟骨細(xì)胞活性的量效關(guān)系(±s)

濃度/(μg·L-1) 干預(yù)前 干預(yù)后0 0.19±0.02 0.47±0.03 25 0.20±0.03 0.49±0.03 50 0.18±0.02 0.56±0.03 100 0.20±0.02 0.57±0.02 200 0.19±0.03 0.53±0.02 400 0.21±0.02 0.50±0.03

2.4RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞Bcl-2、Bax的表達(dá)誘導(dǎo)凋亡的第3代軟骨細(xì)胞，加丹參注射液干預(yù)24小時(shí)后細(xì)胞Bax表達(dá)中、高劑量組小于模型組(P＜0.05)，高劑量組小于低劑量組(P＜0.05)；細(xì)胞Bcl-2表達(dá)中、高劑量組大于模型組(P＜0.05)，高劑量組大于低劑量組(P＜0.05)，見表7。

表7 丹參注射液干預(yù)后細(xì)胞Bcl-2、Bax的表達(dá)(±s)

表7 丹參注射液干預(yù)后細(xì)胞Bcl-2、Bax的表達(dá)(±s)

注：與模型組比較，■表示P＜0.01，□表示P＜0.05；與低劑量組比較，▲表示P＜0.01，△表示P＜0.05

組別 Bcl-2 Bax正常組 2.697±0.532△■▄ 1.135±0.793▲模型組 0.908±0.259 6.674±1.257低劑量組 1.723±0.451 6.108±1.982中劑量組 2.239±0.564□ 4.170±2.134□高劑量組 3.134±0.702□■ 2.458±0.675□■

3 討論

OA是一種關(guān)節(jié)軟骨降解進(jìn)展性疾病，其主要病理變化由軟骨細(xì)胞分解、合成活動(dòng)失衡導(dǎo)致。軟骨細(xì)胞屬于終末分化細(xì)胞，其在體外的傳代培養(yǎng)過程中出現(xiàn)增殖停滯，表型喪失，呈老化狀態(tài)，這種老化屬于復(fù)制性老化。細(xì)胞老化是細(xì)胞周期調(diào)控下多基因參與的復(fù)雜的生理病理過程，具有一定可控性。細(xì)胞周期調(diào)控因子相互作用導(dǎo)致細(xì)胞老化［7-8］。有研究［9］證明關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡與細(xì)胞周期調(diào)控因子Bcl-2等活性密切相關(guān)，軟骨細(xì)胞凋亡過盛可能使關(guān)節(jié)軟骨退變發(fā)展成骨關(guān)節(jié)炎。

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨性關(guān)節(jié)炎屬“骨痹”范疇。中醫(yī)對(duì)其認(rèn)識(shí)和治療有悠久的歷史。《素問·痹論篇》曰：風(fēng)寒濕三氣雜至,合而為痹也。歷代醫(yī)家又從實(shí)踐中不斷加以發(fā)展。王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》一書提出“痹由瘀血致病”說，書中列有身痛逐瘀湯等方劑,治療別具一格。丹參味苦性微寒，歸心、肝經(jīng)，功能活血通絡(luò)，《日華子本草》曰：“通利關(guān)脈，治……骨節(jié)疼痛，四肢不遂?！薄侗静菡x》言：“專入血分,其功在活血行血，內(nèi)之達(dá)臟腑而化瘀滯，故積聚消而瘕破，外之利關(guān)節(jié)而通經(jīng)絡(luò)，則腰健而痹著行?！爆F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究［10］發(fā)現(xiàn)其有效成分丹參酮對(duì)炎癥有良好的治療作用，且可抗氧化，改善微循環(huán)；丹參注射液關(guān)節(jié)內(nèi)注射可有效減輕關(guān)節(jié)軟骨損傷及退行性改變［11］；還可保護(hù)軟骨細(xì)胞，防止關(guān)節(jié)軟骨退變［12］。

本研究結(jié)果表明丹參注射液可修復(fù)退變軟骨，防治骨性關(guān)節(jié)炎，該作用與減少軟骨細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，機(jī)制可能是：上調(diào)抗凋亡調(diào)控因子Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)促凋亡調(diào)控因子bax的表達(dá)，從而減少軟骨細(xì)胞凋亡，丹參注射液的調(diào)控效果與其濃度有一定關(guān)系。今后應(yīng)設(shè)計(jì)大樣本、雙盲、隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)方法，深層次探討丹參注射液對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎治療作用的機(jī)制。