王 信，程 亮，王亞藝，高旭升，蔡曉劍

(青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海 西寧 810016)

【研究意義】馬鈴薯是我國第四大糧食作物，也是重要的蔬菜和加工原料。2013年國家實施馬鈴薯主食化戰(zhàn)略后[1]，主產(chǎn)區(qū)省(自治區(qū)、直轄市)對馬鈴薯生產(chǎn)和管理更加重視，馬鈴薯種植面積穩(wěn)步擴(kuò)大，近年來基本穩(wěn)定在550萬hm2左右。南方主要將其作為蔬菜，北方則作為主要的糧食作物，尤其在西北干旱、半干旱地區(qū)及西南高寒山區(qū)馬鈴薯成為了主要的高產(chǎn)和救災(zāi)作物。馬鈴薯是青海省主要的糧食作物之一，2013年青海省馬鈴薯種植面積達(dá)到9.56萬hm2，總產(chǎn)量達(dá)到2150萬t[2]，僅次于小麥和油料，成為第3大作物，青海的馬鈴薯主要種植于互助、民和、樂都、湟中、大通、平安等東部各縣的山區(qū)。其中馬鈴薯軟腐病是青海馬鈴薯的主要病害之一，在田間、運輸途中及貯藏期間均可發(fā)生軟腐病，并常與干腐病復(fù)合侵染，引起較大損失，損失率達(dá)3 %～68 %，平均為15 %以上[3-4]，隨著帶病種薯的頻繁調(diào)運，種植面積逐年擴(kuò)大，該病的危害越來越重?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】馬鈴薯軟腐病是由幾種果膠桿菌屬單獨或復(fù)合侵染所引起的，通常情況下會對馬鈴薯塊莖造成嚴(yán)重危害。不同國家和地區(qū)對引起馬鈴薯腐爛的病原菌的相關(guān)報道不盡相同[5-6]。目前，公認(rèn)的引起馬鈴薯軟腐病的病原主要是由Dickeyaspp.[7-8]和Pectobacteriumspp.[5-6]。Dickeya是近年來成立的植物病原細(xì)菌新屬，其模式菌為原來的菊歐氏菌(Erwiniachrysanthemi)。Dickeyaspp.引起的細(xì)菌性軟腐病常給作物和花卉產(chǎn)業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該菌所引起的馬鈴薯細(xì)菌性軟腐病近年造成了歐洲國家、以色列和美國的喬治亞州馬鈴薯的大幅減產(chǎn)[7-8]，在我國馬鈴薯產(chǎn)區(qū)也有發(fā)生，該病是一種新發(fā)現(xiàn)的隨馬鈴薯種薯傳播的細(xì)菌性病害，比傳統(tǒng)的黑脛病菌(E.carotovorumsubsp.atrosepticum)侵染性更強，對歐洲的馬鈴薯生產(chǎn)已構(gòu)成威脅[7-8]。果膠桿菌屬(Pectobacteriumspp.)依據(jù)其寄主范圍、生理生化和分子特征，將其分為5個種，分別為Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum(Pcc) (syn.Erwiniacarotovorumsubsp.carotovorum),P.atrosepticum(Pa) (syn.E.carotovorumsubsp.atrosepticum),P.wasabiae(Pw) (syn.E.carotovorumsubsp.wasabiae),P.betavasculorum(Pbv) (syn.E.carotovorumsubsp.betavasculorum)和P.carotovorumsubsp.brasiliense(Pcb)[9]。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，它們的地理分布具有很大差異。其中Pcc作為引起馬鈴薯軟腐病的主要病原菌，其次是Pa、Dickeyaspp則較少。在我國主要是以Pcc和Dickeyaspp為主，Pa較少[10]。80年代中期，王金生等也曾報道馬鈴薯軟腐歐文氏桿菌Pa、Pcc和Dickeyaspp在我國的組成及分布，在284個菌株中Pcc占72.5 %，為優(yōu)勢病原菌；而集中分布在我國北方地區(qū)的Pa病原菌僅占5.3 %[11]。其中Pw寄主范圍很窄，最早在日本的辣根上分離出來，后來在美國、新西蘭和伊朗的馬鈴薯和觀賞植物中得到[12-16]。然而，在我國馬鈴薯和其它觀賞性植物上分離到Pw文獻(xiàn)鮮有報道?！颈狙芯壳腥朦c】本研究對大通縣朔北鄉(xiāng)多隆村馬鈴薯生產(chǎn)地塊馬鈴薯軟腐病發(fā)病組織中分離獲得菌株QDD-5進(jìn)行致病性分析，發(fā)現(xiàn)QDD-5在離體和活體條件下均能引起馬鈴薯塊莖組織典型的軟腐癥狀，經(jīng)表型特征及16S rRNA基因序列系統(tǒng)分析，該菌株被鑒定為Pw。這是首列引發(fā)青海馬鈴薯軟腐病病原菌報道，該病原菌鑒定對于控制馬鈴薯軟腐病，降低果膠桿菌對馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的影響具有重要意義。【擬解決的關(guān)鍵問題】明確青海省馬鈴薯細(xì)菌性軟腐病的系統(tǒng)發(fā)育和分布特點。

1 材料與方法

1.1 病樣采集及培養(yǎng)基

馬鈴薯軟腐病標(biāo)樣采集于青海省的大通縣的馬鈴薯生產(chǎn)田。 結(jié)晶紫果膠酸鹽選擇性培養(yǎng)基(CVP)：在500 mL的沸騰的蒸餾水中按順序加入：1 mL 0.75 g/L 結(jié)晶紫溶液，4.5 mL 1 mol/L NaOH溶液，3 mL 100 g/L CaCl2·2H2O溶液(新鮮溶液)，3.0 g瓊脂粉，1.0 g NaNO3，9.0 g聚果膠酸鈉，待聚果膠酸鈉加入時人工攪拌30 s，然后分別裝入三角瓶，121 ℃滅菌20 min，趁熱倒將培養(yǎng)基入無菌培養(yǎng)皿中，冷卻后制成平板。

Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB)：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化鈉10.0 g、瓊脂粉15 g，用去離子水混合定容至1000 mL，pH 7.0。然后分別裝入三角瓶，121 ℃滅菌20 min，趁熱將培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿，冷卻后制成平板。

1.2 病原菌分離

采用常規(guī)組織分離法分離病原菌。稱取0.1 g病塊莖置于250 mL的三角瓶中，并加入100 mL的蒸餾水，放入玻璃珠充分打散混合液，置于120 r/min 搖床中，培養(yǎng)30 min后，充分搖勻。用1 mL無菌的吸管吸取10-2菌懸液1 mL放入9 mL的無菌水管中，吹吸3次混勻即為10-3稀釋液，依次從10-3連續(xù)稀釋至10-7，即得一系列的10倍的稀釋液。每個梯度重復(fù)進(jìn)行3次平行試驗，分別涂布到CVP培養(yǎng)基上，25～27 ℃黑暗培養(yǎng)48 h，將典型形態(tài)的菌落在CVP培養(yǎng)基反復(fù)劃線，進(jìn)行純化培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行編號和保存。

1.3 致病力測定

選擇健康馬鈴薯品種大西洋的塊莖用于致病性分析。將待測菌株于液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，用無菌的9 g/L NaCl溶液(w/v)洗滌3次后，配置5×108cfu/mL的菌懸液。將無病的大小均勻的塊莖用自來水沖洗后放入0.5 %NaClO溶液(v/v)中洗2次，每次20 min，然后用無菌去離子水沖洗1～2次，放入超凈臺中自然晾干，用無菌竹牙簽給每個塊莖打2～3個接種孔，深度約為20 mm，取10 μl菌懸液用無菌9 g/L NaCl溶液配制成5×108cfu/mL的菌懸液加入到接種孔中，每個株系接種10個塊莖。用凡士林將塊莖上的接種孔封口保濕，將接種的塊莖置于溫度為22 ℃、相對濕度≥92 %的溫室培養(yǎng)。同等條件下，設(shè)無菌9g/L NaCl溶液為空白對照。接種后72 h時測量病斑的直徑并取其平均值作為病斑平均直徑。按以下分級標(biāo)準(zhǔn)記錄病斑：小于1～5 mm為弱致病力，5～10 mm為中等致病力，10 mm以上為強致病力。

1.4 株系形態(tài)和生物化學(xué)特性分析

菌落形態(tài)、革蘭氏染色和鞭毛染色及檸檬酸鹽分解和37 ℃生長測定參考《植病研究方法》(第3版)[17]進(jìn)行。病原菌對蔗糖、麥芽糖、山梨醇、阿拉伯醇、乳糖和α-甲基葡糖苷等的利用測定實驗參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》(第8版)[18]和《植病研究方法》(第3版)[17]進(jìn)行。選用本實驗室保存的軟腐病致病菌Pcc(編號: ECC71)為對照株系。

1.5 16S rRNA基因片段的擴(kuò)增和序列分析

1.5.1 基因組DNA的提取 將保存于-80 ℃冰箱的株系劃線并于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜活化，挑取單菌落放入液體LB培養(yǎng)基中置28 ℃培養(yǎng)16～18 h。病菌DNA的提取使用Ezup柱式SK8255試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)。取1 μl DNA溶液于2.0 %瓊脂糖凝膠(w/v)進(jìn)行電泳檢測，并于-20 ℃保存，備用。

1.5.2 16S rRNA片段的擴(kuò)增 應(yīng)用細(xì)菌通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCGGCTCAG-3′；1942 r(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行擴(kuò)增。每個PCR反應(yīng)體系總體積均為25 μl，包括2×TaqPCR MasterMix 12.5 μl(編號為KT201-02，Tiangen)，DNA模板(50 ng/L)1 μl，引物 27f 和引物1942 r (μmol/L) 1 μl，加雙蒸水10.5 μl。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃變性5 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min?；厥沾笮〖s1.5 kb的PCR產(chǎn)物。將其連接到pGEMT-Easy載體(Promega corp.，美國)上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。重組質(zhì)粒經(jīng)NotⅠ酶切和PCR鑒定后，送交生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.5.3 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 測序結(jié)果用軟件Chromas(ver. 2.4.1)進(jìn)行序列修正后，在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast檢索與目標(biāo)序列同源性高的DNA序列，與本文所測株系序列分別進(jìn)行序列比對。利用軟件MEGA(ver. 5.05)的UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，各分支的置信度自舉檢測(bootstrap)1000次。

1.6 Pw特異引物擴(kuò)增基因

Pw特異性引物EXPCCF(5′-GAACTTCGCACCGCCGACCTTCTA-3′)和EXPCCR (5′-GCCGTAATTGCCTACCTGCTTAAG-3′)[19]用于擴(kuò)增2個分離株系pECC2F序列區(qū)域。25 μl的PCR反應(yīng)體系：DAN模板1 μl(100 ng/L)，2×TaqPCR Master Mix 12 μl，上游引物1 μl(20 μmol/L)，下游引物1 μl(20 μmol/L)，加ddH2O至總體積25 μl。PCR擴(kuò)增條件： 94 ℃變性3 min；94 ℃30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。以2000 bp DNA Marker為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，取4 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2.0 %瓊脂凝膠電泳(w/v)，核酸染料染色觀察是否有特異性條帶產(chǎn)生。選用本實驗室保存的果膠桿菌致病菌Pcc(ECC71)為對照株系。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pw的分離和致病性測定

QDD-5病樣分離的菌株經(jīng)CVP選擇性培養(yǎng)基篩選，在CVP培養(yǎng)基上生長的株系向培養(yǎng)基內(nèi)部擴(kuò)展，形成杯狀凹陷，將分離的株系回接到宿主馬鈴薯塊莖上，塊莖組織從接種部位開始產(chǎn)生水漬狀病變并向接種點周圍迅速擴(kuò)散(圖1-B)。對接種發(fā)病的馬鈴薯塊莖組織重新分離病原菌，得到的1株能引起馬鈴薯塊莖軟腐癥狀。

2.2 軟腐病菌的形態(tài)及生物化學(xué)特征分析

軟腐病病樣中分離的QDD-5經(jīng)CVP選擇性培養(yǎng)基篩選，在CVP培養(yǎng)基上產(chǎn)生凹陷的株系。將株系轉(zhuǎn)接到LB固體培養(yǎng)基上，菌落形態(tài)呈圓形、乳白色、表面光滑，略隆起(圖1-A)。革蘭氏染色呈陰性。測試菌株QDD-5不能在37 ℃ 生長，能使明膠液化，不具有耐鹽性，對紅霉素不敏感，過氧化氫酶反應(yīng)為陽性，氧化酶、蔗糖試驗還原反應(yīng)、吲哚產(chǎn)生和磷酸酶活性試驗均為陰性，可以利用纖維二糖和檸檬酸鹽，不能利用D-麥芽糖、山梨醇、D-阿拉伯糖、α-甲基葡萄糖、乳糖、棉子糖和蜜二糖(表1)。這些結(jié)果與報道的P.wasabiae(黑腐果膠桿菌)的生物學(xué)形態(tài)特征和生理生化特性均吻合[15]。

圖1 株系在LB培養(yǎng)基平板上產(chǎn)生乳白色、光滑隆起菌落(A)和接種72 h后塊莖癥狀(B)Fig.1 Cup-shaped cavities formation of isolated pathogen from diseased tuber of potato in field on LB agar (A) and symptom of healthy tuber at 72 hours after in vitro-inoculation with the pathogen (B)

表1 菌株QDD-5的生理生化特性

注：+，陽性反應(yīng)；-，陰性反應(yīng)。*,馬鈴薯軟腐病致病菌株P(guān)cc,Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum(ECC71)，由本實驗室保存并提供本研究中作為陽性對照使用。

Note: ‘+’and ‘-’ indicated positive and negative reactions, respectively. *：One known strain causing bacterial soft rot of potato,Pcc,Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum(ECC71), were preserved in our laboratory and provided to use as positive control in this study.

2.3 16S rRNA的序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

本研究中分離獲得的QDD-5和對照菌株Ecc71的16S rRNA基因PCR擴(kuò)增，均得到一條大小約為1.5 kb的產(chǎn)物(圖2)，測序結(jié)果經(jīng)在NCBI數(shù)據(jù)庫中與已知序列進(jìn)行BLAST比對，序列比對結(jié)果表明，菌株QDD-5與已報道的Pw(NR116048.1)的16SrRNA基因的序列的相似度(或一致性)均達(dá)99 %?；?6S rRNA基因完整序列，以馬鈴薯黑脛病致病菌DickeyadadantiiEch586(CP001836.1)為外組，將QDD-5的序列與已發(fā)表的28個株系的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)果顯示，本研究分離得到的QDD-5與已發(fā)表的Pw株系形成的類群構(gòu)成了明顯的分枝、已發(fā)表的Pcc、Pcb與Pco株系形成的類群構(gòu)成了獨立的分枝，Pa和Pb株系共同組成的類群與Pw株系組成的類群也聚集成另外分枝。

M：DNA marker DL2000；1：QDD-5；2：ECC71；3：無菌水用作陰性對照圖2 用引物27f/1942r進(jìn)行PCR擴(kuò)增不同分離株系16SrRNA的瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Ethidium bromide-stained agarose gel electrophoresis showing PCR products amplified with primers 27f/1942r in 16SrRNA genes of 2 different strains

2.4 Pw特異性引物擴(kuò)增

用特異性引物EXPCCF和EXPCCR擴(kuò)增QDD-5及其對照菌株Ecc71。結(jié)果表明這2個菌株中均擴(kuò)增得到一條大小約為550 bp的特異條帶(圖4)；由此可見，特異性引物EXPCCF和EXPCCR既能擴(kuò)增Pcc,又是Pw的特異性引物。

2.5 軟腐病菌致病力測定

本研究以馬鈴薯塊莖接種病原菌產(chǎn)生的病斑長度作為細(xì)菌致病力的測定，塊莖竹簽傷口接種后72 h統(tǒng)計病斑長度，發(fā)現(xiàn)QDD-5與Ecc71之間不存在明顯的致病力差異，按病斑長度劃分低、中和高等致病力。在接種后72 h時表現(xiàn)較強致病力，QDD-5與Ecc71致病力均是中等(表2)。

每個分支點的數(shù)目顯示自舉支持的百分比。bar表示進(jìn)化枝的遺傳距離圖3 菌株QDD-5與其他株系的16S rRNA基于序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on comparison of complete 16S rRNA gene sequences of QDD-5 strain with that of 28 Pectobacterium strains submitted at NCBI database

M：DNA marker DL2000；1：無菌水用作陰性對照；2：QDD-5；3：ECC71圖4 分離的2個用特異引物EXPCCF/EXPCCR的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.4 Ethidium bromide-stained agarose gel electrophoresis of PCR products amplified with primers EXPCCF/EXPCCR from 2 different strain collections

3 討 論

本研究對從大通縣朔北鄉(xiāng)多隆村馬鈴薯軟腐病樣中分離到的菌株QDD-5進(jìn)行了形態(tài)和生理生化表型特征觀察以及分子診斷，將其鑒定為Pectobacteriumwasabiae。Pw的發(fā)生引起了包括歐洲、亞洲、澳洲、非洲和美洲國家的密切關(guān)注。據(jù)調(diào)查，Pw在20世紀(jì)70年代波蘭和荷蘭馬鈴薯植株上發(fā)生，80年代在美國分離獲得PwIFB5311、IFB5312和IFB5313菌株，90年代初在芬蘭和蘇格蘭確認(rèn)該病原菌。本試驗菌株QDD-5與對照菌株ECC71生理生化指標(biāo)存在著許多差別，最明顯的區(qū)別是測試菌株QDD-5不能在37 ℃生長，不具有耐鹽性，不能利用乳糖、棉子糖和蜜二糖，而ECC71則剛好與其相反，所以這2個菌株也屬于不同的亞類群，QDD-5與發(fā)表的Pw株系表現(xiàn)一致，支持其屬于Pw種的歸類。

隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，16S rRNA已經(jīng)發(fā)展成為用于表型特征無法解決的Pectobacterium種或亞種的鑒別。為了準(zhǔn)確特征分離到的QDD-5菌株，本研究克隆了QDD-5和ECC71菌株16S rRNA基因序列，并將其與發(fā)表的27個軟腐果膠桿菌16S rRNA基因序列類型比對分析，發(fā)現(xiàn)QDD-5與已發(fā)表的6個株系相似性達(dá)到99 %，共同形成明顯的Pw分枝。Edward 等報道用EXPCCF/EXPCCR特異性引物在Pcc菌系中擴(kuò)增到550 bp的特異性條帶(ECC71)，而Pw中有相同的擴(kuò)增產(chǎn)物[19](QDD-5)。Nabhan等研究認(rèn)為16SrRNA僅能區(qū)分細(xì)菌種的差異，而不能對亞種進(jìn)行區(qū)分[20]，本研究中在QDD-5和ECC71經(jīng)過16S rRNA完整序列擴(kuò)增和UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析，聚成不同類群，QDD-5菌株和Pw株系ICMP 9121(NR116048.1)構(gòu)成亞類群，而ECC71與Pcc(JF926743.1)聚在一起構(gòu)成亞類群，遺傳關(guān)系相對較遠(yuǎn)的Pco和Pcb株系單獨成群?？梢?，基于16S rRNA基于序列在一定程度上也揭示亞種之間的遺傳關(guān)系。在以前研究中，馬鈴薯上的Pw分離物能使馬鈴薯薯塊軟腐、莖枯萎或褐化[14,21-22]。然而，用PCR方法或DNA雜交的結(jié)果顯示[13]，Pw缺失三級分泌系統(tǒng)(T3SS)或者缺失T3SS基因簇的調(diào)節(jié)基因，而T3SS是革蘭氏陰性細(xì)菌中重要的在不同環(huán)境中傳遞毒性因子的系統(tǒng)，也是Pa、Pc等果膠桿菌侵染馬鈴薯參與致病性的基因簇[23-24]。然而，T3SS對Pw的致病性或許沒有像在Pa、Pc中那么重要，或者Pw是用其它基因簇代替T3SS侵染寄主植物。Pw除了T3SS缺失，其它分泌系統(tǒng)是否和果膠桿菌其它亞種相同，還需要更進(jìn)一步研究。同時從馬鈴薯軟腐性病害分離到的主要是Pcc，黑脛病分離到的主要是Pa，關(guān)于Pw、Pcc與Pa二者或三者在青海馬鈴薯產(chǎn)區(qū)的分布、擴(kuò)散及復(fù)合浸染也有待進(jìn)一步研究。本研究對青海馬鈴薯細(xì)菌性軟腐病病原進(jìn)行了準(zhǔn)確鑒定，也是首次報道由Pw引起青海馬鈴薯軟腐病，這一研究結(jié)果可為馬鈴薯軟腐病綜合控制技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。

表2 Pw株系的采集地點及致病力等級

注：M為致病力中等。

Note: M represents moderate pathogenicity.

4 結(jié) 論

綜上所述，Pectobacterium是引起青海地區(qū)馬鈴薯軟腐病的主要病原菌，在馬鈴薯生長、收獲、運輸和貯藏期間，都可以造成重大損失。從青海省大通縣馬鈴薯軟腐組織中分離到軟腐病原菌1株?；谏飳W(xué)鑒定和16S rRNA序列以及特征序列擴(kuò)增分析，該菌株在系統(tǒng)發(fā)育上屬于Pectobacteriumwasabiae。生理生化試驗表明，該病原菌株不能在37 ℃ 生長，能使明膠液化，不具有耐鹽性，對紅霉素不敏感，過氧化氫酶反應(yīng)為陽性，氧化酶、蔗糖試驗還原反應(yīng)、吲哚產(chǎn)生和磷酸酶活性試驗均為陰性，可以利用纖維二糖和檸檬酸鹽，不能利用D-麥芽糖、山梨醇、D-阿拉伯糖、α-甲基葡萄糖、乳糖、棉子糖和蜜二糖。