曹學(xué)濤，裴生偉，張晉，李發(fā)弟,2，李剛，李萬宏，樂祥鵬

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綿羊Y染色體特異性引物及SNPs的篩選

曹學(xué)濤1，裴生偉1，張晉3，李發(fā)弟1,2，李剛3，李萬宏1，樂祥鵬1

（1蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，蘭州 730020；2甘肅省肉羊繁育生物技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅民勤 733300；3甘肅省家畜繁殖中心，甘肅武威 733000）

【目的】哺乳動(dòng)物Y染色體雄性特異區(qū)在減數(shù)分裂過程中不與X染色體發(fā)生重組，遵循嚴(yán)格的父系遺傳，是研究父系遺傳多樣性的重要遺傳資源；此外絕大多數(shù)Y染色體基因主要或者特異性的在睪丸組織中表達(dá)，并在精子發(fā)生和雄性繁殖力方面扮演著至關(guān)重要的作用。由于Y染色體測(cè)序極其困難，造成很多物種Y染色體序列很少。因此本文基于目前現(xiàn)有?？苿?dòng)物Y染色體引物信息，旨在鑒定綿羊Y染色體特異性引物，比較綿羊Y染色體基因片段與巖羊、牛、山羊和牦牛Y染色體的差異，同時(shí)篩選不同綿羊品種在Y染色體基因片段內(nèi)的SNPs，將找到的Y-SNPs和綿羊的睪丸大小進(jìn)行相關(guān)性分析，為鑒定綿羊Y染色體基因片段奠定基礎(chǔ)，并為今后綿羊Y染色體單倍型的構(gòu)建、綿羊胚胎性別早期鑒定和公綿羊繁殖力相關(guān)分子標(biāo)記的篩選提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā扛鶕?jù)目前文獻(xiàn)公布的29對(duì)?？苿?dòng)物Y染色體特異性引物序列，以母綿羊和水分別作陰性和空白對(duì)照，以公綿羊DNA為模板驗(yàn)證引物的雄性特異性；確定綿羊Y染色體特異引物后，利用DNA混合池測(cè)序結(jié)合限制性長(zhǎng)度片段多態(tài)性等技術(shù)在薩福克羊（n=146）、白薩?？搜颍╪=91）、東弗里升羊（n=6）、特克塞爾羊（n=72）、南非肉用美利奴羊（n=17）、杜泊羊（n=32）、湖羊（n=55）、藏羊（n=34）、灘羊（n=43）和巖羊（n=14）公羊群體中進(jìn)行Y-SNPs掃描。用Chromas和DNASTAR等軟件分析混合池測(cè)序的結(jié)果，利用DNAman軟件將綿羊Y染色體基因片段與牦牛、山羊、黃牛和巖羊進(jìn)行同源性分析。同時(shí)，測(cè)量薩?？搜?、白薩?？搜?、東弗里升羊、特克塞爾羊、南非肉用美利奴羊、杜泊羊周歲的陰囊圍，利用SPSS 19.0軟件分析SNPs位點(diǎn)與公羊陰囊圍的相關(guān)性。【結(jié)果】在分析的29對(duì)引物中，6對(duì)引物為綿羊Y染色體特異性引物，分別能擴(kuò)增出3、6、、、11和6片段。17對(duì)引物未能出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，6對(duì)引物在母羊DNA中出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)綿羊6個(gè)基因片段與巖羊、牛、山羊、牦牛的同源性在81.51%—98.84%。此外，首次在薩?？撕桶姿_?？搜蛉后w的11片段中鑒定得到一個(gè)G＞A的突變，通過I酶切分析發(fā)現(xiàn)在薩?？搜颉姿_?？搜蛑杏?種基因型（AA、GG），在其他7個(gè)綿羊品種中只有GG基因型。在白薩福克羊群體中，GG基因型的頻率為0.747，AA基因型的頻率為0.253；在薩?？搜蛉后w中GG基因型的頻率為0.986，AA基因型的頻率為0.014；說明在薩福克羊和白薩?？搜蛉后w中，GG基因型為優(yōu)勢(shì)基因型。關(guān)聯(lián)分析顯示在白薩福克羊群體中，GG基因型個(gè)體周歲的陰囊圍顯著的高于AA基因型（=0.029）?！窘Y(jié)論】鑒定得到6個(gè)綿羊Y染色體基因片段，它們與牛、山羊、牦牛和巖羊具有較高的同源性，表明Y染色體基因在進(jìn)化過程中具有一定的保守性。首次在薩?？撕桶姿_福克羊群體11片段中找到一個(gè)Y-SNP（G＞A），其與白薩福克羊周歲的睪丸大小緊密相關(guān)。

Y染色體；綿羊；單核苷酸多態(tài)性

0 引言

【研究意義】Y染色體基因在研究父系遺傳多樣性、維持雄性特性，精子發(fā)生和雄性繁殖力起著關(guān)鍵作用，Y染色體分子標(biāo)記已經(jīng)運(yùn)用于綿羊父系起源進(jìn)化研究及父系單倍型構(gòu)建[1-3]。然而Y染色體測(cè)序困難，造成綿羊Y染色體基因序列極度貧乏。因此本研究基于前期?？苿?dòng)物Y染色體研究成果，進(jìn)行綿羊Y染色體基因片段鑒定和Y-SNPs的篩選，以期為優(yōu)秀種公羊的早期選擇、胚胎性別的早期鑒定和綿羊品種的父系遺傳多樣性的保護(hù)提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】哺乳動(dòng)物的性染色體，X和Y染色體，是由一對(duì)原始的常染色體進(jìn)化而來[4]。Y染色體是雄性動(dòng)物特有的性染色體，由兩部分組成：擬常染色體區(qū)域和Y染色體雄性特異區(qū)（male specific region of Y chromosome, MSY）組成。MSY區(qū)在減數(shù)分裂過程中不與X染色體發(fā)生重組交換，遵循嚴(yán)格的父系遺傳。Y染色體結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，包含有大量的重復(fù)序列和回文結(jié)構(gòu)，使得其序列的組裝極為困難[5]。到目前為止，綿羊Y染色體只有、等少數(shù)基因的部分序列已公布[6-8]。MEADOWS等利用23對(duì)人、牛、綿羊Y染色體特異性引物擴(kuò)得到綿羊、、、、等Y染色體基因的部分片段[9]。FENG等擴(kuò)增得到巖羊ZFY基因639 bp的片段[7]。劉帥兵克隆得到ZFY基因整個(gè)mRNA全長(zhǎng)[10]。熊勇等克隆得到藏系綿羊ZFY基因447 bp的片段[11]。蔣利等利用山羊SRY基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增得到阿勒泰羊、藏綿羊SRY基因整個(gè)編碼區(qū)的雄性特異性片段，研究表明SRY基因在不同綿羊品種間具有高度的同源性[12]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前只有人類、猩猩、獼猴、小鼠和牛等少數(shù)物種的Y染色體完成了測(cè)序[3,5,13-15]。關(guān)于綿羊Y染色體，少數(shù)研究者只擴(kuò)增出基因的部分片段，未見克隆得到完整的Y染色體基因序列?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究基于?？苿?dòng)物現(xiàn)有Y染色體特異引物鑒定綿羊Y染色體單拷貝基因，掃描Y染色體基因在不同綿羊品種中的SNPs，以期找到Y(jié)染色體分子標(biāo)記，以期為篩選不同羊品種Y染色體SNPs提供基礎(chǔ)，也為綿羊早期胚胎性別的鑒定提供了分子標(biāo)記，為進(jìn)一步研究綿羊Y染色體基因序列奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016年10月至2017年5月在蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 試驗(yàn)材料

496份公綿羊和14份公巖羊的血液樣本，包括采自北京澳鑫牧業(yè)有限公司的薩?？搜颍╪=146）、白薩?？搜颍╪=91）、東弗里升羊（n=6）、特克塞爾羊（n=72）、南非肉用美利奴羊（n=17）、杜泊羊（n=32），甘肅金昌中天羊業(yè)有限公司的湖羊（n=55），甘肅甘南藏族自治州的藏羊（n=34），寧夏鹽池縣的灘羊（n=43），巖羊采自新疆動(dòng)物園野生動(dòng)物保護(hù)中心。采集3只湖羊母羊血液（甘肅金昌中天羊業(yè)有限公司）及3只巖羊母羊血液，作為陰性對(duì)照。同時(shí)在收集血樣時(shí)測(cè)定薩?？搜颉姿_?？搜?、東弗里升羊、特克塞爾羊、南非肉用美利奴羊、杜泊羊周歲（周歲±15—20 d）的陰囊圍直徑。

1.2 DNA的提取和DNA池的構(gòu)建

采用常規(guī)的酚-氯仿抽提法提取綿羊血液基因組DNA[16]。用Nano drop 2000（Thermo，美國）檢測(cè)提取的DNA濃度和純度，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量。將質(zhì)量檢測(cè)合格綿羊和巖羊DNA統(tǒng)一稀釋為50 ng·μL-1，每個(gè)個(gè)體DNA取10 μL，以同一個(gè)品種盡量在一個(gè)DNA池的原則，每10個(gè)個(gè)體混成一個(gè)DNA池，共計(jì)51個(gè)DNA池，混合均勻后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 綿羊Y染色體特異性引物的篩選

查閱相關(guān)文獻(xiàn)可知，目前在牛、牦牛、山羊等牛科動(dòng)物Y染色體研究有29對(duì)引物（表1），分別能擴(kuò)增出MSY區(qū)的、、、、、等基因。本研究的29對(duì)引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成。實(shí)驗(yàn)以公羊DNA混合池為模板，以母羊DNA為陰性對(duì)照，滅菌水為空白對(duì)照，通過PCR擴(kuò)增確定綿羊Y染色體特異性引物。PCR擴(kuò)增體系為50 μL：模板2 μL，上、下游引物各1 μL，2×EasyTaq酶25 μL和ddH2O 21μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性30 s；94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min/1kb，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 引物序信息

表中僅列出綿羊Y染色體特異性引物的退火溫度The annealing temperatures were listed for those ovine Y-specific primers

1.4 綿羊Y染色體特異性基因片段SNPs篩選

將上述鑒定為綿羊Y染色體特異性引物，以DNA混合池為模板的PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。DNAstar和Chromas軟件用于測(cè)序結(jié)果分析，DNAMAN用于多序列比對(duì)及同源性分析。經(jīng)過混合池測(cè)序，在11片段內(nèi)鑒定得到一個(gè)G＞A突變，利用Watcut軟件分析（http://watcut. uwaterloo.ca/template.php?act=snp_new）發(fā)現(xiàn)該突變位點(diǎn)可被限制性內(nèi)切酶188I識(shí)別。酶切反應(yīng)體系：10×NEB Buffer 3 μL，PCR產(chǎn)物4 μL和5U188I內(nèi)切酶，加滅菌水至25 μL。酶切反應(yīng)條件為37℃溫育3 h。取酶切消化液10 μL加樣于2.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 19.0軟件分析基因位點(diǎn)與綿羊睪丸大小的相關(guān)性。先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析，確定是否存在離群值，根據(jù)數(shù)據(jù)特征，利用單因素方差分析（ANOVA）探究基因型效應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 綿羊Y染色體特異性引物

通過PCR擴(kuò)增，本研究發(fā)現(xiàn)29對(duì)引物中6對(duì)引物，包括3、6、、、11、6確定為Y染色體特異性引物（圖1），只在公羊DNA上出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，在母羊DNA及水中沒有擴(kuò)增產(chǎn)物。此外17對(duì)引物未能出現(xiàn)擴(kuò)增條帶或非特異性擴(kuò)增，6對(duì)引物母羊DNA能擴(kuò)增出條帶（電子版附圖S1）。

2.2 綿羊Y染色體特異性DNA片段與其他物種的同源性分析

通過對(duì)上述6對(duì)特異性引物的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，分析發(fā)現(xiàn)3片段大小為614 bp，該片段與山羊第11外顯子和部分CDS區(qū)相似度較高，相似度為98.84%。6片段大小為461 bp，該片段與山羊部分CDS區(qū)相似度較高，相似度為98.84%。片段大小為444 bp，該片段與牛第26外顯子相似度較高，相似度為84.96%。片段大小為256 bp，該片段與牛第19外顯子相似度較高，相似度為81.51%。片段大小為440 bp，該片段與山羊SRY基因序列相似度較高，相似度為90.41%，該基因片段的部分片段（237 bp）與NCBI公布的綿羊的SRY基因CDS區(qū)（AY604735.1）相似度達(dá)100%。3片段大小為621 bp，該片段與牛ZFY基因第11外顯子和部分CDS區(qū)相似度較高，相似度為97.67%。

用DNAMAN生物軟件，將綿羊3、6、、、11、6基因序列與山羊、牛、牦牛和巖羊相應(yīng)基因序列進(jìn)行序列比對(duì)（電子版附圖S2—S7），計(jì)算不同物種基因序列間的同源性大小（表2）。結(jié)果表明，綿羊3基因片段與巖羊、山羊、牛、牦牛各物種間同源性大小分別為98.84%、97.89%、97.08%和95.79%；綿羊SRY6基因片段與巖羊、山羊、牛、牦牛各物種間同源性大小分別為95.25%、93.93%、90.54%和90.32%；綿羊USP9Y基因片段與牛、牦牛各物種間同源性大小分別為84.96%、84.67%；綿羊UTY基因片段與巖羊、黃牛、牦牛各物種間同源性同為96.77%、81.51%和81.51%；綿羊SRY11基因片段與巖羊、山羊、牛、牦牛各物種間同源性大小分別為92.63%、90.41%、84.97%和84.75%；綿羊ZFY6基因片段與巖羊、山羊、牛、牦牛各物種間同源性大小分別為99.06%、89.11%、97.67%和86.76%。由于USP9Y基因是從巖羊母羊DNA中擴(kuò)增出，表明該片段并不是巖羊Y染色體片段。

A：ZFY3基因PCR擴(kuò)增結(jié)果；B：SRY6基因PCR擴(kuò)增結(jié)果；C：USP9Y基因PCR擴(kuò)增結(jié)果；D：UTY基因PCR擴(kuò)增結(jié)果；E：SRY11基因PCR擴(kuò)增結(jié)果；F：ZFY6基因PCR擴(kuò)增結(jié)果；1-3公羊DNA，4-6母羊DNA，7-9 ddH2O，M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000

表2 綿羊Y染色體基因與不同物種同源基因的比較

2.3 綿羊Y染色體SNPs的篩選及基因效應(yīng)分析

通過測(cè)序，3、6、、、6基因序列均未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。在薩福克和白薩?？搜蛉后w中，11片段混合池測(cè)序出現(xiàn)雙峰，進(jìn)一步對(duì)其中一個(gè)混池的每個(gè)個(gè)體分別進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證為G＞A的突變（圖2）。對(duì)薩?？思鞍姿_福克的個(gè)體進(jìn)行PCR-RFLP檢測(cè)，PCR產(chǎn)物經(jīng)188I酶切后產(chǎn)生AA和GG 2種基因型（圖3）。AA基因型個(gè)體的擴(kuò)增產(chǎn)物能被188I酶切后將產(chǎn)生4個(gè)片段，分別為54、63、151和172 bp；GG基因型個(gè)體的擴(kuò)增產(chǎn)物能被188I酶切后將產(chǎn)生3個(gè)片段，分別為63、172和205bp。11片段G＞A突變位點(diǎn)在薩?？搜颉姿_?？搜?、東弗里升羊、特克塞爾羊、南非肉用美利奴羊、杜泊羊、湖羊、藏羊、灘羊公羊群體中的基因型頻率、等位基因頻率見表3。結(jié)合混合池測(cè)序及酶切結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在薩福克羊、白薩?？搜蛑写嬖贏A和GG基因型，其中在白薩?？搜蛉后w中AA基因型頻率為0.253，GG基因型頻率為0.747；在薩福克羊群體中AA基因型頻率為0.014，GG基因型頻率為0.986。結(jié)果顯示GG基因型在薩福克羊和白薩?？搜蛉后w中為優(yōu)勢(shì)基因型；而東弗里升羊、特克塞爾羊、南非肉用美利奴羊、杜泊羊、湖羊、藏羊、灘羊公羊群體中只有GG基因型。通過對(duì)巖羊個(gè)體的混合池測(cè)序，在11片段也未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。性狀關(guān)聯(lián)分析表明，在白薩?？搜蛉后w中，GG基因型個(gè)體的睪丸大小顯著的高于AA基因型（表4）。

A. AA基因型; B. GG基因型

表3 SRY11片段G＞A 位點(diǎn)在不同綿羊品種中的基因型和等位基因頻率

1，3：AA基因型；2，4：GG基因型；M為DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000

表4 SRY11片段G＞A位點(diǎn)與白薩福克羊睪丸大小之間的關(guān)聯(lián)分析

3 討論

在目前研究綿羊起源進(jìn)化及單倍型分析中，更多的是以線粒體基因遺傳多樣性為基礎(chǔ)的母系遺傳研究，而利用以Y-SNPs為基礎(chǔ)的父系遺傳的研究較少。綿羊的父系及母系遺傳相結(jié)合才能更加全面、系統(tǒng)的分析綿羊起源進(jìn)化、單倍型及分類。本研究篩選得到了6對(duì)綿羊Y染色體特異性引物，均為首次擴(kuò)增得到，與MEADOWS等篩選得到9對(duì)綿羊Y染色體特異性引物無重復(fù)[9]。（sex-determining region on Y chromosome,）位于哺乳動(dòng)物Y染色體，是性別決定直接相關(guān)的基因。該基因從人的Y染色體上首次分離得到，并被確定為睪丸決定因子[24]。MEADOWS等通過測(cè)序在SRY基因5′啟動(dòng)區(qū)發(fā)現(xiàn)8個(gè)SNPs，結(jié)合Y染色微衛(wèi)星鑒定綿羊及野生綿羊單倍型[25]。MEADOWS等發(fā)現(xiàn)得到綿羊第一外顯子與牛的同源性為94.7%，并在5′啟動(dòng)區(qū)鑒定得到了一個(gè)A＞G的突變[9]。在本次研究擴(kuò)增得到了兩個(gè)SRY基因片段，其與牛的同源性分別為90.54%和84.97%，這與前人的研究相似，說明綿羊和牛SRY基因具有較高的同源性。本研究在11片段鑒定到1個(gè)G＞A的同義突變，通過188I酶切分析，發(fā)現(xiàn)只有在薩?？搜?、白薩福克羊中有AA和GG 2種基因型，而在其他7個(gè)綿羊品種和巖羊中只有GG基因型，暗示該位點(diǎn)可能只存在于薩?？搜蚝桶姿_?？搜虻难y(tǒng)中，但還需要在更多的綿羊品種群體中進(jìn)行驗(yàn)證。此外該突變位點(diǎn)與白薩福克羊周歲的睪丸大小緊密相關(guān)，即GG基因型個(gè)體的睪丸大小顯著大于AA型個(gè)體。本研究為首次發(fā)現(xiàn)Y染色體突變與綿羊繁殖性狀相關(guān)。該位點(diǎn)在更大的白薩福克羊群體進(jìn)行驗(yàn)證后可用于白薩福克種公羊的選育。

ZFY基因即Y連鎖的鋅指蛋白因子（zinc finger protein, Y-linked），位于Y染色體短臂（Yp11.3）上，由11個(gè)外顯子和1個(gè)隨機(jī)重復(fù)區(qū)域的13個(gè)“鋅-指”結(jié)構(gòu)組成，在雄性動(dòng)物睪丸的生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮作用[26-27]。毛德才研究發(fā)現(xiàn)牦牛、猩猩、人、牛等9個(gè)物種間的核苷酸序列有較高同源性[28]。熊勇等研究表明藏系綿羊ZFY基因與豬、摩弗倫羊、狼、人類等其他物種之間具有很高的同源性[11]。LAWSON等通過進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)：綿羊與巖羊、山羊、牛的親緣關(guān)系較近[8]。ARKADI克隆得到了整個(gè)牛ZFY基因整個(gè)編碼區(qū)及馬和豬ZFY基因編碼區(qū)部分序列，通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)ZFY基因編碼區(qū)在3個(gè)物種的同源性較高[29]。本研究發(fā)現(xiàn)綿羊3和6片段與巖羊、山羊、牛、牦牛等物種間同源性大小在89.11%—99.6%，表明該基因在不同物種間也具有較高的同源性，與前人的研究基本一致。AASEN等[30]利用片段的擴(kuò)增及酶切鑒別人、牛、綿羊和山羊的胚胎性別，該研究的結(jié)果也可用于綿羊胚胎性別的早期鑒定。

SATOU等[31]研究發(fā)現(xiàn)USP9Y基因的突變影響小鼠睪丸重量。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在牛USP9Y基因第26內(nèi)含子發(fā)現(xiàn)了一個(gè)81 bp的插入缺失，并用于構(gòu)建牛Y染色體單倍型及區(qū)分瘤牛和普通牛[21,32-33]。本研究在USP9Y基因片段中沒有檢測(cè)到遺傳變異，今后需要在更多的綿羊品種進(jìn)行Y-SNPs掃描。先前的研究利用BAC的方法在絨山羊上鑒定到USP9Y基因348 bp的片段，其與家貓、人、恒河猴、黑猩猩等的同源性在89％以上[34]。本研究擴(kuò)增得到的綿羊USP9Y基因與牛、牦牛各物種間同源性大小分別為84.96%、84.67%，表明該基因在進(jìn)化過程中具有一定的保守性。USP9Y基因在巖羊母羊DNA中擴(kuò)增出，表明該片段并不是巖羊Y染色體片段，因此本研究的結(jié)果可作為區(qū)分巖羊和綿羊的分子標(biāo)記。

UTY基因即Y連鎖的泛轉(zhuǎn)錄三角形四肽重復(fù)因子，在人上的研究發(fā)現(xiàn)UTY基因有6個(gè)不同的mRNA轉(zhuǎn)錄本，UTY蛋白被認(rèn)為是未成熟的組織適合性抗原，可啟動(dòng)男性特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)[35-36]。MEADOWS等擴(kuò)增得到了UTY基因外顯子1，通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)與牛的同源性為98.1%[9]。本研究擴(kuò)增得到的綿羊UTY基因與巖羊、牛、牦牛各物種間同源性達(dá)81.51%—96.77%，表明該基因在進(jìn)化過程中相對(duì)保守。GINJA等擴(kuò)增牛UTY基因19外顯子，發(fā)現(xiàn)有一個(gè)C＞A的突變[23]。然而在本研究中在UTY基因上并未檢測(cè)到突變位點(diǎn)。

本研究首次在發(fā)現(xiàn)一個(gè)G＞A的突變，在3、6、、、6片段均未發(fā)現(xiàn)突變，其原因可能與樣本量大小及品種差異有關(guān)。但是本研究的結(jié)果為今后我國綿羊品種父系遺傳多樣性的研究奠定了基礎(chǔ)。當(dāng)然，為了系統(tǒng)和全面研究綿羊Y染色體，必須依賴綿羊Y染色體完整的序列，完成綿羊Y染色體測(cè)序是研究綿羊父系遺傳多樣性和綿羊雄性繁殖力育種亟待解決的難題。

4 結(jié)論

本研究首次擴(kuò)增得到綿羊、、和4個(gè)基因的6個(gè)片段。通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)綿羊3、6、、、6片段與巖羊、牛、山羊、牦牛的具有較高的同源性。首次在11片段發(fā)現(xiàn)G＞A的突變，該突變位點(diǎn)只存在于薩?？撕桶姿_?？斯蛉后w中，并與白薩福克羊睪丸大小緊密相關(guān)。

A：2 PCR擴(kuò)增結(jié)果；B：4 PCR擴(kuò)增結(jié)果；C：5 PCR擴(kuò)增結(jié)果；D：9 PCR擴(kuò)增結(jié)果；E：1 PCR擴(kuò)增結(jié)果；F：9 PCR擴(kuò)增結(jié)果；1-3公羊DNA，4-6母羊DNA，7-9ddH2O，M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000

A.PCR products of3 fragment; B.PCR products of6 fragment; C.PCR products offragment; D.PCR products offragment; E.PCR products of11 fragment; F.PCR products of3 fragment;1-3 rams DNA;4-6 ewes DNA;7-9 ddH2O;M.DL2000 marker

圖S1 綿羊Y染色體非特異性PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig. S1 PCR products of Y nonspecific fragment in sheep

圖S2 不同物種3基因序列比對(duì)結(jié)果

Fig. S2 Comparison of ovine3 gene sequence with other species

圖S3 不同物種6基因序列比對(duì)結(jié)果

Fig. S3 Comparison of ovine6 gene sequence with other species

圖S4 不同物種基因序列比對(duì)結(jié)果

Fig. S4 Comparison of ovinegene sequence with other specie

圖S5 不同個(gè)物種基因序列比對(duì)結(jié)果

Fig. S5 Comparison of ovinegene sequence with other specie

圖S6 不同物種11基因序列比對(duì)結(jié)果

Fig. S6 Comparison of ovine11 gene sequence with other specie

圖S7 不同物種6基因序列比對(duì)結(jié)果

Fig. S7 Comparison of ovine6 gene sequence with other specie

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（責(zé)任編輯 林鑒非）

Screening of Y Chromosome Specific Primers and Y-SNPs in Sheep

CAO XueTao1, PEI ShengWei1, ZHANG Jin3, LI FaDi1,2, Li Gang3, LI WanHong1, YUE XiangPeng1

(1State Key Laboratory of Grassland Agro-ecosystems, Lanzhou University/Key Laboratory of Grassland Livestock Industry Innovation, Ministry of Agriculture and Rural Affairs/ College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020;2Engineering Laboratory of Mutton Sheep Breeding and Re-production Biotechnology in Gansu Province, Minqin 733300, Gansu;3Animal Breeding Centre of Gansu Province, Wuwei 733000, Gansu)

【Objective】The male specific region of the mammalian Y chromosome (MSY)does not recombine with X chromosome during meiosis process, which is an important genetic resource for analyzing paternal genetic diversity due to its strict father to son inherited character. In addition, most of genes on MSY exclusively or predominantly express in the testis, indicating they may play essential roles in spermatogenesis and male reproduction. Since it is extremely difficult to sequence of entire Y chromosome, many species have very few Y chromosome sequences. Therefore, the current study was conducted to select ovine Y chromosome specific primers and Y-SNP based on the previous primer information used in bovidae species, and to compare the Y-fragment sequences similarity among sheep, bovine, goat, yak and bharal. Meanwhile, the Y-SNP was associated with sheep scrotal circumference to supply scientific basis for constructing ovine Y-haplotypes, identifying molecular markers for embryo sex and male reproductive traits in the future.【Method】Based on the investigation of available references about bovidae Y chromosome, 29 pairs of Y-primers reported in cattle, yak, goat were selected to amplify rams DNA using ewes DNA and ddH2O as negative controls. Subsequently, the Y-SNPs within ovine Y-specific fragment identified of different sheep breeds were investigated by DNA sequencing of DNA pooling and PCR-RFLP methods, including Suffolk sheep (n=146),White Suffolk sheep (n=91),East Friesian sheep (n=6), Texel sheep (n=72), South African Mutton Merino (n=17), Dorper sheep (n=32), Hu sheep (n=55),Tibetan sheep (n=34), Tan sheep (n=43), and bharal (n=14). Chromas and DNASTAR were used to analyze the results of DNA-pool sequencing, and DNAman was used for homology analysis of yak, goat, cattle and bharal. Meanwhile, the correlation analysis between the11 gene fragment polymorphisms and the testis size was performed by SPSS 19.0.【Result】The results showed that 6 out of 29 pairs of primers analyzed were ovine Y-specific, which could amplify3,6,,,11 and6 fragments, respectively. However, 17 pairs of primers failed to show amplification bands, and 6 pairs of primers showed amplified bands in the DNA of the ewes. The similarity of them among sheep, bharal, cattle, goat and yak ranged from 81.51% to 98.84%. In addition, a Y-SNP (G＞A) with in11 fragment was first identified in the Suffolk and white Suffolk sheep.According to RCR-RFLP analysis, two genotypes (AA, GG) were detected in the Suffolk sheep and white Suffolk sheep, while only the GG genotype was found in the other seven sheep breeds. The genotypic frequencies of the GG and AA were 0.747 and 0.253 in White Suffolk sheep, respectively, while they were 0.986 and 0.014 in Suffolk sheep, indicating the dominant genotype was GG genotype in White Suffolk sheep and Suffolk sheep. Association analysis suggested that the testis size of the GG genotype was significantly higher than those of the AA genotype in the white Suffolk sheep population (=0.029).【Conclusion】In this study, six pairs of ovine Y-specific primers were identified, and the Y-linked fragment identified in ovine showed a high similarity with cattle, goats and yaks, indicating certain conservation in the evolutionary process. In addition, a Y-SNP was found to be specific in White Suffolk sheep and Suffolk sheep, which was closely associated with the testis size of white Suffolk sheep.

Y chromosome; sheep; single nucleotide polymorphism (SNP)

2017-12-25；

2018-04-17

甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項(xiàng)目（GNSW-2015-24，GNSW-2016-22）、甘肅省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（17YF1NA066）、甘肅省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目（GNCX-2014-41）、國家肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-38）和長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃（IRT13019）

曹學(xué)濤，E-mail：caoxt16@ lzu.edu.cn。信作者樂祥鵬，E-mail：lexp@lzu.edu.cn

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.15.0014