衛(wèi)永樂，溫志芳，劉 芳，張杰偉，黃武剛，蘭彥平，程麗莉，曹慶昌，胡廣隆

（1.運城農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西 運城 044000；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院，北京 100093）

葉綠體在植物細(xì)胞中具有與光合作用密切相關(guān)的一整套基因。鑒于葉綠體基因組的大小、結(jié)構(gòu)和基因型相對保守性，其已成為植物系統(tǒng)發(fā)育研究和識別物種的有力工具[1]。目前，某些葉綠體基因的功能已被研究，但有相當(dāng)一部分基因是未知的，例如一大類基因，即開放閱讀框（ORF）。它的DNA序列所編碼的特定蛋白質(zhì)名稱和功能仍在摸索中。由于ORF命名方法有諸多不妥，因此，學(xué)術(shù)界提出了一種新的YCF（假設(shè)葉綠體開放閱讀框）命名方法。例如，小麥的ORF38與菠菜ORF33的氨基酸序列相似性很高，因此都命名為ycf8基因[2]。

葉綠體DNA（cpDNA）序列已被分類學(xué)家廣泛用于重建植物系統(tǒng)發(fā)育[3]，然而，相對較少的葉綠體基因組區(qū)域被用于系統(tǒng)發(fā)育研究[4-5]。蛋白質(zhì)編碼基因容易比對，但通常更加保守，缺乏足夠的變異來解決種間和種內(nèi)關(guān)系[6-7]。比較基因組的研究表明，葉綠體體基因 ycf1，（hypothetical chloroplast open reading frame 1）可以比matK基因變異度更高[8]。ycf1是葉綠體基因組中第二長的基因（僅次于ycf2），并存在于迄今測序的幾乎所有植物葉綠體基因組中[9]。YCF1蛋白的功能是未知的。盡管如此，DRESCHER等[10]研究已經(jīng)證明，YCF1對植物生存至關(guān)重要。ycf1閱讀框通?？缭降怪弥貜?fù)區(qū)（IR）和小單拷貝（SSC）區(qū)域的邊界，這在葉綠體基因中是比較特殊的[9]。ycf1基因在系統(tǒng)發(fā)育研究中的效用最近才開始探索。NEUBIG等[11]研究表明，ycf1因為其保守的閱讀框，是相對容易擴(kuò)增和比對的。此外，在蘭花分類學(xué)研究中，ycf1具有類似或僅低于細(xì)胞核核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）的高度變異性，比matK有更優(yōu)異的分辨率。

榛屬植物約有20種，分布在北美洲、歐洲和亞洲；其中，我國有7種及3個變種，主要在東北、華北、西北和西南地區(qū)[12]。該屬植物的種子含油量大，在東北、華北地區(qū)當(dāng)作油料；堅果可食用，為北方地區(qū)常見干果。喬木樹種木質(zhì)硬，用于家具制作及建筑業(yè)。二代測序技術(shù)的應(yīng)用加快了榛屬葉綠體全基因組研究，榛屬葉綠體全基因組的發(fā)表[13]為榛屬植物葉綠體基因奠定了生物信息學(xué)分析與鑒定的基礎(chǔ)。

本研究充分利用榛子葉綠體基因組數(shù)據(jù)庫，以榛屬ycf1基因家族成員為研究對象，著重分析其基因結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)的結(jié)構(gòu)特征和編碼區(qū)的保守結(jié)構(gòu)域，并與擬南芥及相鄰的鐵木屬經(jīng)過多重序列比對進(jìn)行進(jìn)化和分類分析，旨在為克隆榛子ycf1基因及進(jìn)一步探索YCF1蛋白的功能奠定堅實的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 榛屬ycf1基因組、cDNA和蛋白序列的來源

榛屬、鐵木屬及擬南芥的ycf1基因及蛋白序列分別下載自 NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）和 TAIR 數(shù)據(jù)庫（http://www.arabidopsis.org）。利用NCBI的Blast P檢索及CDS軟件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）預(yù)測所選蛋白有無YCF1結(jié)構(gòu)域，判斷其是否屬于該基因家族。

1.2 榛屬ycf1基因家族結(jié)構(gòu)分析

利用數(shù)據(jù)庫，獲取榛屬中ycf1基因家族成員的基因注釋。

1.3 榛屬ycf1基因家族二級結(jié)構(gòu)及跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)的預(yù)測

ycf1基因家族各成員所編碼蛋白質(zhì)氨基酸的相似性分析[14]、α-螺旋、β-折疊及無規(guī)則卷曲等二級結(jié)構(gòu)分析[15]、跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)[16]分析等分別采用Clustal Omega（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/），SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和 TMHMMServer v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）等軟件。

1.4 榛屬ycf1基因家族的保守結(jié)構(gòu)域分析

利用軟件 MEME（http：//meme-suite.org/）分析擬南芥、鐵木屬和榛屬ycf1基因蛋白的保守結(jié)構(gòu)域[17]。

1.5 榛屬ycf1基因蛋白三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

榛屬和鐵木屬YCF1蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)模型的同源建模[18]由三級結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件 Swiss-Model（https：//swissmodel.expasy.org/）的自動建模功能完成。

1.6 榛屬ycf1基因蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

擬南芥、鐵木屬和榛屬的ycf1基因蛋白序列的比對利用Clustal X（2.0）[19]軟件進(jìn)行；將比對結(jié)果用MEGA 6.0[20]軟件采用Neighborjoining法（bootstrap值設(shè)定為1 000）產(chǎn)生系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 榛屬ycf1基因家族成員的評價

利用NCBI數(shù)據(jù)庫提供的Blast程序進(jìn)行Blast P檢索（圖1），得到3個榛屬ycf1基因和1個鐵木屬ycf1基因。用保守域預(yù)測軟件CDS驗證了ycf1基因保守結(jié)構(gòu)域的存在，初步確定榛屬中3個ycf1基因分別來自華榛、平榛、歐榛；另外，在同科相鄰的鐵木屬的天目鐵木中也確定了1個ycf1基因作為對比研究基因，即：YP009331532.1（華榛），AOZ20414.2（歐榛），YP009318292.1（平榛），YP009179114.1（天目鐵木）。這幾個基因均沒有內(nèi)含子。

2.2 榛屬ycf1基因家族的結(jié)構(gòu)分析

表1 YCF1蛋白氨基酸相似性分析%

ycf1基因家族各成員編碼蛋白質(zhì)氨基酸的相似性分析結(jié)果表明，歐榛YCF1蛋白和華榛YCF1蛋白之間的相似性最高，達(dá)99.74%；歐榛YCF1蛋白和天目鐵木YCF1蛋白之間的相似性最低，為97.00%（表1）。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析結(jié)果表明，榛屬YCF1蛋白中 α-螺旋的比例最高（34.90%～35.89%），其次為無規(guī)則卷曲（29.91%～30.25%），再次為β-折疊（25.29%～26.15%），β-轉(zhuǎn)角最低（8.73%～9.04%）（表2）。榛屬YCF1蛋白的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，榛屬及鐵木屬YCF1蛋白均含有跨膜區(qū)（圖2）。

表2 榛屬及天目鐵木YCF1蛋白的二級結(jié)構(gòu)信息 %

利用保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測軟件MEME分析了擬南芥、鐵木屬和榛屬ycf1基因家族的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示，擬南芥、榛屬和鐵木屬ycf1基因家族包含3個保守結(jié)構(gòu)域。其中，基序1的相似度為2.0e-625；基序2和基序3的相似度分別為3.7e-276和4.5e-343（圖3）。除了擬南芥ycf1基因At1YCF1，無論在樺木科的榛屬和鐵木屬中，還是在十字花科的擬南芥中，ycf1基因家族均含有3個結(jié)構(gòu)域（圖3）。

本研究通過Swiss-Model對榛屬及鐵木屬YCF1蛋白進(jìn)行同源建模，只發(fā)現(xiàn)有5%的序列能與已知模板匹配，即只與轉(zhuǎn)運蛋白AcrB的一個亞基同源。從圖4可以看出，Swiss-Model預(yù)測的榛屬及鐵木屬YCF1蛋白亞基三級結(jié)構(gòu)的空間結(jié)構(gòu)非常相似，暗示不同樺木科YCF1蛋白在生物學(xué)功能上存在相似性。

2.3 榛屬YCF1家族蛋白質(zhì)相似性和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用軟件MEGA 6.0對8個擬南芥YCF1蛋白、4個榛屬及鐵木屬YCF1蛋白的序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果表明，這12個YCF1蛋白序列基本按照物種聚類。YCF1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹大致上按照科別進(jìn)行聚類，推測YCF1蛋白在樺木科和十字花科中生物學(xué)功能不盡相同。華榛YCF1（YP009331532.1）與歐榛 YCF1（AOZ20414.2）聚類在一起，暗示華榛YCF1可能具有與歐榛YCF1相似的進(jìn)化過程和生物學(xué)功能（圖4）。YCF1蛋白在樺木科的進(jìn)化并沒有完全按照屬聚類在一起，相對于平榛，天目鐵木的YCF1蛋白與歐榛及華榛的關(guān)系更近（圖 5）。

3 討論

YCF1具體編碼的蛋白質(zhì)名稱和功能仍在探索中。作為葉綠體基因組中2個最大的開放閱讀框架之一，ycf1常被認(rèn)為是失去功能的假基因[21-23]。然而，YCF1的敲除試驗顯示，YCF1是細(xì)胞存活所必需的[24]。楊小飛等[25]研究發(fā)現(xiàn)，核基因組編碼的RNA結(jié)合蛋白PBR1，通過調(diào)控擬南芥YCF1在葉綠體中的翻譯效率，進(jìn)而調(diào)節(jié)3個光合作用復(fù)合體的協(xié)同生成及穩(wěn)定性的維持。目前，榛屬ycf1基因家族具體功能尚未鑒定。本研究通過生物信息學(xué)鑒定榛屬ycf1基因家族3個基因均含有跨膜區(qū)，均含有3個結(jié)構(gòu)域，表明榛屬中不同種間ycf1基因家族中重要結(jié)構(gòu)域存在高度保守性。另外，除了擬南芥ycf1基因編碼蛋白At1YCF1，無論在樺木科的榛屬和鐵木屬中,還是在十字花科的擬南芥中,ycf1基因家族均含有3個結(jié)構(gòu)域。推測YCF1的3個結(jié)構(gòu)域在植物諸多生理過程中發(fā)揮相似的作用。

進(jìn)化分析結(jié)果表明，華榛YCF1（YP009331532.1）與歐榛YCF1（AOZ20414.2）聚類在一起，暗示他們可能具有相似的進(jìn)化過程和生物學(xué)功能；YCF1蛋白在樺木科的進(jìn)化并沒有完全按照屬聚類在一起，相對于平榛，天目鐵木的YCF1蛋白與歐榛及華榛的關(guān)系更近?；虻倪M(jìn)化并非完全與種屬分類進(jìn)化一致，同樣的情況出現(xiàn)在蘭花磷酸肌醇特異性磷脂酶C基因家族的進(jìn)化中[26]。由此可見，榛屬YCF1各成員的生物學(xué)功能還需要進(jìn)一步分析研究。

4 結(jié)論

榛屬植物葉綠體基因組中ycf1家族基因，均不含有內(nèi)含子。榛屬YCF1蛋白均含跨膜區(qū)和3個高度保守結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化分析結(jié)果表明，華榛ycf1與歐榛ycf1可能具有相似的進(jìn)化過程和生物學(xué)功能。