王一，劉丹丹，向勇平，劉理金，姜偉，李錦毅

(武警總醫(yī)院 1.臨床教研室，2.醫(yī)學(xué)實驗中心，北京 100039)

ALDH1屬于乙醛脫氫酶(ALDH)家族，是催化細胞內(nèi)乙醛氧化為乙酸、視黃醇氧化為視黃酸的細胞溶質(zhì)酶[1]。ALDH1是19種ALDH同型異構(gòu)體中較重要的1個亞型。腫瘤干細胞(cancer stem cell,CSC)是腫瘤中一小部分具有自我更新和分化潛能的細胞，具備干細胞和腫瘤細胞的特征[2]，腫瘤干細胞在急性髓性白血病中首次被發(fā)現(xiàn)[3]，之后在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、結(jié)腸癌、前列腺癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、胃癌等腫瘤中發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞存在[4]。ALDH1高表達是CSC及正常干細胞的共同特征，2007年，GINESTIER等[5]首次利用ALDH1在乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)乳腺癌干細胞，之后ALDH1也被證明在其他實體瘤，如肺癌[6]、頭頸部腫瘤[7]、膀胱癌[8]、卵巢癌[9]、結(jié)腸癌[10]中可用于腫瘤干細胞的分離和鑒定。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設(shè)備

細胞系:MGC-803和MKN-45由中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細胞中心提供，BGC-823由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。實驗動物:BALB/c-nu小鼠，雌性，4周齡，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所。主要試劑:DMEM、RPMI 1640、DMEM/F12培養(yǎng)基、N2、B27購自美國Gibco公司，重組人表皮細胞生長因子(recombinant human epidermal growth factor,EGF)、重組人堿性成纖維生長因子(recombinant human basic fibroblast growth factor,bFGF)購自美國Peprotech公司，胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司，胰酶、四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國Amresco公司，青霉素、鏈霉素購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，二甲基亞砜(DMSO)、氟尿嘧啶購自美國Sigma公司，結(jié)晶紫購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Aldefluor試劑盒購自加拿大Stem Cell公司，普通和倒置光學(xué)顯微鏡(日本Nicon公司)，酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Bio-Rad公司)，流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及ALDH1表達檢測 MGC-803用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，BGC-823和MKN-45用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，以上細胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。MGC-803和BGC-823用0.25%胰酶消化傳代，MKN-45用0.05%胰酶加0.02% EDTA消化傳代。分選后的ALDH1+、ALDH1-細胞用無血清培養(yǎng)液(含0.5% N2、1% B27、20 ng/ml EGF及10 ng/ml bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基)，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

選取對數(shù)生長期細胞，制備濃度為1×106個/ml單細胞懸液，實驗組加入活化的Aldefluor試劑5 μl/ml，ALDH能將BAAA轉(zhuǎn)化為綠色發(fā)光物BAA，通過專用通道分選帶綠色熒光BAA細胞[11]；對照組加入特殊抑制劑DEAB 50 μl/ml，DEAB能抑制ALDH把BAAA轉(zhuǎn)化為BAA，作為陰性對照。反應(yīng)30 min。1 000 r/min離心5 min，棄上清液，Aldefluor緩沖液重懸，上機檢測，檢測前加碘化丙啶(PI)染色標記死亡細胞。

1.2.2 ALDH1+細胞分化(不對稱分裂)能力檢測MGC-803及分選得到ALDH1+細胞和ALDH1-細胞，以5×104個/ml接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1周后流式細胞儀檢測ALDH1+所占比例情況。

1.2.3 平板克隆實驗 ALDH1+和ALDH1-細胞分別以200個細胞/孔接種于6孔板，用無血清培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10～14 d，至細胞克隆超過50個細胞時結(jié)束培養(yǎng)，100%甲醇室溫固定，結(jié)晶紫室溫染色后流水沖洗染料，計數(shù)每孔克隆形成數(shù)。克隆形成率=每孔克隆形成數(shù)/每孔接種細胞數(shù)×100%。

1.2.4 耐藥實驗 分選獲得的ALDH1+及ALDH1-細胞分為兩組，兩組分別以3×103個細胞/孔接種于96孔板，無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后分別加入1 μg/ml、2、5、15和25 μg/ml的氟尿嘧啶，每個濃度設(shè)3～5個復(fù)孔，以不加藥物的復(fù)孔為對照組，培養(yǎng)24 h后，MTT法檢測各組OD值，以只加DMSO孔為調(diào)零孔。細胞生長抑制率=[1-(實驗組平均OD值-調(diào)零孔OD值)/(對照組平均OD值-調(diào)零孔OD值)]×100%。

1.2.5 致瘤實驗 ALDH1+及ALDH1-細胞，懸浮于PBS緩沖液與基質(zhì)膠(1:1)混合液中，5×103細胞數(shù)量級的ALDH1+細胞及ALDH1-細胞皮下接種于BALB/c-nu小鼠，每組4只小鼠。觀察出瘤情況，測量瘤體長短徑，記錄瘤體出現(xiàn)時間及個數(shù)。待瘤體直徑超過1 cm時處死小鼠，取出瘤體測量體積，瘤體體積=1/2長徑×短徑×短徑。取腫瘤組織進行病理學(xué)檢查。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，采用方差分析，組間比較用t檢驗，計數(shù)資料以頻數(shù)(%)表示，率的比較用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細胞系A(chǔ)LDH1+表達

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，胃癌細胞系MGC-803、BGC-823、MKN-45中ALDH1+表達比例為(13.00±1.34)%、(5.80±2.15)%及(36.5±5.4)%，見圖1。

2.2 ALDH1+細胞不對稱分裂能力

MGC-803細胞ALDH1+表達率為11.5%，分選出的ALDH1+、ALDH1-細胞培養(yǎng)1周后，ALDH1+表達率分別為21.2%和3.9%。ALDH1+細胞組培養(yǎng)后ALDH1+表達率下降至21.2%，表明ALDH1+細胞在生長過程中，通過不對稱分裂分化ALDH1-細胞，形成異質(zhì)性。ALDH1-細胞組也檢測ALDH1+表達，可能是由于細胞的不均一性、培養(yǎng)條件和處于不同細胞周期等因素，所以ALDH1不可能一次就把所有干細胞都標記出來，分選后的細胞再次檢測依然會有陽性細胞。見圖2。

2.3 ALDH1+細胞體外克隆形成能力

平板克隆實驗結(jié)果見圖3，ALDH1+組克隆形成率為(42.63±0.63)%，ALDH1-組克隆形成率為(18.50±2.04)%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=33.597，P =0.000)。培養(yǎng)14 d后，ALDH1+組克隆形成數(shù)比ALDH1-組多；染色前分別在顯微鏡下觀察到的ALDH1+和ALDH1-組的克隆球，ALDH1+組克隆球大于ALDH1-組，且前者的克隆球內(nèi)細胞排列緊密，中心處尤為突出，后者細胞間排列疏松。見圖4。

圖1 胃癌細胞系A(chǔ)LDH1+活性表達

2.4 ALDH1+細胞耐藥性

檢測氟尿嘧啶對ALDH1+及ALDH1-細胞的生長抑制率，以生長抑制率反應(yīng)細胞對藥物的耐受性，即生長抑制率越低耐藥性越強。氟尿嘧啶作用細胞，每種藥物濃度下ALDH1+組與ALDH1-組，1 μg/ml:(6.12±4.19)% vs(14.74±7.51)%、2 μg/ml(16.4±2.89)% vs(34.95±9.7)%、5 μg/ml:(30.06±6.96)% vs(48.57±5.8)%、15 μg/ml:(48.25±4.35)% vs(60.15±9.45)%、25 μg/ml:(56.81±16.39)% vs(70.18±12.4)%，ALDH1+組生長抑制率均低于ALDH1-組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見圖5。

圖2 MGC-803及ALDH1+、ALDH1-細胞培養(yǎng)后ALDH1+表達比例

圖3 ALDH1+組及ALDH1-組克隆形成率

2.5 ALDH1+細胞致瘤能力

圖4 平板克隆形成及克隆形態(tài)

致瘤實驗結(jié)果見附表，接種5×103細胞，第10天ALDH1+組全部致瘤，致瘤率為100%，ALDH1-組致瘤率為25%，至實驗結(jié)束時的致瘤率為50%；見圖6。5×103ALDH1+細胞組腫瘤體積為(112.90±72.20)mm3，與ALDH1-細胞組(20.80±26.70)mm3比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。腫瘤經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院病理科鑒定為腫瘤組織，見圖7。

圖5 兩組生長抑制率比較

附表 接種5×103個細胞數(shù)ALDH1+組和ALDH1-組小鼠成瘤數(shù)

圖6 實驗結(jié)束時瘤塊

3 討論

CSC被認為是腫瘤發(fā)生、演變、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的“種子”，大量研究證實CSC與放化療耐受及患者預(yù)后差密切相關(guān)[12-13]。因此能否精確分離出腫瘤干細胞，用于腫瘤診斷和靶向治療成為研究的熱點和難點。目前常用腫瘤干細胞表面標志物來分離CSC，分為表面標志物和功能性標志物[14-15]，如胃癌干細胞表面標志物有CD44[16]、CD133[17]、OCT4等[18]。本實驗驗證ALDH1在胃癌細胞中的表達及是否可作為胃癌干細胞標志物。

本實驗檢測到胃癌細胞系MGC-803、BGC-823及MKN-45中有ALDH1+的活性表達。選取BGC-823分選出ALDH1+和ALDH1-細胞進行生物學(xué)特性觀察。由ALDH1+組和ALDH1-組細胞含血清培養(yǎng)1周后ALDH1+的活性表達比例發(fā)現(xiàn)，ALDH1+組中ALDH1+細胞分化出ALDH1-細胞，分裂后的細胞中ALDH1+表達比例接近BGC-823親本細胞。說明ALDH1+細胞具有不對稱分裂能力。ALDH1-組細胞培養(yǎng)后也出現(xiàn)小部分ALDH1+細胞?？紤]是由于細胞的不均一性、培養(yǎng)條件或處于不同細胞周期等因素，所以ALDH1不能一次就把ALDH1+細胞分選徹底。平板克隆實驗結(jié)果表明ALDH1+細胞體外克隆能力強于ALDH1-細胞，表現(xiàn)出更強的自我更新能力。對化療藥物的耐藥性是腫瘤干細胞的另一生物學(xué)特性，本實驗通過經(jīng)典化療藥氟尿嘧啶來體現(xiàn)對細胞的生長抑制率，不同藥物濃度下，ALDH1+組生長抑制率均低于ALDH1-組，表明ALDH1+細胞的耐藥性強于ALDH1-細胞。體外成瘤實驗是驗證腫瘤干細胞的金標準[2]。結(jié)果顯示與ALDH1-細胞比較，ALDH1+細胞致瘤率高、出瘤時間早、瘤體大、生長速度快。

從分化潛能、克隆形成能力、耐藥性及致瘤能力方面證實胃癌細胞系中ALDH1+細胞具有干細胞特性，可將ALDH1作為分選胃癌干細胞的標志物。研究發(fā)現(xiàn)[12]，腫瘤干細胞在腫瘤中占一小部分，僅占0.1%～1.0%。實驗中3種胃癌細胞系A(chǔ)LDH1+表達均不低，尤其MKN-45。說明ALDH1作為標志物的特異性不強，可能存在與胃癌細胞共表達。提示需要對ALDH1+細胞進一步研究。本實驗表明，ALDH1+在胃癌細胞中的表達及ALDH1+細胞的干細胞樣特性。對胃癌干細胞的分選及基礎(chǔ)研究有重大意義，對胃癌的診斷及靶向治療提供新的思路和理論基礎(chǔ)。