楊光，鄭如意，董程驥，陳夢茜，金在順

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江157011；2.江蘇省徐州市礦山醫(yī)院，江蘇 徐州221006)

套細胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma,MCL)是非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin lymphoma,NHL)中的一種亞型，約占全部NHL的6%[1]。免疫表型為成熟的B細胞表型，即細胞表面表達有大量的CD20和CD5抗原[2-3]。由于其惡性程度高、侵襲速度快[4]，因此MCL的早期診斷及早期治療成為延長生存期的關(guān)鍵。

上轉(zhuǎn)換納米顆粒(upconversion nanoparticles,UCNPs)作為一種新型的熒光標志物，具有上轉(zhuǎn)換功能強大、檢測敏感性高[5-7]、化學(xué)穩(wěn)定性好以及細胞毒性很低等[8]一系列優(yōu)點，在980 nm近紅外光(near infrared,NIR)激發(fā)下將釋放出明亮的上轉(zhuǎn)換熒光(upconversion fluorescence,UCL)?；诳乖?、抗體之間的特異性免疫反應(yīng)原理，本研究將采用UCNPs與相應(yīng)抗體偶聯(lián)的方法，使該粒子具有靶向性，進而對MCL細胞株進行靶向成像?，F(xiàn)將對UCNPs在MCL細胞靶向成像中的應(yīng)用進行探討。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑 NaYF4:Er3+和NaYF4:Yb3+，Tm3+納米顆粒由牡丹江醫(yī)學(xué)院電鏡室提供，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)購自北京亞太恒信生物科技有限公司，2-嗎啉乙磺酸(2-morpholinoethanesulfonic acid,MES,99%)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸酸[1-(3-dimethy laminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC·HCl,98%]、N-羥基硫代琥珀酰亞胺(N-Hydroxysuccinimide,NHS,98%)購自上海阿拉丁試劑公司，RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自美國Gibco公司，雙氧水(H2O2，30%)購自遼寧泉瑞試劑有限公司，CD20(Clone:2H7)和CD5(Clone:UCHT2)單克隆抗體購自美國BD生物科技公司，Jeko-1細胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。

1.1.2 儀器 Night OWL小動物活體成像系統(tǒng)購自德國Berthold公司，Eclipse Ti-S倒置熒光顯微鏡購自日本尼康公司，傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀(fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)購自美國Thermo Fisher Scientific公司，WG1233B3-980 nm半導(dǎo)體激光系統(tǒng)購自北京艾納捷光電科技有限公司，超聲波細胞破碎儀購自寧波新芝生物科技股份有限公司，溫控磁力攪拌器購自常州普天儀器制造有限公司，CO2培養(yǎng)箱、離心機和微量移液槍均購自美國Thermo公司，Statspin Cytofuge 12細胞甩片機購自北京自然基因科技有限公司。

1.2 納米顆粒疏水性向親水性的轉(zhuǎn)化

雙氧水作為一種強氧化劑，對納米顆粒表面油酸鹽配體碳碳雙鍵進行直接氧化。通過該方法可將有疏水特性的納米顆粒轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性。將0.1 g預(yù)先制備好的NaYF4:Yb3+，Tm3+納米顆粒和8 ml的H2O2混勻，在室溫下磁力攪拌1 h。氧化結(jié)束后，通過離心棄除上清液。氧化后的沉淀加入去離子水在超聲波細胞破碎儀下充分粉碎洗滌，之后離心，最后將沉淀在70℃恒溫箱中干燥24 h。使用同樣的方法NaYF4:Er3+納米粒子也由最初的親水性轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷浴?/p>

1.3 氧化后的納米顆粒與CD20/CD5抗體偶聯(lián)

取氧化后的NaYF4:Yb3+，Tm3+納米顆粒0.05 g，向其中加入MES并將混合液在超聲波細胞破碎儀的作用下充分粉碎5 min。超聲降解粉碎機功率為600 W。在轉(zhuǎn)速4 000 r/min的條件下離心，棄除上清液。然后向沉淀中加14 ml MES、0.005 g EDC、0.015 g NHS在室溫下磁力攪拌2 h。磁力攪拌結(jié)束后，將混合液離心、去除上清液。再向沉淀中加入PBS在超聲波細胞粉碎機作用下充分粉碎洗滌2次，離心、去上清液并向沉淀中加5 ml PBS和50 μl CD5單克隆抗體(1:100稀釋)，將其放在搖床上振蕩2 h。最后將加入抗體的混合液放在4℃冰箱保存?zhèn)溆?。即連接有CD5抗體的NaYF4:Yb3+，Tm3+納米粒子成功制備。使用同樣的方法，偶聯(lián)有CD20單克隆抗體的NaYF4:Er3+納米探針也成功制備。

1.4 UCNPs上轉(zhuǎn)換性能檢測及傅里葉波譜分析

取適量偶聯(lián)有相應(yīng)抗體的UCNPs懸液，使用配備有980 nm近紅外激光的Night OWL小動物活體成像系統(tǒng)對其進行成像。激發(fā)功率分別為0、0.7和1.0 W，以此來驗證UCNPs的發(fā)光性能。取僅僅氧化后的，與NHS、EDC反應(yīng)后的以及與相應(yīng)抗體偶聯(lián)后的UCNPs，使用FT-IR對其進行波譜分析，以此間接驗證該粒子最終是否已被成功的生物功能化以及是否已與相應(yīng)的抗體成功偶聯(lián)。

1.5 UCNPs細胞毒性檢測

吸取200 μl Jeko-1細胞懸液(細胞數(shù):6.3×105個)接種到24孔培養(yǎng)板內(nèi)，共接種15個孔。其中實驗組12個孔，對照組3個孔。然后向15個培養(yǎng)孔內(nèi)分別加800 μl含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。實驗組中的12個培養(yǎng)孔每4個孔為一組，共分為3組。每組分別滴加20、40、80、160 μl UCNPs懸液。將24孔培養(yǎng)板在37℃、CO2濃度為5% 的條件下分別培養(yǎng)24、48和72 h。在不同的時間點使用臺盼藍對細胞進行染色并利用血球計數(shù)板進行活細胞計數(shù)。通過以下公式計算細胞活性進而評估UCNPs的細胞毒性:細胞活性(%)=(實驗組活細胞數(shù)/對照組活細胞數(shù))×100%。

1.6 細胞培養(yǎng)和成像

細胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度為37℃、CO2濃度為5%。取對數(shù)生長的細胞用于該實驗。為了使細胞均勻的分布于載玻片上，吸取Jeko-1細胞懸液100 μl(細胞數(shù):1.5×105個)加入細胞甩片機加樣孔內(nèi)，1 000 r/min離心5 min，使細胞均勻分布于載玻片。丙酮固定細胞后，向Jeko-1細胞所在區(qū)域滴加CD20抗體NaYF4:Er3+納米探針懸液和CD5抗體NaYF4:Yb3+，Tm3+納米探針懸液的混合液300 μl，室溫下濕盒內(nèi)孵育2 h。在對照實驗中，向Jeko-1細胞所在區(qū)域滴加NaYF4:Er3+納米探針懸液和CD5抗體NaYF4:Yb3+，Tm3+納米探針懸液的混合液300 μl；向Jeko-1細胞所在區(qū)域滴加CD20抗體NaYF4:Er3+納米探針懸液和NaYF4:Yb3+，Tm3+納米探針懸液的混合液300 μl；向Jeko-1細胞所在區(qū)域滴加NaYF4:Er3+納米探針懸液和NaYF4:Yb3+，Tm3+納米探針懸液的混合液300 μl，在同樣的條件下進行孵育。孵育結(jié)束后用PBS充分洗滌3次，徹底去除多余的、沒有和細胞結(jié)合的納米探針，使用配備有980 nm近紅外激光的尼康Eclipse Ti-S倒置熒光顯微鏡進行細胞成像。

2 結(jié)果

2.1 UCNPs細胞毒性及上轉(zhuǎn)換性能

為了探究UCNPs的細胞毒性，使用臺盼藍對Jeko-1細胞染色的方法來確定不同量的UCNPs與細胞培養(yǎng)不同時間后其對細胞生長所產(chǎn)生的影響。設(shè)定UCNPs探針懸液體積梯度，即20、40、80和160 μl，在同樣的生理條件下分別與Jeko-1細胞培養(yǎng)24、48和72 h，然后進行臺盼藍染色、活細胞計數(shù)，并計算細胞活性。由圖1A可見，隨著UCNPs探針懸液體積的增加以及UCNPs探針與細胞孵育時間的延長，各組細胞的細胞活性幾乎均處于90%以上，并未發(fā)生明顯的降低。同時，將臺盼藍溶液與細胞懸液按1:1的比例混勻，然后將混合液加入血球計數(shù)板內(nèi)，通過倒置顯微鏡直觀的觀察活細胞的比例。由于已經(jīng)死亡的細胞可以被臺盼藍染為深藍色，見圖1B可見，可以看出血球計數(shù)板內(nèi)死細胞數(shù)是非常的少，而透亮的活細胞則占較高比例。此外，為進一步明確UCNPs的上轉(zhuǎn)換性能的高效性，吸取少量偶聯(lián)有相應(yīng)抗體的UCNPs懸液，通過使用小動物活體成像系統(tǒng)對粒子探針的上轉(zhuǎn)換發(fā)光性能進行檢測。由圖2可見，在未給予近紅外光激發(fā)的情況下，UCNPs并未產(chǎn)生UCL。然而當近紅外光的激發(fā)功率達到0.7 W時，UCNPs探針懸液卻釋放出明亮的UCL。并且通過肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，隨著近紅外光激發(fā)功率的增加(P=1 W)，該探針所產(chǎn)生的UCL的強度也隨之增強。

圖1 UCNPs細胞毒性檢測結(jié)果

圖2 UCNPs懸液的上轉(zhuǎn)換成像

2.2 UCNPs的表面氧化及生物功能化

由于最初的UCNPs表面被油酸所包覆，因而其表現(xiàn)為疏水特性。為了使其具有水溶性，使用H2O2對粒子表面油酸配體上的碳碳雙鍵(R-HC=CH-R’)進行氧化，以此形成帶有更多羧基(-COOH)的壬二酸。為了確定UCNPs是否已與單克隆抗體成功偶聯(lián)，采用一種間接的檢測方法對其進行驗證，即使用傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀(FT-IR)對粒子進行波譜分析檢測。見圖3，a、b、c分別代表僅僅氧化后UCNPs、與NHS、EDC反應(yīng)的UCNPs和與單克隆抗體反應(yīng)后的UCNPs的波譜?？梢钥闯霾〝?shù)在2 849 cm-1和2 926 cm-1處，a、b、c所代表的3種經(jīng)過不同處理的粒子的吸收峰強度逐漸下降。

圖3 UCNPs的FT-IR波譜分析結(jié)果

2.3 細胞免疫標志和成像

在這項研究中，由于細胞表面的抗原與UCNPs上偶聯(lián)的單克隆抗體之間發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)，Jeko-1細胞得以被特異性的識別標志?？贵w的羧基基團和納米粒子表面的氨基基團在NHS和EDC的輔助下將發(fā)生冷凝反應(yīng)[9]，進而UCNPs與單克隆抗體發(fā)生共價交聯(lián)，見圖4。因此根據(jù)以上原理，氧化后的NaYF4:Yb3+，Tm3+納米顆粒與CD5抗體發(fā)生交聯(lián)進而牢固連接形成CD5抗體-UCNPs軛合物，同樣CD20抗體通過該方法與NaYF4:Er3+納米粒子共價結(jié)合形成CD20抗體-UCNPs軛合物?；贘eko-1細胞表面表達大量CD20和CD5抗原，以及細胞表面的抗原與納米顆粒上的抗體之間發(fā)生的特異性免疫反應(yīng)，Jeko-1細胞能夠被NaYF4:Yb3+，Tm3+UCNPs和NaYF4:Er3+UCNPs特異性標志。

為了通過細胞實驗來證實功能化后的UCNPs可以對Jeko-1細胞進行免疫標志，將Jeko-1細胞與UCNPs-CD20抗體軛合物和UCNPs-CD5抗體軛合物的混合液室溫孵育2 h，再使用PBS對細胞充分清洗以除去未與細胞結(jié)合的殘存粒子。然后使用配備有980 nm近紅外激光的共聚焦顯微鏡對細胞進行上轉(zhuǎn)換成像，激發(fā)功率為1.5 W，曝光時間為2 s。由圖5可見，將明場像和暗場像進行重疊，細胞的形狀和位置并未發(fā)生任何改變。在×20物鏡下發(fā)現(xiàn)該細胞表面釋放明亮的藍、綠雙色UCL，且釋放雙色熒光的UCNPs在細胞表面分布的部分區(qū)域并未發(fā)生重疊，同時在細胞外區(qū)域也未見殘存的發(fā)光粒子，這意味著UCNPs的確僅僅分布于細胞上。

圖4 細胞的免疫標志

圖5 Jeko-1細胞與NaYF4:Er3+-CD20抗體和NaYF4:Yb3+，Tm3+-CD5抗體共同孵育后上轉(zhuǎn)換熒光圖像 (20 μm)

進一步驗證是否細胞與UCNPs之間的連接是基于抗原/抗體介導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)。在同樣的孵育條件下，將Jeko-1細胞與NaYF4:Er3+納米探針懸液和CD5抗體NaYF4:Yb3+，Tm3+納米探針懸液的混合液共同孵育。在UCNPs未與CD20抗體偶聯(lián)的情況下與Jeko-1細胞共同孵育后，細胞表面僅可見NaYF4:Yb3+，Tm3+釋放明亮的藍色UCL，而未見NaYF4:Er3+所釋放的綠色熒光(見圖6)。此外，將Jeko-1細胞與CD20抗體NaYF4:Er3+納米探針懸液和NaYF4:Yb3+，Tm3+納米探針懸液的混合液共同孵育，一定時間后進行UCL成像。UCNPs在未與CD5抗體偶聯(lián)的情況下與Jeko-1細胞共同孵育后，細胞表面僅可見NaYF4:Er3+釋放的明亮的綠色UCL，而未見NaYF4:Yb3+，Tm3+釋放的藍色UCL(見圖7)。最后將Jeko-1細胞與未偶聯(lián)任何抗體的NaYF4:Er3+納米探針懸液和NaYF4:Yb3+，Tm3+納米探針懸液的混合液共同孵育，然后進行上轉(zhuǎn)換成像。由于UCNPs懸液中未添加任何抗體，Jeko-1細胞表面并未釋放出藍、綠雙色UCL(見圖8)。

圖6 Jeko-1細胞與NaYF4:Er3+和NaYF4:Yb3+，Tm3+-CD5抗體共同孵育后上轉(zhuǎn)換成像

圖7 Jeko-1細胞與NaYF4:Er3+-CD20抗體和NaYF4:Yb3+，Tm3+共同孵育后上轉(zhuǎn)換成像

圖8 Jeko-1細胞與NaYF4:Er3+和NaYF4:Yb3+，Tm3+共同孵育后上轉(zhuǎn)換成像 (20μm)

3 討論

UCNPs在一定量的范圍內(nèi)無毒性，對細胞的生長并未產(chǎn)生抑制作用，同時也不會導(dǎo)致細胞死亡。該粒子具有強大的上轉(zhuǎn)換性能，即使激光的功率非常低依然能夠高效的將低能量的近紅外光轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣芰康目梢姽?，在將來極有可能成為一種非常理想的生物探針應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)成像。通過FT-IR波譜分析，在波數(shù)2 849 cm-1和2 926 cm-1處a、b、c波譜顯示UCNPs的吸收峰強度逐漸降低，間接證明氧化后UCNPs與NHS、EDC成功連接以及與單克隆抗體成功偶聯(lián)。雙氧水對UCNPs表面的氧化處理以及NHS、EDC與UCNPs的成功結(jié)合為UCNPs與單克隆抗體的成功偶聯(lián)奠定基礎(chǔ)，最終UCNPs與單克隆抗體共價結(jié)合，具有靶向性的UCNPs得以被成功制備。在UCNPs偶聯(lián)有CD20和CD5單克隆抗體的情況下，UCNPs與Jeko-1細胞孵育一定時間后進行上轉(zhuǎn)換成像，細胞表面釋放出明亮的雙色UCL，這說明細胞表面已標記有大量的上轉(zhuǎn)換納米粒子，CD5抗體-UCNPs軛合物和CD20抗體-UCNPs軛合物能夠和Jeko-1細胞表面相結(jié)合。而UCNPs未與某種抗體偶聯(lián)直接與Jeko-1細胞孵育，細胞表面則并未釋放出相應(yīng)的UCL，這意味著細胞與UCNPs的成功結(jié)合與UCNPs是否與相應(yīng)的抗體成功偶聯(lián)有著必然的聯(lián)系，細胞之所以被UCNPs所標記是由于細胞表面的抗原和UCNPs上已偶聯(lián)的抗體之間發(fā)生的特異性免疫反應(yīng)所致，偶聯(lián)有相應(yīng)抗體的UCNPs能夠?qū)CL細胞株進行靶向標記。

目前，用于淋巴瘤細胞株靶向成像的方式主要有細胞免疫熒光技術(shù)、量子點靶向標志技術(shù)、納米粒子靶向標志技術(shù)、放射免疫示蹤法等。細胞免疫熒光技術(shù)是最為常用且較為成熟的一種細胞靶向標志技術(shù)，同樣是根據(jù)抗原/抗體之間的特異性免疫反應(yīng)，細胞被特定的熒光素所標志。然而，由于熒光素具有較高的光漂白性[10]，易發(fā)生熒光淬滅，因此該技術(shù)對實驗條件要求較為苛刻，自加熒光二抗起所有的步驟必須在避光、黑暗的環(huán)境中進行，實驗結(jié)束后需盡快在熒光顯微鏡下觀察，以防熒光淬滅影響觀察效果。量子點雖然已經(jīng)成功的克服以上缺點，但是其固有毒性和化學(xué)不穩(wěn)定性卻引起人們的廣泛關(guān)注[11]。放射免疫示蹤法也已被研究應(yīng)用于細胞的靶向標志，其具有檢測敏感性高、特異性強、簡便易行等優(yōu)點[12]，然而該方法所使用的標志物為同位素示蹤物，該示蹤物具有一定的放射性，長時間接觸會對實驗人員的身體健康造成一定的輻射損傷[13]。

而UCNPs則具有獨特的光學(xué)性能，其檢測敏感性高且不具有光漂白性[14]，同時細胞對980 nm近紅外光的吸收非常低，將導(dǎo)致來自細胞的自體熒光強度較低，進而增加了圖像信噪比，極大地改善了圖像的質(zhì)量[15]?；谝陨蟽?yōu)點，在醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用方面，UCNPs有潛力替代傳統(tǒng)的熒光探針應(yīng)用于生物分子標志、細胞靶向成像和動物活體成像[16-17]。最近，有研究人員[9，18-19]已報道，上轉(zhuǎn)換納米探針在體內(nèi)和體外生物成像中的應(yīng)用進展。在以上的生物成像研究中，經(jīng)常選擇宮頸癌細胞、卵巢癌細胞、結(jié)直腸癌細胞、人口腔表皮樣癌細胞等貼壁細胞作為靶細胞進行實驗且均取得理想的實驗結(jié)果。證實在生物成像應(yīng)用中，基于上轉(zhuǎn)換納米材料的熒光探針可以被應(yīng)用于腫瘤細胞的靶向生物標志。然而關(guān)于MCL細胞株甚至其他懸浮細胞的相關(guān)報道卻并未多見。UCNPs在MCL細胞靶向成像中的應(yīng)用，為其將來應(yīng)用于小鼠體內(nèi)以及臨床病人體內(nèi)MCL病灶的靶向檢測奠定基礎(chǔ)。同時，CD20單克隆抗體又被稱之為美羅華，是一種高效的臨床化療藥物用于治療B細胞來源的淋巴瘤[20]。因此，UCNPs與CD20抗體的結(jié)合不僅僅有助于MCL的靶向檢測，同時對腫瘤病灶也起到精準治療的效果，減少對正常細胞、組織造成不必要的損傷。受此啟發(fā)，UCNPs還具有巨大的潛力應(yīng)用于其他惡性腫瘤的早期檢測、靶向定位和精準治療，對未來醫(yī)學(xué)事業(yè)的發(fā)展具有重要的指導(dǎo)意義。

綜上所述，本研究發(fā)明一種新穎的上轉(zhuǎn)換納米粒子的氧化方法，僅僅使用雙氧水對粒子表面進行氧化。與勒米厄—馮魯?shù)侣宸蛟噭┫啾?，該氧化方法步驟更加簡便、耗時更少。且該方法并未對納米粒子的形態(tài)大小、結(jié)構(gòu)、組成、上轉(zhuǎn)換發(fā)光性能產(chǎn)生不利的影響。通過體外實驗，在MCL細胞表面看到強烈、明亮的上轉(zhuǎn)換熒光信號。同時在980 nm近紅外光的激發(fā)下，并未看到腫瘤細胞產(chǎn)生的自體熒光。表面修飾功能化后的UCNPs在NHS、EDC的作用下與抗CD20/CD5抗體結(jié)合形成UCNPs-CD20/CD5抗體耦合物。UCNPs-CD20/CD5抗體耦合物作為一種高效的熒光標志物應(yīng)用于Jeko-1細胞的免疫標志和成像。通過對照實驗，本研究發(fā)現(xiàn)，UCNPs-CD20/CD5抗體耦合物具有靶向性，能夠?qū)CL細胞進行特異性標志，為以后活體內(nèi)MCL病灶的靶向檢測奠定基礎(chǔ)，同時也為以后對其他惡性腫瘤的早期診斷、靶向定位、精準治療提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。