[華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院(河北省煤礦衛(wèi)生與安全重點實驗室)，河北 唐山 063000]

異煙肼(Isoniazid,INH)是抗結(jié)核治療的一線藥物，其主要副作用是抗結(jié)核藥物性肝損傷(antituberculosis drug-induced liver injury,ADLI)[1]。目前認(rèn)為異煙肼藥物代謝引起的炎癥反應(yīng)在肝損傷發(fā)生過程中起重要作用，并可能成為ADLI防治的重要靶點[2]。

組蛋白去乙?；?histone deacetylase,HDAC)作為催化核心組蛋白和非組蛋白發(fā)生去乙?；饔玫闹匾割愇镔|(zhì)，在調(diào)控細(xì)胞生長、參與氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥基因表達(dá)等方面發(fā)揮著重要功能[3-4]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴性的Ⅲ型組蛋白去乙?；?，與細(xì)胞衰老、抗氧化應(yīng)激以及抑制炎癥等細(xì)胞多種功能活動有關(guān)[5]。近年來有研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子1(TGF-β1)在腎小球系膜細(xì)胞中發(fā)揮作用的過程中，沉默SIRT1可使TGF-β1誘導(dǎo)的纖維連接蛋白、Ⅰ型膠原和細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)及Smad3的乙?；皆黾樱患尤氚邹继J醇能夠激活SIRT1，使其與Smad3結(jié)合而增加Smad3的去乙酰化水平，進而抑制Smad3表達(dá)，減輕腎臟纖維化的發(fā)生[6]。另外，NF-kB是SIRT1的靶分子，故推測在異煙肼致肝損傷過程中由NF-kB介導(dǎo)的促炎癥反應(yīng)增強也可能與SIRT1的表達(dá)變化有關(guān)。

本研究通過異煙肼刺激人正常肝細(xì)胞，觀察在異煙肼致肝細(xì)胞損傷過程中SIRT1的表達(dá)變化，并通過加入SIRT1的激動劑和抑制劑影響SIRT1表達(dá)，觀察其對炎癥因子的影響，從而探討SIRT1在異煙肼致人肝細(xì)胞損傷中的調(diào)控作用，為ADLI的預(yù)防和結(jié)核病患者的高效保肝治療研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人正常肝細(xì)胞株HL-7702引自上海中科院細(xì)胞所，異煙肼(批號:YSMXE-OM)、二甲基亞砜(批號:W3OKK-MI)購自日本TCI公司，青霉素與鏈霉素(批號:1634678)購自德國BI公司，0.25%胰蛋白酶(批號:25200-072)購自美國Gibco公司，SIRT1激動劑SRT1720(批號:S112906)、抑制劑EX527(批號:S154103)購自美國Selleck公司，Prime ScriptTMRT Master Mix試劑盒(批號:AK4601)、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ PCR試劑盒(批號:AK4602)購自大連寶生物工程有限公司，TRI pure Reagent 總RNA抽提試劑盒(批號:0020161010)購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，ALT、AST試劑盒(批號:20170301)購自南京建成生物工程研究所，SIRT1、NF-kB p65、TNF-α ELISA檢測試劑盒(批號:201612)購自北京冬歌偉業(yè)生物技術(shù)有限公司，IL-6 ELISA檢測試劑盒(批號:210660124)購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，Heraeus高速冷凍離心機購自德國Thermo Scientific公司，CA94089型連續(xù)光譜酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices公司，C1000PCR擴增儀購自美國Bio-Rad公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRTPCR)儀購自美國Applied Biosystems公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

用含90% RPMI 1640(批號:24916002，美國CORNING公司)、10%胎牛血清(批號:JC50166，美國CLARK公司)、1%雙抗的培養(yǎng)液作為HL-7702細(xì)胞的培養(yǎng)基，將細(xì)胞放置于濃度為5%的二氧化碳、37oC的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/ml，接種到6孔板上，每孔為2 ml。接種預(yù)培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基并給予相應(yīng)處理，再次培養(yǎng)48 h后分別收集細(xì)胞及上清液。

1.3 細(xì)胞分組及干預(yù)

實驗按以下分組處理:空白對照組(1640培養(yǎng)基)、異煙肼組(含800 μg /ml異煙肼的1640培養(yǎng)基，INH)、異煙肼+SIRT1激動劑組(含800 μg/ml異煙肼和1 μmol /L SIRT1激動劑SRT1 720的1640培養(yǎng)基，INH+SRT1 720)、SIRT1激動劑對照組(含1 μmol/L SIRT1激動劑SRT1 720的1640培養(yǎng)基，SRT1 720)、異煙肼+SIRT1抑制劑組(含800 μg/ml異煙肼和1 μmol/L SIRT1抑制劑EX527的1640培養(yǎng)基，INH+EX527)、SIRT1抑制劑對照組(含1 μmol/L SIRT1抑制劑EX527的1640培養(yǎng)基，EX527)。

1.4 細(xì)胞上清液中ALT、AST含量檢測

收集細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，嚴(yán)格按照商品化的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)檢測試劑盒說明書進行操作，測定各指標(biāo)含量。

1.5 肝細(xì)胞中SIRT1、NF-kB p65 mRNA表達(dá)水平的檢測

采用qRT-PCR方法檢測肝細(xì)胞中SIRT1、NF-kB p65 mRNA表達(dá)水平。收集細(xì)胞用Trizol提取RNA，檢測并計算RNA的純度和濃度；取RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA。利用SYBR Green嵌合熒光法進行實時PCR擴增。逆轉(zhuǎn)錄、qRT-PCR技術(shù)嚴(yán)格參照試劑盒說明書進行操作。逆轉(zhuǎn)錄條件為37oC 15 min，85oC 5 s，4oC 1 min。mRNA表達(dá)水平的檢測以GAPDH為內(nèi)參，反應(yīng)條件:95oC 30 s，95oC 5 s，60oC 30 s共40個循環(huán)，熒光引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司負(fù)責(zé)設(shè)計與合成。引物序列如下:GAPDH正向引物5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3'，反向引物5'-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3'；SIRT1正向引物5'-CATAGACACGCTGGAACAGG-3'，反向引物5'-TTGAGGGAAGACCCAATAACA-3'；NF-kB p65正向引物5'-GCGAGAGGAGCACAGATAC C-3'，反向引物5'-GCACAGCATTCAGGTCGTAG-3'。采用2-ΔΔCt計算mRNA表達(dá)水平。

1.6 肝細(xì)胞中SIRT1、NF-kB p65、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平的檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測肝細(xì)胞中SIRT1、NF-kB p65、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平，嚴(yán)格參照試劑盒的說明書進行操作。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用單因素方差分析比較各組間的差異，兩兩比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞上清液中ALT和AST含量的比較

異煙肼誘導(dǎo)引起HL-7702細(xì)胞上清液ALT、AST含量增加，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q=22.490和17.330，均P=0.000)，表明異煙肼組肝細(xì)胞發(fā)生損傷。SIRT1激動劑對照組和抑制劑對照組與空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，提示激動劑和抑制劑對培養(yǎng)的人肝細(xì)胞無毒作用。異煙肼組之間比較，異煙肼+SIRT1激動劑組ALT、AST含量降低，異煙肼+SIRT1抑制劑組則進一步升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q=9.951、20.234、12.908和16.741，均P=0.000)，表明SIRT1激動劑的加入減輕異煙肼引起的肝細(xì)胞損傷而SIRT1抑制劑的加入進一步加重了肝細(xì)胞損傷的發(fā)生。見附表。

附表 各組細(xì)胞上清液中ALT和AST含量的比較(u/L，±s)

附表 各組細(xì)胞上清液中ALT和AST含量的比較(u/L，±s)

注:1)與空白對照組比較，P ＜0.05；2)與異煙肼組比較，P ＜0.05

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2.2 激動劑SRT1720對SIRT1的激動作用

異煙肼刺激造成HL-7702細(xì)胞的SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)降低，NF-kB p65的mRNA和蛋白及TNF-α、IL-6的蛋白表達(dá)升高，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q=2.564、15.132、5.582、11.431、14.816和16.318，P=0.019、0.000、0.002、0.000、0.000和0.000)，提示異煙肼組細(xì)胞發(fā)生了炎癥反應(yīng)。激動劑對照組與空白對照組炎癥因子表達(dá)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，提示激動劑對細(xì)胞無毒作用。SIRT1激動劑SRT1720的聯(lián)用可以抑制異煙肼刺激引起的NF-kB p65 mRNA和蛋白及TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)上升，與異煙肼組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q=2.849、7.581、9.081和16.528，P=0.012、0.000、0.000和0.000)，提示SIRT1的激活可以通過降低NF-kB p65表達(dá)進而減少IL-6、TNF-α表達(dá)，減輕異煙肼引起的炎癥反應(yīng)。見圖1～3。

2.3 抑制劑EX527對SIRT1的抑制作用

SIRT1抑制劑EX527的聯(lián)用可引起NF-kB p65 mRNA和蛋白及TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)進一步上升，與異煙肼組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q=2.736、8.142、8.917和18.454，P=0.015、0.000、0.000和0.000)，說明SIRT1的抑制可以通過增加NF-kB p65表達(dá)進而使TNF-α、IL-6表達(dá)上升，加重異煙肼導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。抑制劑對照組與空白對照組炎癥因子表達(dá)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，提示抑制劑對細(xì)胞無毒作用。見圖4～6。

圖1 各組SIRT1、NF-kB p65的mRNA表達(dá)

圖2 各組SIRT1、NF-kB p65的蛋白表達(dá)

圖3 各組IL-6、TNF-α的蛋白表達(dá)

圖4 各組SIRT1、NF-kB p65的mRNA表達(dá)

圖5 各組SIRT1、NF-kB p65的蛋白表達(dá)

圖6 各組IL-6、TNF-α的蛋白表達(dá)

3 討論

隨著抗結(jié)核藥物性肝損傷研究的深入，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)藥物代謝引起的炎癥反應(yīng)在其發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，但由于其機制十分復(fù)雜，目前為止尚不明確其損傷作用。NF-kB是1個蛋白二聚體，由p50、p65 兩種蛋白亞基組成，它存在于多種細(xì)胞中且是細(xì)胞中多條信號通路的匯集點，并在炎癥的發(fā)生、發(fā)展中具有至關(guān)重要的作用[7]。研究表明，NF-kB的高表達(dá)與肝臟疾病的發(fā)病密切相關(guān):在運用活性氧誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌的過程中會使NF-kB表達(dá)增加，而刺激活性氧增加會使NF-kB表達(dá)進一步增加，從而促進肝細(xì)胞癌的發(fā)生，這提示在肝癌發(fā)生的過程中，NF-kB可能起著重要作用[8]；此外，使用抗炎藥物治療膽汁淤積性肝損傷的大鼠，NF-kB水平會隨著治療時間延長而明顯下降，這同樣表明其與肝臟疾病的關(guān)系十分密切[9]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，異煙肼致小鼠肝損傷發(fā)生過程中，NF-kB通路被激活，促炎因子TNF-α過量產(chǎn)生[10]。本研究結(jié)果顯示，異煙肼引起的肝細(xì)胞損傷中NF-kB p65的表達(dá)升高，炎癥因子IL-6、TNF-α也隨之表達(dá)上升，進一步提示藥物代謝引起的炎癥反應(yīng)在ADLI發(fā)生過程中的重要作用。

SIRT1作為一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的組蛋白去乙酰化酶，能夠調(diào)控多種蛋白質(zhì)發(fā)生去乙?；?，從而參與到基因表達(dá)調(diào)控及機體免疫炎癥反應(yīng)等許多生物學(xué)功能的調(diào)控過程中。例如應(yīng)用丹酚酸B上調(diào)SIRT1表達(dá)，使p53去乙酰化水平增加，進而抗氧化酶活性提高，致乙醇誘導(dǎo)的急性肝損傷程度減輕[11]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在代謝相關(guān)的肝癌小鼠模型中，上調(diào)SIRT1表達(dá)，肝癌的發(fā)生率可明顯降低，并且SIRT1表達(dá)升高后，也會明顯降低肝臟的高脂損傷[12]。本研究結(jié)果顯示SIRT1在異煙肼致人正常肝細(xì)胞損傷的過程中呈低表達(dá)狀態(tài)，提示其可能參與到異煙肼致人正常肝細(xì)胞損傷的過程中。

研究證實SIRT1可以通過調(diào)控炎癥因子的表達(dá)情況，進而參與到機體免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生和發(fā)展的過程中[13-14]。SIRT1抑制炎癥反應(yīng)的相關(guān)機制目前并不十分清楚，但大多數(shù)觀點認(rèn)為它與抑制炎癥信號通路有關(guān)。其中，研究最多的是SIRT1對NF-kB信號通路的抑制作用。早有研究指出，SIRT1表達(dá)水平的異?？梢砸餘F-kB信號通路的紊亂，進而導(dǎo)致抗炎功能的紊亂[15]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，NF-kB p65亞單位自身需要經(jīng)過一系列的修飾才可發(fā)揮它轉(zhuǎn)錄因子的功能，其中乙?；揎検瞧渥钪匾男揎椡緩街籟16]。有研究證實，SIRT1可使NF-kB的亞基RelA/p65去乙酰化，致NF-kB表達(dá)減少，這可能阻止了炎癥反應(yīng)發(fā)生及隨后的心肌重構(gòu)[17]。WANG等[18]研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1可以對生物鐘基因Per2啟動子區(qū)組蛋白H4K16進行去乙?；瘡亩种破滢D(zhuǎn)錄，且其作用強于對組蛋白H3K9的去乙酰化作用，進而調(diào)節(jié)生物鐘與機體老齡化的平衡狀態(tài)。由此可猜測，在異煙肼致人肝細(xì)胞損傷過程中，SIRT1作用于NF-kB p65的機制可能是其使NF-kB p65靶基因啟動子區(qū)組蛋白發(fā)生去乙?；M而抑制基因轉(zhuǎn)錄，減輕肝損傷的發(fā)生，這還有待于進一步研究。

本研究結(jié)果表明，與空白對照組比較，異煙肼引起的肝細(xì)胞損傷中SIRT1表達(dá)減少，NF-kB p65的表達(dá)升高。SIRT1激動劑的加入可降低異煙肼誘導(dǎo)的NF-kB p65的表達(dá)，減少IL-6、TNF-α等炎癥因子的產(chǎn)生；加入SIRT1抑制劑后，可使NF-kB p65表達(dá)進一步升高。以上結(jié)果表明，激活SIRT1對異煙肼誘導(dǎo)的肝細(xì)胞具有保護作用，它的機制可能是SIRT1通過作用于NF-kB p65，減少NF-kB與核內(nèi)炎癥基因結(jié)合，進而減少IL-6、TNF-a等炎癥因子的產(chǎn)生。

綜上所述，SIRT1在異煙肼藥物的刺激下呈低表達(dá)狀態(tài)，可能參與到異煙肼致人正常肝細(xì)胞損傷的過程中。盡管本研究推測出SIRT1低表達(dá)與異煙肼致人正常肝細(xì)胞損傷的關(guān)系，但是本研究只運用一種正常人肝細(xì)胞系HL-7702進行試驗，未考慮到細(xì)胞系的多樣性，也不能證實相關(guān)機制是否具有普遍性，仍需在其他人正常肝細(xì)胞系中進行驗證和比較以及更深層次的體內(nèi)外和臨床實驗研究來明確兩者的相關(guān)機制，為今后的ADLI的預(yù)防性治療提供更詳盡的依據(jù)。