王玲玲 尚慶茂 董春娟

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所 農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

植物自身是一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，棲息著大量微生物，其中尤以細(xì)菌數(shù)量最多，包括定殖于植物根際的根際細(xì)菌、附生于植物組織（莖、葉、花及果實(shí)等）表面的附生細(xì)菌、以及分布于各器官或組織內(nèi)部的內(nèi)生細(xì)菌［1-2］，它們與宿主協(xié)同進(jìn)化，在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、抵御病蟲(chóng)害、增強(qiáng)寄主對(duì)環(huán)境脅迫的抗性方面具有重要作用。植物附生和內(nèi)生細(xì)菌現(xiàn)已作為新型的微生物資源，研究者們?cè)谒?、玉米、番茄、辣椒、白菜等多種作物中分離到具有固氮、促生和生防作用的菌株［3-5］。研究土壤以及植物附生和內(nèi)生細(xì)菌的種類(lèi)、分布、定殖規(guī)律，并比較它們相互間的異同，對(duì)篩選植物促生菌具有重要意義。

研究植物附生和內(nèi)生細(xì)菌群落主要采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法，依靠形態(tài)特征、生理生化特性等進(jìn)行分類(lèi)鑒定和計(jì)數(shù)。但是，可培養(yǎng)細(xì)菌僅占自然界細(xì)菌總數(shù)的1%-10%，傳統(tǒng)方法對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的認(rèn)識(shí)是不全面和有選擇性的［6］。近年來(lái)，以16S rRNA分析為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)手段的應(yīng)用為細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的解析提供了更高效的研究技術(shù)，如末端限制性片段長(zhǎng)度多樣性（Terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）、變性梯度凝 膠 電 泳（Denaturing gel gradient electrophoresis，DGGE）等。這些不依賴(lài)于培養(yǎng)的分子生態(tài)學(xué)方法，通過(guò)對(duì)條帶圖譜和序列的分析，更加快速、完整地反映植物附生和內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性［7-8］。

本實(shí)驗(yàn)以番茄（Solanum lycopersicum cv.）為研究對(duì)象，采用傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法結(jié)合DGGE技術(shù)對(duì)番茄根區(qū)和根際土壤以及各組織附生和內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量、豐富度、多樣性等進(jìn)行定量和比較分析，明確土壤細(xì)菌以及組織附生、內(nèi)生細(xì)菌間的分布規(guī)律及相關(guān)性，為篩選植物促生菌，提高植物的健康水平提理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試番茄選用中雜302（S. lycopersicum cv. Zhongza No.302）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所選育，番茄于2016年2月播種，4月定植于該所日光溫室中，常規(guī)栽培管理，植株長(zhǎng)勢(shì)良好，至7月當(dāng)番茄第四穗位果成熟時(shí)進(jìn)行取樣。

1.2 方法

1.2.1 番茄組織樣品采集 隨機(jī)選取20株健康番茄植株，依次收集根系、成熟葉片、位于第2至第4葉片間的莖段、以及第2和第3穗成熟果實(shí)，各組織樣品均無(wú)明顯的損傷。根區(qū)土壤的收集采用抖落法［9］，將松散與根系結(jié)合的土壤抖落后，過(guò)2 mm篩，去除根組織及大塊土壤、石頭塊等。將各土壤樣品和植物組織樣品分別裝入無(wú)菌自封袋中，4℃冰箱保存待用。3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 根區(qū)土壤中細(xì)菌的分離培養(yǎng) 取番茄根區(qū)土壤（0.3 g），置于無(wú)菌三角瓶中，加入無(wú)菌PBS溶液（NaCl 8 g/L、KCl 0.2 g/L、Na2HPO41.44 g/L、KH2PO40.24 g/L，pH 7.4），于25℃、150 r/min振蕩1 h后，靜置10 min，取上清液用無(wú)菌水按10倍梯度稀釋?zhuān)?0-1-10-6），稀釋后的懸液分別取100 μL涂布于TSA培養(yǎng)基（胰蛋白胨15 g/L、大豆胨5 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂15 g/L，pH 7.0），每個(gè)梯度懸液涂布3個(gè)平行，將培養(yǎng)皿置于37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，12 h后觀(guān)察細(xì)菌生長(zhǎng)情況并計(jì)數(shù)。

1.2.3 根際和番茄組織附生細(xì)菌的分離培養(yǎng) 取抖落根區(qū)土壤的番茄根以及莖、葉片等組織，置于無(wú)菌三角瓶中，加入含有0.01% Triton X-100的PBS溶液中，25℃、150 r/min振蕩3 h，將振蕩后的液體經(jīng)5000 r/min離心20 min，用無(wú)菌PBS溶液重懸沉淀，分別得到根際、莖和葉片的附生細(xì)菌懸液。將菌懸液用無(wú)菌水按10倍梯度稀釋后，分別涂布于TSA培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)，并觀(guān)察、計(jì)數(shù)。

1.2.4 番茄組織內(nèi)生細(xì)菌的分離培養(yǎng) 對(duì)上述經(jīng)PBS溶液清洗的番茄根、莖和葉片，參照文獻(xiàn)［10］方法進(jìn)行表面滅菌（80%乙醇，2 min；5% NaClO溶液，10 min），用無(wú)菌水清洗3遍，并將清洗液涂布于TSA培養(yǎng)基，以確認(rèn)表面滅菌是否徹底。參照文獻(xiàn)［11-13］分離番茄組織內(nèi)生細(xì)菌，用無(wú)菌刀片將各滅菌后的組織切成約0.5 cm × 0.5 cm的小塊，置于無(wú)菌研缽中研磨，研磨物中加入PBS溶液于150 r/min振蕩1 h后，經(jīng)4層無(wú)菌紗布過(guò)濾，濾液5000 r/min離心20 min，用無(wú)菌PBS溶液重懸沉淀，得各組織的內(nèi)生細(xì)菌懸液。將細(xì)菌懸液用無(wú)菌水梯度稀釋后涂布于TSA培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)后觀(guān)察、計(jì)數(shù)。

對(duì)于果實(shí)中內(nèi)生細(xì)菌的分離，將番茄果實(shí)經(jīng)表面滅菌后（80%乙醇，2 min；5% NaClO溶液，10 min），在中部橫切，分離其中果皮、胎座、種子及其表面膠狀物等4個(gè)部分。將各部分研磨后，過(guò)濾、離心，分離各部分的內(nèi)生細(xì)菌，并涂布TSA平板，觀(guān)察、計(jì)數(shù)，方法同上。

1.2.5 番茄組織附生和內(nèi)生細(xì)菌的16S rRNA拷貝數(shù)分析 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法計(jì)算各樣品中細(xì)菌的 16S rRNA 拷貝數(shù)［14］。

16S rRNA拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：采用Easy-Pure Bacteria Genome DNA Kit（全式金，北京）提取大腸桿菌DH5α（Escherichia coli DH5α）的基因組DNA。采用細(xì)菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和 1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）擴(kuò)增16S rRNA序列，采用Zymoclean Gel DNA Recovery Kit（ZYMO，USA）對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，采用NanoDrop 2000測(cè)定其濃度。使用 ddH2O 稀 釋 DNA 至 濃 度 為 1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和 10-6ng/μL（1 ng 模板對(duì)應(yīng)的 16S rRNA拷貝數(shù)為6.14 × 108），并以此為模板，采用細(xì)菌通用 引 物 SRV3-1（5'-CGGTCCAGACTCCTACGGG-3'）和 SRV3-2（5'-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3'） 對(duì)16S rRNA的V3區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Real-time PCR反應(yīng)體系（20 μL）：2 × Top Green qPCR SuperMix（全式金，北京）10 μL、引物（10 μmol/L）各 0.5 μL、模板（10 ng/μL）1.0 μL，用 ddH2O 補(bǔ)足 20 μL ；反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 5 min；95℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃ 10 s，45個(gè)循環(huán)。以模板中16S rRNA拷貝數(shù)的lg值為橫坐標(biāo)，以Real-time PCR所得的Ct值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

附生和內(nèi)生細(xì)菌基因組DNA提?。簩⒎蛛x得到的番茄根區(qū)土壤、根際、組織附生和內(nèi)生細(xì)菌懸液，利用FastDNATMSpin Kit for Soil試劑盒（MPbio，USA）進(jìn)行基因組DNA提取，并采用DNA產(chǎn)物純化試劑盒（天根，北京）對(duì)提取的DNA進(jìn)行純化。采用NanoDrop 2000（Thermo Scientific，USA）測(cè)定DNA濃度，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性。

細(xì)菌16S rRNA拷貝數(shù)分析：以純化后的細(xì)菌基因組DNA為模板，利用細(xì)菌通用引物SRV3-1和SRV3-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系和程序同1.2.5。根據(jù)Real-time PCR反應(yīng)的Ct值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出番茄各組織附生和內(nèi)生細(xì)菌的16S rRNA拷貝數(shù)。

1.2.6 番茄組織附生和內(nèi)生細(xì)菌的DGGE分析 以番茄根區(qū)土壤、根際、組織附生和內(nèi)生細(xì)菌基因組DNA為模板，采用通用引物341F-GC（5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGC ACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和518R（5'-ATTACCGCGGCTTGCTGG-3'） 擴(kuò) 增 細(xì) 菌16S rRNA的V3區(qū)片段。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：2×Fast Pfu SuperMix（全式金，北京）25 μL、引物（10 μmol/L）各 2 μL、模板（10 ng/μL）1 μL，用 ddH2O補(bǔ)足至 50 μL。PCR 反應(yīng)條件：95℃ 5 min；93℃ 30 s，65℃ 40 s，72℃ 1 min，10 個(gè)循環(huán) ；93℃ 30 s，60℃40 s，72℃ 1 min，10 個(gè)循環(huán) ；93℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃ 1 min，9 個(gè)循環(huán) ；93℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

DGGE試驗(yàn)參照房嫚嫚等［15］方法并進(jìn)行適當(dāng)修改。PCR產(chǎn)物采用DcodeTM基因突變檢測(cè)系統(tǒng)（Bio-Rad，USA）進(jìn)行DGGE電泳，聚丙烯酰胺梯度為6%-12%，變性劑梯度為20%-55%（以尿素7 mol/L、甲酰胺40%時(shí)的變性劑濃度為100%）。電泳結(jié)束后，凝膠經(jīng)SYBR Green I（Invitrogen，USA）染色后在成像系統(tǒng)中觀(guān)察并拍照。使用Quantity One（v4.6.2，Bio-Rad）對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行分析，2個(gè)樣本的相似性通過(guò)戴斯系數(shù)（Cs）條帶模式進(jìn)行估測(cè)（公式1），用非加權(quán)平均法（UPGMA）檢驗(yàn)各番茄樣品的相似性。

其中，j是兩條DGGE泳道中共有的條帶數(shù)，a和b分別為兩條DGGE泳道各自的條帶數(shù)。

采用多樣性指數(shù)（H）、豐富度指數(shù)（S）和均勻度指數(shù)（EH）等指標(biāo)比較各樣品的細(xì)菌多樣性。H的計(jì)算公式如下：

其中，S為樣品中所有條帶的數(shù)目總和，Pi為樣品中某一條帶（i）的強(qiáng)度在該樣品所有條帶總強(qiáng)度中所占的比率（%）。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)結(jié)果采用3次獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)的平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，用DPS 2000軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，運(yùn)用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性（P ＜ 0.05）檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 番茄組織附生和內(nèi)生可培養(yǎng)細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)

對(duì)番茄根區(qū)和根際土壤中的細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)并計(jì)數(shù)（圖1-A），根區(qū)和根際土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量分別為8.19×107和1.81×109CFU/g土壤，根際土壤中的細(xì)菌數(shù)量顯著高于根區(qū)土壤，是根區(qū)土壤的約22倍。對(duì)番茄根、莖和葉片附生的可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)（圖1-B），根附生的細(xì)菌數(shù)量最多（3.05×107CFU/g FW），莖和葉片附生的細(xì)菌數(shù)量次之，分別為8.53×106和1.12×107CFU/g FW。

圖1-C表示番茄各組織內(nèi)生的可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量，內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量遠(yuǎn)低于附生細(xì)菌。各組織內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量依次為 ：根 ＞ 果皮 ＞ 葉片 ＞ 胎座 ≈ 種子 ＞ 莖 ＞種子表面膠狀物。根內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量最多，為1.16×105CFU/g FW，而種子表面膠狀物中細(xì)菌數(shù)量最少，只有6.62×102CFU/g FW。

2.2 番茄組織附生和內(nèi)生細(xì)菌的16S rRNA拷貝數(shù)分析

采用Real-time PCR檢測(cè)番茄土壤及各組織附生和內(nèi)生的細(xì)菌16S rRNA拷貝數(shù)（圖2）。根區(qū)和根際土壤中16S rRNA拷貝數(shù)分別為1.96×109/g和5.13×109/g（圖2-A）；根、莖和葉片的附生細(xì)菌16S rRNA拷貝數(shù)分別為3.05×108/g、2.22×108/g和1.60×108/g（圖2-B），與傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法計(jì)數(shù)結(jié)果相比，變化趨勢(shì)一致，但數(shù)量上較傳統(tǒng)培養(yǎng)法多1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。對(duì)于內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA拷貝數(shù)，較傳統(tǒng)培養(yǎng)法，在數(shù)量上多2-4個(gè)數(shù)量級(jí)。其中，根中拷貝數(shù)最多，葉片與莖內(nèi)生數(shù)量相當(dāng)。果實(shí)的內(nèi)生細(xì)菌 16S rRNA 拷貝數(shù)依次為果皮 ＞ 種子 ＞ 胎座 ＞ 種子表面膠狀物（圖2-C）。

圖1 番茄根區(qū)和根際土壤（A）、組織附生（B）和內(nèi)生（C）可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量

圖2 番茄根區(qū)和根際土壤（A）、組織附生（B）和內(nèi)生（C）細(xì)菌16S rRNA拷貝數(shù)

2.3 番茄組織附生和內(nèi)生細(xì)菌群落相似度和多樣性分析

采用DGGE技術(shù)對(duì)番茄根區(qū)和根際土壤及各組織附生和內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行多樣性分析，各樣品的條帶幾乎布滿(mǎn)整個(gè)泳道（圖3），表明DGGE的變性劑梯度范圍合理，且各樣品均具有較高的細(xì)菌多樣性。各樣品所含條帶數(shù)目不等，其中番茄根際土壤條帶數(shù)最多，說(shuō)明根際微生物最豐富。

在DGGE圖譜中，條帶a、e、f、n、o、p、u、v出現(xiàn)在所有樣品中，其中條帶a、e、o在各樣品中位置相同，亮度也相近，條帶f、n、p、u、v在內(nèi)生菌樣品中條帶亮度較高，而在土壤和附生菌樣品中較弱，說(shuō)明這些條帶代表的細(xì)菌種類(lèi)在番茄組織內(nèi)生菌中占有優(yōu)勢(shì)地位。在7個(gè)番茄組織（根、莖、葉片、果實(shí)）內(nèi)生細(xì)菌樣品中，檢測(cè)到共有條帶10個(gè)，即 a、e、f、l、n、o、p、u、v、w，其中條帶 l、w僅在內(nèi)生菌樣品中出現(xiàn)，在土壤和附生菌中均未檢測(cè)到。在4種果實(shí)（果皮、胎座、種子及其表面膠狀物）的內(nèi)生細(xì)菌樣品中共檢測(cè)到12個(gè)共有條帶，即條帶 a、e、f、k、l、n、o、p、t、u、v、w，其中 k、t為僅在果實(shí)樣品中出現(xiàn)的特征條帶。

圖3 番茄組織附生和內(nèi)生細(xì)菌DGGE圖譜

根據(jù)DGGE圖譜分析各樣品細(xì)菌群落間的相似度（表1），并進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果（圖4）表明，進(jìn)化樹(shù)被分為3個(gè)分支，分別為根區(qū)土壤細(xì)菌分支、附生細(xì)菌分支和內(nèi)生細(xì)菌分支。在附生菌分支中，葉片附生和莖附生細(xì)菌群落間相似度為0.56，高于二者與根際細(xì)菌間的相似度。而在內(nèi)生菌分支中，莖內(nèi)生、葉片內(nèi)生和根內(nèi)生樣品間的細(xì)菌群落相似度達(dá)到0.62以上，三者聚類(lèi)在一起。此外，果實(shí)中胎座內(nèi)生、種子內(nèi)生和種子表面膠狀物內(nèi)生的細(xì)菌群落間的相似度分別為0.61、0.67和0.65，三者聚為一類(lèi)。

圖4 番茄組織附生和內(nèi)生細(xì)菌DGGE圖譜的聚類(lèi)分析

根據(jù)DGGE圖譜計(jì)算各樣品中細(xì)菌多樣性指數(shù)H、豐富度指數(shù)S和均勻度指數(shù)EH（表2）。在11個(gè)番茄樣品中，根際細(xì)菌的H指數(shù)和S指數(shù)最高；其次為根區(qū)土壤；莖和葉片附生細(xì)菌的H指數(shù)和S指數(shù)低于土壤樣品中；內(nèi)生細(xì)菌樣品中，除根和果皮內(nèi)生細(xì)菌的H指數(shù)和S指數(shù)與附生菌相當(dāng)，其余樣品的H指數(shù)和S指數(shù)顯著低于附生細(xì)菌，其中尤以種子表面膠狀物內(nèi)生細(xì)菌的H指數(shù)和S指數(shù)最低。番茄各樣品的均勻度指數(shù)均約0.95，差異不顯著。

表1 番茄組織附生和內(nèi)生細(xì)菌群落間的相似度

表2 番茄組織附生和內(nèi)生細(xì)菌的多樣性指數(shù)

3 討論

植物組織器官表面和內(nèi)部著生的各類(lèi)細(xì)菌，是植物生態(tài)系統(tǒng)的重要組成，與植物密切互作，消長(zhǎng)相關(guān)。植物的種類(lèi)、生長(zhǎng)發(fā)育情況等影響著這些細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，而這些細(xì)菌又通過(guò)自身的生命活動(dòng)影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育［16］。本實(shí)驗(yàn)中，采用傳統(tǒng)平板培養(yǎng)方法結(jié)合16S rRNA拷貝數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)于日光溫室中栽培的番茄，根際細(xì)菌數(shù)量最多，遠(yuǎn)高于根區(qū)土壤，根系分泌物中豐富的糖、蛋白、脂肪等有機(jī)物質(zhì)為微生物生存提供有機(jī)碳源，使得根際微生物數(shù)量比根際外的土壤微生物數(shù)量高幾倍到幾十倍［17］。對(duì)于番茄各組織的附生細(xì)菌數(shù)量，以根部最多，莖和葉片次之。這是由于在根周?chē)耐寥乐校?xì)菌可以存活幾年甚至幾十年，而莖和葉片等組織的生活周期相對(duì)較短［18］，且相較根部，莖、葉表面細(xì)菌生存環(huán)境相對(duì)嚴(yán)苛，可被利用的營(yíng)養(yǎng)成分較少，溫濕度波動(dòng)較大，且紫外線(xiàn)輻射對(duì)細(xì)菌的生存也會(huì)有較大影響［19］，從而導(dǎo)致根系附生的細(xì)菌數(shù)量顯著大于莖、葉片表面附生的細(xì)菌數(shù)量。

研究還發(fā)現(xiàn)，番茄內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量顯著低于附生細(xì)菌，且在不同組織中有顯著不同，以根內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量最多，這與之前在辣椒、番茄、茄子等植物中的報(bào)道結(jié)果一致［20-22］，主要是由于根所在的土壤環(huán)境含有比空氣中更為豐富的細(xì)菌資源，且根的表面積顯著大于其他組織或器官，使根成為細(xì)菌進(jìn)入植物的主要入口，導(dǎo)致根內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量最多，種類(lèi)最豐富。果皮內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量和多樣性?xún)H次于根，推測(cè)果皮中富含葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖等糖類(lèi)物質(zhì)，以及蘋(píng)果酸、檸檬酸、琥珀酸、丁酸、脯氨酸等有機(jī)酸和氨基酸［23］，可為細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖提供良好的營(yíng)養(yǎng)條件，引起細(xì)菌在果皮中富集。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用DGGE技術(shù)對(duì)土壤細(xì)菌、以及番茄各組織附生和內(nèi)生細(xì)菌的多樣性進(jìn)行了比較分析。DGGE圖譜顯示番茄各樣品均具有較高的細(xì)菌多樣性，但以根際細(xì)菌的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)最高，根區(qū)土壤次之，附生和內(nèi)生樣品最低，其中尤以種子表面膠狀物中內(nèi)生細(xì)菌的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)最低。有8條條帶存在于番茄所有樣品中，其中3條條帶在各樣品中位置相同，亮度相近，說(shuō)明這些條帶代表的細(xì)菌在土壤和番茄各組織表面和內(nèi)部均占有優(yōu)勢(shì)地位；有5條條帶在番茄內(nèi)生組織中亮度較高，而在其他樣品中較弱，說(shuō)明這些條帶代表的細(xì)菌種類(lèi)在番茄組織內(nèi)生菌中占有優(yōu)勢(shì)地位。對(duì)DGGE圖譜的聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)，根際細(xì)菌與組織附生和內(nèi)生細(xì)菌的群落相似度顯著高于根區(qū)土壤，根際與莖、葉片附生細(xì)菌聚為一個(gè)分支，7個(gè)組織內(nèi)生樣品聚為一個(gè)內(nèi)生分支，暗示細(xì)菌在番茄植株表面和內(nèi)部的定殖具有選擇性。番茄植株不同組織內(nèi)生細(xì)菌間的相似度最高，根、莖和葉片內(nèi)生細(xì)菌群落的相似度約為0.65，果實(shí)胎座、種子表面膠狀物以及種子內(nèi)生細(xì)菌群落的相似度也達(dá)到0.6以上。這些結(jié)果表明，番茄植株各組織，尤其是相鄰組織的內(nèi)生細(xì)菌間可能具有流動(dòng)性［24］。相似度分析還發(fā)現(xiàn)，相較于附生細(xì)菌，根際細(xì)菌與組織內(nèi)生細(xì)菌群落間的相似度更高，推測(cè)番茄內(nèi)生細(xì)菌可能主要來(lái)源于根際，通過(guò)根部吸收，并在進(jìn)入植物內(nèi)部后在其體內(nèi)遷移，最終在各個(gè)組織間選擇性地定殖［25-26］。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)合分子生物學(xué)手段，明確了番茄根區(qū)、根際土壤以及根、莖、葉片、果實(shí)、種子等組織的附生和內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量、多樣性及各樣品間的相似度。但上述方法也存在一定的局限性，未能在種屬水平上鑒定各樣品的細(xì)菌群落組成。故采用高通量測(cè)序技術(shù)鑒定番茄各樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，全面解析土壤細(xì)菌以及組織附生和內(nèi)生細(xì)菌間的相互關(guān)系，將是下一步開(kāi)展的工作重點(diǎn)。

4 結(jié)論

番茄根區(qū)、根際土壤以及組織附生和內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量依次為 ：根際土壤 ＞ 根區(qū)土壤 ＞ 附生 ＞ 內(nèi)生，組織內(nèi)生中以根和果皮內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量最多，葉片、莖和種子次之，種子表面膠狀物內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量最少。DGGE分析表明細(xì)菌在番茄植株表面和內(nèi)部的定殖具有選擇性，且組織內(nèi)生細(xì)菌與根際細(xì)菌群落密切相關(guān)，相鄰組織的內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似，表明內(nèi)生細(xì)菌在組織間具有流動(dòng)性。