尼加提·迪里木拉提 趙潔 艾新宇 劉小寧

（新疆大學生命科學與技術學院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046）

類肌鈣蛋白（Calponin，Cal），又稱鈣調(diào)寧蛋白。該蛋白于1994年被Applegate 等［1］首次從雞砂囊平滑肌組織中提取并純化出來。隨后發(fā)現(xiàn)其在多種生物體中存在，并在生物體的多個組織中表達，如人的血管、胃、膀胱、輸尿管、輸精管和子宮等組織平滑肌中都提取并純化出了相關Calponin蛋白［2］。哺乳動物和鳥類體內(nèi)的Calponin有3種亞型，根據(jù)等電點和同源染色體的不同分為：堿性Calponin（H1-Calponin，PI 8-10），中性 Calponin（H2-Calponin，PI 7-8）和酸性 Calponin（H3-Calponin，PI 5-6）［3］。在哺乳動物體內(nèi)，這3個亞型的1-273位氨基酸有高度的保守性（＞ 70%），氨基端都包含單個CH結構域，此結構域參與肌動蛋白結合［4］。羧基端有3個串聯(lián)重復，但是酸性Calponin的羧基端序列與其他兩者較為不同［3-6］。

Calponin是一種多功能的調(diào)節(jié)蛋白，它調(diào)節(jié)30多種酶的活性［7］。在平滑肌細胞中Calponin特異性的表達，其與肌動蛋白/原肌球蛋白細絲結合并抑制肌球蛋白 Mg2+-ATPase活性［8-9］。Calponin既通過調(diào)節(jié)肌動蛋白之間的相互作用來調(diào)節(jié)肌肉組織收縮功能，又可以調(diào)控細胞內(nèi)激酶或鈣信號的收縮調(diào)節(jié)［10-12］。Calponin被磷酸化能可逆地阻斷其與Ca2+/鈣調(diào)蛋白的相互作用。Calponin也在其他非肌肉細胞中被發(fā)現(xiàn)，如在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞中有相關報道［13］。該蛋白在非肌肉細胞中調(diào)節(jié)細胞骨架的生長并增強細胞骨架的穩(wěn)定性［13-14］，從而參與細胞的分裂、運動［15］及免疫調(diào)控［16］等過程。

Koz?owska等［17-18］克隆表達了果蠅和赤擬谷盜的Calponin家族基因DmChd64和TcChd64，并對這兩個蛋白的空間結構進行了研究，且有研究證明Chd64與FK506結合蛋白（FKBP39）有相互作用［17］。HaCal可能參與了棉鈴蟲的變態(tài)過程，結果顯示HaCal在棉鈴蟲蛹中上調(diào)表達，而20-羥基蛻皮激素提高了該基因的表達［19］。棉鈴蟲蛻皮過程中有30種差異表達的蛋白質(zhì)，包括酶類，調(diào)節(jié)劑，蛋白質(zhì)水解酶和受體蛋白［20］。HaCal與蜜蜂Chd64和果蠅Chd64分別有70%和67%的同源性［21］，因此HaCal可能與某些差異表達的蛋白存在相互作用。因對HaCal的結構特征了解不完全，以及缺少相應的抗體，阻礙了人們對HaCal在棉鈴蟲蛻皮和蛹變等發(fā)育過程中的功能認識。

本課題組通過酵母單雜交技術篩選棉鈴蟲CYP6B6基因響應2-十三烷酮誘導的調(diào)控因子，從中捕獲到HaCal，且前期已克隆分析了HaCal基因，并在核酸水平上檢測了該基因在棉鈴蟲不同發(fā)育時期和不同組織中的含量，說明HaCal在棉鈴蟲的不同發(fā)育時期和應對2-十三烷酮中均發(fā)揮作用。因此本實驗通過純化獲得高濃度融合蛋白His-HaCal，繼而用蛋白免疫法制備了高滴度的棉鈴蟲HaCal多克隆抗體，并驗證了該抗體能與棉鈴蟲體內(nèi)的HaCal特異性結合，這為后期進行HaCal功能的研究，以及與其他蛋白互作的鑒定提供重要的檢測工具。

1 材料與方法

1.1 材料

棉鈴蟲和黃粉蟲由本實驗室飼養(yǎng)，室內(nèi)飼養(yǎng)條件為：溫度25℃，相對濕度為75%，光周期為16 L:8 D。昆明白鼠從新疆醫(yī)科大學醫(yī)院購買。蛋白Marker 和BCA試劑盒購自Thermo Fisher Scientific 公司。小鼠抗His-tag的多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG抗體和DAB顯色試劑盒購自中杉金橋公司（北京）。ELISA板由廣州潔特生物過濾制品有限公司提供，其余所用的化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 HaCal蛋白的誘導表達和純化 融合蛋白His-HaCal的大量表達及純化按照本課題組前期的方法進行，并使用Ni-NTA柱純化融合蛋白，對目標蛋白的純化采用不同濃度咪唑（0.02 mol/L，2 次、0.04、0.1、0.2及0.5 mol/L）進行洗脫，分別收集流出的洗脫液并經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，用BCA蛋白濃度定量試劑盒進行蛋白定量。

1.2.2 多克隆抗體的制備 純化后的His-HaCal融合蛋白免疫小白鼠，用此法制備鼠抗His-HaCal的多克隆抗體。第一次免疫前用眼眶采血法收集小白鼠血液，將其37℃放置30 min，4℃放置1 h，5000 r/min離心10 min收集上層清液，將血清放于-80℃保存，作陰性對照。免疫時，每只小鼠用50 μg純化的融合蛋白與等體積的弗氏完全佐劑充分混勻并乳化，足墊和皮下兩部位注射免疫小鼠。兩周一次加強免疫，共4次免疫。除第一次免疫用弗氏完全佐劑以外，其余3次均用弗氏不完全佐劑。免疫4次后收集血清將其放于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 ELISA法檢測鼠抗His-HaCal抗血清效價 抗體滴度的檢測用間接酶聯(lián)免疫吸附測定法（間接ELISA）。His-HaCal抗原經(jīng)包被液稀釋，抗原終濃度10 μg/mL，每孔加入200 μL該包被液包被ELISA板，4℃過夜包被后棄去包被液；用PBST洗滌3次，每孔加入200 μL封閉液（5%脫脂奶粉的PBST），37℃封閉2 h；棄去封閉液后加入100 μL按比例稀釋的抗血清（血清：封閉液），37℃孵育1 h；用PBST洗滌3次，每孔加入100 μL的二抗稀釋液（羊抗鼠IgG：封閉液為1∶3000）；PBST洗滌3次，加入100 μL/孔的TMB顯色液，37℃顯色10 min，最后加入50 μL的H2SO4（2 mol/L）終止反應。讀取在450 nm處的OD值。

1.2.4 多克隆抗體的特異性分析 采用TCA/丙酮沉淀法提取棉鈴蟲和黃粉蟲總蛋白，具體步驟參考Li等［22］的方法。將His-HaCal、棉鈴蟲和黃粉蟲總蛋白，SDS-PAGE電泳分離后電轉移至 PVDF膜上。用封閉液（5%脫脂奶粉的PBST）37℃封閉1 h，棄封閉液，加入1∶1000稀釋的His-HaCal多克隆抗體37℃孵育1.5 h再用PBST溶液洗膜3次。1∶3000稀釋的二抗（山羊抗鼠IgG抗體），在37℃孵育1.5 h，PBST洗3次后加入DAB底物顯色液避光顯色10 min，顯現(xiàn)清晰條帶后加去離子水終止反應并拍照。

免疫組化昆蟲為2齡棉鈴蟲，固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟和抗原的修復等步驟參考Zhao等［23］的方法，隨后用含有5%脫脂奶粉的PBS進行抗原封閉，37℃孵育2 h；洗去封閉液后滴加一抗（血清∶封閉液=1∶1500），4℃過夜孵育，37℃保溫30 min；甩去一抗，用PBS洗滌3次，滴加二抗（山羊抗鼠 IgG∶封閉液=1∶2000），37℃孵育2 h；棄去二抗，用PBS洗滌3次，將組織切片上滴加DAB顯色劑，顯色3 min，蒸餾水沖洗DAB顯色液；隨后進行梯度脫水和封片；最后用Nikon NISElements D顯微鏡進行觀察和拍照。

2 結果

2.1 His-HaCal融合蛋白的表達純化

先用鎳柱吸附原核表達的融合蛋白His-HaCal，再用不同濃度的咪唑梯度洗脫，所得的洗脫樣經(jīng)15%的SDS-PAGE電泳檢測（圖1）顯示His-HaCal在0.02、0.04、0.1、0.2和0.5 mol/ L咪唑濃度的洗脫液都能洗下來，其中0.5 mol/ L咪唑濃度的洗脫液能洗脫比較單一的融合蛋白His-HaCal，可以用于后期的免疫小鼠制備抗體。

圖1 融合蛋白在不同濃度的咪唑洗脫液純化洗脫

2.2 融合蛋白的Western blot鑒定

Western blot鑒定原核表達的融合蛋白His-HaCal，結果（圖2）表明雜交出的條帶大小與預計大小23.9 kD相符合，說明融合蛋白表達正確。

圖2 純化后的融合蛋白His-HaCal Western blot鑒定

2.3 ELISA檢測鼠抗His-HaCal多克隆抗體效價

用His-HaCal融合蛋白4次免疫小白鼠后，ELISA方法測定抗血清效價。從圖3可以看出當血清稀釋819200倍時，樣品在450 nm的光吸收值大于陰性對照數(shù)值的2.1倍，即抗血清效價均大于819200，甚至部分樣品（2號老鼠）抗血清效價達到1638400，說明已達到預期的實驗要求。

2.4 His-HaCal多克隆抗體免疫特異性檢測

圖3 ELISA測定His-HaCal多克隆抗體效價

用已制備好的抗His-HaCal多克隆抗體檢測棉鈴蟲和黃粉蟲的總蛋白，Western blot結果（圖4-A）顯示所制備的多克隆抗體與棉鈴蟲天然HaCal蛋白特異性結合，條帶大?。?0.52 kD）正確，而與黃粉蟲的總蛋白無雜交條帶。用免疫后的小鼠血清對棉鈴蟲中腸組織進行免疫組化分析（圖4-B），表明該血清能和棉鈴蟲中腸組織天然的HaCal特異性結合，說明制備的His-HaCal多克隆抗體具有較好的免疫特異性，可以用于后續(xù)的研究。

圖 4 抗HaCal多克隆抗體的免疫特異性檢測

3 討論

類肌鈣蛋白（Calponin）是一種肌動蛋白結合蛋白，有抑制肌動球蛋白Mg2+ATPase的活性［8-9］。目前Calponin功能的研究主要涉及協(xié)調(diào)平滑肌的收縮、細胞增殖及細胞信號傳導等。Calponin在細胞信號傳導的過程中，與受體蛋白結合從而將蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）和絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK） 定 位于細胞膜上，又能結合PKC的調(diào)控域從而調(diào)節(jié)PKC的活性。Calponin也能影響該途徑下游基因的轉錄激活和表達，因而改變細胞增殖［24］。

研究表明Calponin特異性抗體可以作為腫瘤檢測和蛋白檢測的有效工具。Calponin在人類平滑肌組織中的研究較多，可用于臨床診斷［25］。Lee等［26］用免疫組化方法證實Calponin也存在于腎肌成纖維細胞中，PECs（壁層上皮細胞）細胞與含有Calponin的成肌細胞之間的相互作用能在腎小球硬化晚期診斷中起著關鍵作用。Calponin2單克隆抗體可用于乳腺癌的早期診斷，此外，Calponin2還有助于判定腫瘤是否為惡性［27］。Meyer-Rochow 等［28］用特異性識別戈爾迪烏斯線蟲Calponin和Troponin（肌鈣蛋白）的兩種抗體來對線蟲體壁肌肉進行免疫組化檢測，證實此肌肉具有平滑肌和橫紋肌特征。此特征前期僅在秀麗線蟲中和少數(shù)蛻皮昆蟲中得到證實。

棉鈴蟲的生長和發(fā)育主要由保幼激素（Juvenile hormome，JH）和20-羥基蛻皮激素（20E）控制，JH調(diào)控幼蟲狀態(tài)的維持，20E調(diào)控幼蟲的蛻皮和和蛹的變態(tài)，在幼蟲階段結束時，JH滴度下降至最低水平，20E滴度升高從而開始蛹的變態(tài)過程［29］。棉鈴蟲類肌鈣蛋白（HaCal）屬于Calponin家族蛋白，在棉鈴蟲的整個發(fā)育過程中均表達，且可能參與幼蟲的蛻皮過程和蛹的變態(tài)過程。Liu等［30］研究發(fā)現(xiàn)，含有Chd結構域的HaCal蛋白在棉鈴蟲蛻皮和蛹變過程中上調(diào)表達，并被PKC磷酸化，且受20E和鉀氨普烯的誘導表達量上升，20E誘導后蛋白被磷酸化，而鉀氨普烯誘導后蛋白仍未被磷酸化。HaCal存在于細胞質(zhì)中，激素誘導后可快速轉移到細胞核中，非磷酸化的HaCal能與USP1（泛素特異性蛋白酶）相互作用，在20E的信號轉導途徑中作為中間調(diào)節(jié)劑起著關鍵作用。Burgstaller等［31］的研究表明Calponin的C末端可變區(qū)決定不同類型Calponin的細胞種類分布和同一類型Calponin的不同功能。Gimona等［32］從雞的骨骼肌肉、腎臟、肝臟和脾臟等組織中提取總蛋白，用抗Calponin蛋白的抗體進行檢測，結果顯示未檢測到Calponin蛋白，隨后其他研究小組研究亦有相似結果。

為了得到高效價和高特異性的多克隆抗體，必須對抗原的準備、實驗動物的選擇、免疫的方式和加強免疫的間隔等方面進行詳細設計。本實驗選用了蛋白免疫法，此方法比核酸免疫所得到的抗體效價高，但缺點是抗原持續(xù)發(fā)揮作用的時間比核酸免疫持續(xù)的時間短，因此每兩周加強免疫一次［33］。本實驗純化出高純度的His-HaCaL融合蛋白，滿足了抗原免疫要求。選用6周齡且較溫順的雌性小鼠，注射時添加弗氏佐劑來改善免疫反應，因為它無免疫原性，且能增強抗原的免疫應答過程［34］。本實驗采用足墊加腹部皮下多點注射的方法，因為足墊和腹部皮下的抗原遞呈細胞較多，有利于對抗原的攝取和加工。前3次免疫用足墊免疫為主皮下免疫為輔，3次免疫后觀察到小鼠足趾腫脹，第四次免疫時選擇皮下免疫為主，足墊免疫輔，且每次總注入量不變。徐霞等（Xu）［35］采用此方法獲得了效價較好的小鼠抗青霉素結合蛋白（PBP2a）的多克隆抗體，研究顯示不同方法獲得的抗體效價也不同，抗體效價高到低依次為足墊加皮下免疫、腹腔免疫和足墊免疫。本實驗用純化的HaCaL蛋白獲得了滴度高于1∶819200的多克隆抗體，其中二號樣本滴度高達1∶1638400，表明該抗體可滿足后續(xù)實驗要求。Western blot結果顯示獲得的抗體能與棉鈴蟲體內(nèi)天然HaCaL蛋白結合且不能識別黃粉蟲體內(nèi)Calponin蛋白，表明該多克隆抗體的特異性較高。從蛋白水平上對棉鈴蟲類肌鈣蛋白進行檢測，相對于核酸水平上檢測，蛋白質(zhì)的功能較穩(wěn)定，從蛋白水平來分析、鑒定更加直接、準確。隨后通過免疫組化的方法進一步證明該蛋白存在于棉鈴蟲的中腸組織中且表達量較高。

4 結論

本實驗純化獲得了高濃度的融合蛋白His-HaCal，通過蛋白免疫法制備了高滴度和特異性較高的棉鈴蟲HaCal多克隆抗體，并驗證了該抗體能與棉鈴蟲體內(nèi)的HaCal特異性結合，這為后期進行HaCal功能的研究和與其他蛋白互作的鑒定提供重要的檢測工具。