高慶華 董聰 王玥 胡美榮 王慶慶 王云鵬 羅同陽 劉蕾

（1. 河北省微生物研究所，保定 071051；2. 中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100101）

葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GOD）的系統(tǒng)命名為β-D-葡萄糖氧化還原酶（EC1.1.3.4），是一種需氧脫氫酶，專一催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫。GOD的催化特性使其具有去葡萄糖、脫氧、殺菌等功能，且安全無毒無副作用，是國家允許使用的酶制劑之一，在食品的加工保鮮、醫(yī)學(xué)檢測等方面都有廣泛應(yīng)用［1］。

GOD在自然界廣泛分布，來源包括昆蟲、紅藻類、巧橘類水果、細(xì)菌和真菌等動植物、微生物體。目前用于生產(chǎn)的工業(yè)化菌種主要有黑曲霉和點(diǎn)青霉；但是對于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)來說，一個高效且經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)系統(tǒng)是迫切需要的［2］。畢赤酵母（Pichia pastoris）表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)展成為一個成熟的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，已有上千種蛋白在畢赤酵母系統(tǒng)中得到成功表達(dá)。近些年，畢赤酵母被美國FDA認(rèn)定為GRAS（Generally recognized as safe），為其在食品及醫(yī)藥上應(yīng)用鋪平了道路［3］。Crognale等［4］選擇了甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母作為宿主，將 GOD 基因整合入P. pastoris X33異源表達(dá)，通過3 L發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵，GOD 活性到了 50 U/mL，相比野生型菌株產(chǎn)量提高了近 4倍。Guo等［5］將GOD基因整合到畢赤酵母中，搖瓶水平發(fā)酵酶活達(dá)到40 U/mL，是出發(fā)菌株A.niger Z-25的20倍。

隨著畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的廣泛化應(yīng)用，該系統(tǒng)的一些自身的缺陷也逐漸暴露出來。某些外源蛋白的表達(dá)水平過高，超過了宿主細(xì)胞翻譯后處理加工能力所能承擔(dān)的最大負(fù)荷，引起蛋白的錯誤折疊、不加工或錯誤定位，進(jìn)而導(dǎo)致目的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中形成多聚體，并阻滯在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)妨礙其功能，或者分泌到胞外的蛋白質(zhì)無活性。這些問題越來越成為阻礙畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用于高水平表達(dá)的瓶頸問題［2］。

研究表明，分子伴侶的大量表達(dá)可以促進(jìn)蛋白折疊。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶（Endoplasmic reticulum oxidation 1，Ero1）和二硫鍵異構(gòu)酶（Protein disulfide isomerase，PDI）均為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的信號肽，其中PDI 的氧化活性幫助蛋白形成正確的折疊結(jié)構(gòu)而分泌到胞外，對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)蛋白質(zhì)二硫鍵的形成具有促進(jìn)作用，幫助蛋白質(zhì)分泌［6］；Ero1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中氧化還原態(tài)的PDI 成氧化態(tài)，間接幫助蛋白分泌［7］。陳飛等研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)整合 PDI 及同時整合 Ero1、PDI 畢赤酵母菌株的 CiP酶活分別提高了 2.43 和2.62倍［8］；陳鳳祥等［9］在畢赤酵母中共表達(dá)Ero1和PDI分別使IFNβ-HSA 的表達(dá)量提高了80%和90%。

本研究中，在前期研究中我們已經(jīng)克隆了一株來源于高產(chǎn)葡萄糖氧化酶點(diǎn)青霉的GOD基因，并篩選獲得了畢赤酵母基因工程菌株X33-pMD-GOD［10］，在此基礎(chǔ)上，研究進(jìn)一步通過共表達(dá)分子伴侶PDI基因及同時共表達(dá)分子伴侶Ero1-PDI基因?qū)甑纳L和分泌外源蛋白質(zhì)GOD的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 大腸克隆菌株DH5α購自天根生化科技有限公司；酵母表達(dá)菌株X33-pMD-AOXGOD由作者實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏；分子伴侶表達(dá)載體pPICZ A由中科院微生物研究所提供。

1.1.2 主要試劑和儀器 DNA聚合酶、T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶BstB I、Not I、BamH I、Sfo I購自NEB公司；核酸 Marker購自上海生工；蛋白 Marker購自Thermo公司；G418和Zeocin購自Invitorgen 公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自天根生化科技有限公司；PCR 儀購自東勝創(chuàng)新生物科技有限公司和Power B電泳儀和MINI P-4電泳系統(tǒng)購自凱元信瑞儀器有限公司公司；全自動凝膠成像儀購自上海天能科技有限公司；引物和DNA 測序由上海生工完成。

1.1.3 培養(yǎng)基 （1）畢赤酵母培養(yǎng)基：YPD和BMGY 參照文獻(xiàn)配制。（2）分批發(fā)酵BSM培養(yǎng)基：參照文獻(xiàn)配制。（3）補(bǔ)料培養(yǎng)基：含12 mL/L PTM1的50%甘油。（4）誘導(dǎo)培養(yǎng)基：含12 mL/L PTM1的100%甲醇，同時補(bǔ)加50%山梨醇。

1.2 方法

1.2.1 分子伴侶基因 PCR擴(kuò)增 分子伴侶蛋白Ero1 和PDI 基因序列分別以GenBank公布的登錄號XM_002489600.1和EU805807.1設(shè)計合成引物，引物兩端均分別含有BstB I和Not I酶切位點(diǎn)（表1），以畢赤酵母的基因組為模板擴(kuò)增出 Ero1和 PDI基因序列。PCR擴(kuò)增條件：98℃ 5 min；98℃ 30 s，55℃30 s，72℃ 60 s，共 30 個循環(huán) ；72℃ 10 min。

1.2.2 分子伴侶重組質(zhì)粒構(gòu)建 將PCR產(chǎn)物純化后連接pGM-T克隆載體上，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，提質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定。將得到的陽性克隆質(zhì)粒采用BstB I和Not I雙酶切，純化后與同樣雙酶切載體pPICZ相連接，篩選陽性克隆驗(yàn)證，獲得重組質(zhì)粒pPICZ/Ero1和pPICZ/PDI。將基因測序正確的重組質(zhì)粒pPICZ/PDI利用引物EP-F和EP-R擴(kuò)增出含有AOX啟動子、PDI基因以及終止子區(qū)域的目的片段，與測序正確且BamHI線性化的重組質(zhì)粒pPICZ/Ero1進(jìn)行同源重組，采用NOVO protein同源重組方法，構(gòu)建克隆載體pPICZ/Ero1-PDI。轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定、測序，獲得構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pPICZ/Ero1-PDI。

表1 分子伴侶基因PCR擴(kuò)增引物列表

1.2.3 陽性轉(zhuǎn)化子的獲得 將測序正確的重組質(zhì)粒pPICZ/PDI和pPICZ/Ero1-PDI分別用SfoI限制內(nèi)切酶進(jìn)行線性化后，分別電擊轉(zhuǎn)化同一株X33-pMDAOX-GOD感受態(tài)細(xì)胞，電轉(zhuǎn)條件一樣（1.5Kv、5 ms）。然后加入預(yù)冷的YPDS 30℃靜置培養(yǎng)2-6 h后，涂布在終濃度 250 μg/mL G418和50 μg/mL Zeocin的YPD雙抗平板上，置于30℃培養(yǎng)3 d后獲得轉(zhuǎn)化子。

1.2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組菌株X33/pMDGOD和分別整合分子伴侶PDI，Ero1-PDI的X33/pMD-GOD菌株進(jìn)行YPD平板劃線培養(yǎng)，挑取單菌落接種于5 mL YPCS試管種子培養(yǎng)基中，20-24 h后加 1%（V/V）甲醇誘導(dǎo)，之后培養(yǎng)到48 h和 72 h各加1%（V/V）甲醇誘導(dǎo)，96 h收菌，8000 r/min離心 5 min收集上清，上清進(jìn)行酶活檢測。

1.2.5 畢赤酵母胞內(nèi)蛋白的提取 收集酵母細(xì)胞（約1010個細(xì)胞酵母），以PBS緩沖液清洗兩遍后，重懸于 450 μL畢赤酵母總蛋白提取緩沖液，加入等體積的酸處理過的玻璃珠，渦旋震蕩 1 min，置于冰上 30 s，重復(fù) 10 次。4℃，16000×g，離心20 min，所得上清即為酵母胞內(nèi)總蛋白提取液。采用BCA法定量蛋白上樣量。

1.2.6 GOD的酶活測定 GOD 活性測定方法參照文獻(xiàn)，采用鄰一聯(lián)（二）茴香胺分光光度法。1個酶活力單位是指在37℃、pH5.0條件下，在1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化 1 μmol葡萄糖生成 1 μmol葡萄糖酸和 H2O2所需的酶量。

1.2.710 L發(fā)酵罐放大表達(dá)GOD 選取試管水平上葡萄糖氧化酶活性最高的轉(zhuǎn)化子，在10 L發(fā)酵罐條件下進(jìn)行GOD的表達(dá)。挑單克隆接種于 YPD培養(yǎng)基培養(yǎng) 10 h，按 3%接種量轉(zhuǎn)接于 100 mL BMGY 培養(yǎng)基至OD600≈6接種于10 L發(fā)酵罐，初期裝液量為 5.6 L BSM培養(yǎng)基，高壓滅菌20 min后，以 10%發(fā)酵體積接種。期間每隔24 h 加維生素C 水溶液（終濃度80 μg/L），30℃培養(yǎng)，每12 h取樣測定發(fā)酵液酶活；上清液進(jìn)行10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳，觀察GOD 蛋白質(zhì)的表達(dá)。具體方法參照文獻(xiàn)［10］。

2 結(jié)果

2.1 共表達(dá)PDI、Ero1-PDI酵母菌株的構(gòu)建

以P. pastoris X33基因組為模板，PCR擴(kuò)增獲得pdi和ero1基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%核酸電泳驗(yàn)證如圖1-A，在1500 bp左右可見明顯的特異性條帶，其大小與目標(biāo)序列預(yù)期相符。將純化后的基因與克隆載體pMD 18-T連接后測序，測序結(jié)果與GenBank中收錄的序列一致（GenBank編號：AJ302014和8197528）。

將測序正確的pMD 18-T-pdi、pMD 18-T-ero1和表達(dá)載體pICZ A同時進(jìn)行BstB I和Not I雙酶切，膠回收純化后用T4連接酶16℃連接過夜，T1擴(kuò)增，提取質(zhì)粒后雙酶切，酶切結(jié)果經(jīng)1%核酸電泳分析，如圖1-B所示，在2900 bp和1500 bp左右有特異性DNA條帶，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，獲得了克隆載體pMD-ERO1和pMD-PDI。

將基因測序正確的重組質(zhì)粒pMD-PDI利用引物EP-F和EP-R擴(kuò)增出含有AOX啟動子、PDI基因以及終止子區(qū)域的目的片段，與測序正確且BamH I線性化的重組質(zhì)粒pMD-ERO1進(jìn)行同源重組，采用NOVO protein同源重組方法，構(gòu)建克隆載體pMDERO1-PDI。

2.2 陽性轉(zhuǎn)化子的篩選-試管水平檢測分子伴侶對GOD表達(dá)的影響

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和重組質(zhì)粒的鑒定

將X33/pMD-AOX-GOD菌株作為空白菌株，與分別整合分子伴侶PDI和Ero1-PDI的X33/pMDAOX-GOD菌株按照上述條件進(jìn)行搖瓶發(fā)酵?？瞻拙昝富?4.376 U/mL，其中整合PDI的GOD菌株P(guān)-6和P-7酶活分別為22.539 U/mL和22.204 U/mL，酶活分別提高了56.8%和54.5%；同時整合Erol，PDI的GOD菌株EP-1、EP-8和EP-15酶活分別為達(dá)到21.001 U/mL、24.635 U/mL 和 25.321 U/mL（ 圖 2），酶活分別提高了46.0%、71.4%和76.1%。

由圖2可知，整合PDI菌株少部分菌株的酶活還有降低的現(xiàn)象；整合Erol-PDI菌株蛋白表達(dá)均較對照有較大的提高。

圖2 共表達(dá)分子伴侶對GOD酶活的影響

進(jìn)一步驗(yàn)證分子伴侶的表達(dá)量的多少是否與GOD的表達(dá)相關(guān)，研究了P-1、P-7、EP-8和EP-15共表達(dá)的分子伴侶的胞內(nèi)表達(dá)和GOD表達(dá)的關(guān)系。從圖3-A和圖3-B中可以看出整合分子伴侶PDI和Ero1-PDI的X33/pMD-AOX-GOD菌株的PDI表達(dá)量明顯高于對照菌株，菌株EP-15的PDI表達(dá)量最高，其目的蛋白GOD的表達(dá)量也最高，酶活也最高。

圖3 葡萄糖氧化酶胞外表達(dá)（A）和分子伴侶胞內(nèi)表達(dá)（B）檢測

2.310 L發(fā)酵罐表達(dá)GOD

將對照菌株X33 /pMD-GOD和整合伴侶蛋白PDI及PDI/ERO1的菌株P(guān)-7和EP-15采用甲醇/山梨醇混合碳源流加方式進(jìn)行10 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)。誘導(dǎo)表達(dá)144 h后下罐，發(fā)酵液上清進(jìn)行SDS-PAGE分析（圖4）；對照菌株誘導(dǎo)156 h下罐時酶活為367 U/mL（圖5-A），整合了分子伴侶的菌株蛋白表達(dá)量明顯高于對照菌株（圖5-B和C），同時整合伴侶蛋白Erol-PDI的EP-15菌株下罐酶活最高，誘導(dǎo)132 h 時酶活還未達(dá)到峰值，在156 h時達(dá)到了736 U/mL（圖5-C），比對照菌株下罐時酶活提高了1倍。

3 討論

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)是一種成熟的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，提高酵母表達(dá)外源蛋白水平的工藝方法研究一直備受關(guān)注［11-12］。通過在畢赤酵母X33 中分別單獨(dú)表達(dá)分子伴侶PDI及同時共表達(dá)分子伴侶Ero1-PDI，探索了過量表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中這兩種蛋白質(zhì)折疊輔助因子對外源蛋白質(zhì)GOD分泌表達(dá)的影響。GOD由兩個相同編碼序列編碼的同型二聚體分子構(gòu)成，通過二硫鍵結(jié)合，二級結(jié)構(gòu)中主要是β折疊［13］。已有研究表明，酵母細(xì)胞表達(dá)外源蛋白分泌產(chǎn)率與PDI 及二硫鍵形成有很大的相關(guān)性。酵母中 PDI 的過量表達(dá)能大幅度的提高外源蛋白的表達(dá)水平，尤其是含較多二硫鍵的蛋白［8，14］。另外，在畢赤酵母中表達(dá)Ero1使目的蛋白的表達(dá)量提高［9］。

圖4 SDS-PAGE分析10 L發(fā)酵罐對照菌株（CK）和添加分子伴侶菌株GOD表達(dá)情況（P-7、EP-8及EP-15）

圖5 GOD空白對照菌株（（A）、添加分子伴侶菌株P(guān)DI及同時整合PDI-ERO1菌株（B）在10 L發(fā)酵罐中誘導(dǎo)生長和酶活分析

我們通過Ero1、PDI成功地在胞內(nèi)過量表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其首先并不影響宿主細(xì)胞的正常生長；其次在10 L 發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)整合PDI和同時整合Ero1-PDI 菌株酶活與表達(dá)量均有明顯提高，其中整合Ero1-PDI 菌株的發(fā)酵酶活為736 U/mL 比對照菌株的發(fā)酵酶活367 U/mL整整提高了1倍。這說明當(dāng)Ero1、PDI 以及GOD 共表達(dá)時，PDI 在幫助GOD形成二硫鍵時，本身被還原，Ero1 可以將PDI氧化，使其重新恢復(fù)功能，從而促進(jìn)GOD 的表達(dá)。而且，分子伴侶的表達(dá)越多對其目的蛋白的表達(dá)越有利，這或與分子伴侶的表達(dá)也受甲醇誘導(dǎo)有關(guān)。但是，不是所有酶的表達(dá)，都與PDI的表達(dá)成正比［15］。

本研究通過整合分子伴侶促進(jìn)蛋白正確折疊從而提高蛋白表達(dá)為以后在畢赤酵母細(xì)胞中的表達(dá)外源基因提供了新的思路和借鑒。分子伴侶是一個相互影響、相互作用的有機(jī)整體，如Ero1與PDI之間存在的相互作用，應(yīng)該根據(jù)目的蛋白的結(jié)構(gòu)特征，選擇合適的分子伴侶優(yōu)化表達(dá)組合。除此之外，還應(yīng)該考慮分子伴侶與啟動子、信號肽的組合及發(fā)酵工藝條件等，進(jìn)行條件優(yōu)化設(shè)計研究。

4 結(jié)論

本研究在工程菌X33/pMD-GOD中共表達(dá)分子伴侶PDI-Ero1 得到菌株X33/pMD-GOD/pPICZ-PDIEro1。在10 L 發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)過程中，采用甲醇/山梨醇混合碳源誘導(dǎo)的策略，GOD 最終酶活為736 U/mL，比對照菌株提高了1倍。