李建軍，馬靜瀟,尚星晨，張光田，許 平

(1.河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/綠色藥材生物技術(shù)河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南 新鄉(xiāng) 453007； 2.四川秦巴中藥科技有限公司，四川 巴中 636600； 3.鄒城市林業(yè)局，山東 濟(jì)寧 273500)

皂莢(Gleditsiasinensis)，又名皂莢樹，系豆科蘇木亞科皂莢屬[1]，具有重要的林學(xué)和經(jīng)濟(jì)學(xué)價(jià)值,其莢果、種子、枝刺等是醫(yī)藥、化妝品及洗滌用品的天然原料[2]。皂莢在不同發(fā)育條件下可形成2類不同的果實(shí)，即大皂角和豬牙皂。大皂角(GleditsiasinensisLam.)為皂莢的干燥成熟的果實(shí)，豬牙皂(Fructus gleditsiae abnormalis)為皂莢的干燥不育果實(shí)[3-4]。

大皂角主產(chǎn)山東、河南、山西等地，豬牙皂主產(chǎn)山東、四川等地[5]。皂莢莢果形態(tài)多樣，大皂角有發(fā)育良好的種子，豬牙皂根據(jù)其有無(wú)種子又分為無(wú)種子的豬牙皂小果和種子發(fā)育不全的豬牙皂大果[6-8]。大皂角與豬牙皂古今同用，兩者均可以入藥，藥典中并沒(méi)有將兩者的藥理作用區(qū)分論述，但在臨床療效上，大皂角與豬牙皂又有顯著區(qū)別，大皂角常用于濕痰的治療，豬牙皂卻常用于風(fēng)痰的治療[9]，且豬牙皂價(jià)格、藥效明顯高于大皂角，但產(chǎn)量卻低于大皂角。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)大皂角和豬牙皂的形態(tài)結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分、藥理活性等進(jìn)行了相關(guān)研究[2，4，8，10-11]，但針對(duì)大皂角與豬牙皂大、小果之間形態(tài)結(jié)構(gòu)與成分分析的研究未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室就大皂角和豬牙皂的外部形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、藥用成分進(jìn)行比較研究，為大皂角與豬牙皂的鑒別和用藥提供理論和技術(shù)支撐，也為確定豬牙皂的種內(nèi)地位、大皂莢與豬牙皂的資源評(píng)價(jià)和新品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)儀器

電子分析天平、直尺、MNT-150游標(biāo)卡尺、KH-250D型超聲波清洗器、DHY-300超微粉碎機(jī)、OLYMPUS DP 72生物顯微鏡、RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、ZRD-A5110電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、Agilent 6890/5973 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)、Agilent 7683型自動(dòng)進(jìn)樣器、索式提取器。

1.2 試驗(yàn)試劑

無(wú)水乙醇、刺囊酸對(duì)照品(成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：17122506，純度≥98%)；超純水、磷酸、三氯甲烷、乙腈和甲醇(色譜純)、其余試劑分析純。

1.3 供試材料

大皂角和豬牙皂大、小果均采集于山東省濟(jì)寧市鄒城市，采集時(shí)間為2017年10月3日。測(cè)定其外部形態(tài)指標(biāo)后去籽，烘干粉碎，過(guò)0.25 mm孔徑篩。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 外部形態(tài)指標(biāo) 選取大皂角、豬牙皂大果及豬牙皂小果各30個(gè)，采用游標(biāo)卡尺、直尺、天平測(cè)定莢果顏色、形狀、長(zhǎng)、寬、厚、質(zhì)量，計(jì)算長(zhǎng)寬比、長(zhǎng)寬積，并對(duì)大皂角與豬牙皂外部形態(tài)之間的差異進(jìn)行分析。

1.4.2 內(nèi)部結(jié)構(gòu)指標(biāo) 將處理過(guò)的大皂角與豬牙皂橫切面的石蠟切片放于顯微鏡下觀察并記錄內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征[12]。計(jì)算大皂角的種子和豬牙皂大果種子的出籽率(種子質(zhì)量/莢果質(zhì)量×100%)，并觀察記錄種子顏色與飽滿度。

1.4.3 粗皂苷含量 大皂角與豬牙皂粗皂苷含量采用超聲波提取法測(cè)定[13]，取 20.0 g 皂角粗粉，用其5倍質(zhì)量的 70%乙醇浸泡 6 h，40 ℃超聲波提取 20 min(頻率40 kHz)，提取 3 次，共18 h；合并提取液，減壓濃縮至干，得粗皂苷(棕色)。

1.4.4 刺囊酸含量采用HPLC法測(cè)定

1.4.4.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ODS(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.5%磷酸二氫鉀溶液(72∶28,磷酸調(diào)pH值 3.2)；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL[14-18]。

1.4.4.2 刺囊酸對(duì)照品溶液制備 精密稱取干燥至恒質(zhì)量的刺囊酸對(duì)照品19.0 mg，加甲醇定容至25 mL，得到0.76 mg/mL的標(biāo)品母液，再分別配置不同濃度的標(biāo)品子液。

1.4.4.3 樣品溶液制備 稱取大皂角粉末8 g，置索式提取器中，加三氯甲烷120 mL提取至溶劑無(wú)色后，繼續(xù)加甲醇120 mL提取5 h，提取液水浴蒸干，用甲醇定量轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾后測(cè)定。

1.4.4.4 對(duì)照品線性關(guān)系考察 取各個(gè)濃度對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣10 μL，按照1.4.4.1色譜條件進(jìn)行分析，以刺囊酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得其回歸方程y=7 085.3x+31.919，R2=0.999 8，表明刺囊酸質(zhì)量濃度介于0.038～0.760 mg/mL，與峰面積呈良好線性關(guān)系。對(duì)照品與樣品溶液各進(jìn)樣20 μL進(jìn)行液相色譜分析,按外標(biāo)峰面積法計(jì)算刺囊酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 大皂角與豬牙皂外部形態(tài)特征

大皂角與豬牙皂外部形態(tài)特征見圖1—3。大皂角、豬牙皂小果及豬牙皂大果的莢果果皮屬于同一色系。大皂角為大刀形，質(zhì)地堅(jiān)硬，搖晃有響聲，外果皮為光滑的紫褐色，內(nèi)部為淺黃色，有外皮光滑、淺棕色、質(zhì)地堅(jiān)硬的橢圓形種子；大皂角兩頭尖，皂莢背縫線突起成棱脊?fàn)睢Ｘi牙皂小果為鐮刀形，質(zhì)地堅(jiān)硬而脆，容易折斷，外果皮為粗糙的紅褐色，搖晃沒(méi)有響聲。豬牙皂大果為直板形，質(zhì)地堅(jiān)硬而厚，外果皮為皮革質(zhì)的棕褐色，搖晃有響聲。

圖1 大皂角

圖2 豬牙皂小果

圖3 豬牙皂大果

大皂角與豬牙皂外部形態(tài)指標(biāo)見表1。由表1可見，大皂角、豬牙皂小果及豬牙皂大果在外部形態(tài)上具有顯著差異。大皂角的莢果長(zhǎng)、厚、質(zhì)量、長(zhǎng)寬比均為最大，與豬牙皂小果和豬牙皂大果的差異都達(dá)到極顯著水平；豬牙皂大果莢果寬最大，大皂角次之，豬牙皂小果最小，且大皂角的莢果寬與豬牙皂小果、豬牙皂大果莢果寬均具有極顯著差異；大皂角莢果長(zhǎng)寬積為最大，與豬牙皂小果長(zhǎng)寬積的差異達(dá)到極顯著水平，與豬牙皂大果長(zhǎng)寬積的差異達(dá)到顯著水平。

表1 大皂角與豬牙皂外部形態(tài)指標(biāo)

注：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，大、小寫字母分別表示差異達(dá)0.01、0.05顯著水平，下同。

2.2 大皂角與豬牙皂內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征

大皂角與豬牙皂橫切面見圖4。在顯微鏡下觀察大皂角與豬牙皂橫切面可以看出，大皂角與豬牙皂大、小果孔紋細(xì)胞壁厚且明顯，果皮表皮細(xì)胞可見氣孔。但大皂角與豬牙皂大果具有柵狀細(xì)胞，具有種子且石細(xì)胞數(shù)眾多，而豬牙皂小果比兩者偏圓且沒(méi)有柵狀細(xì)胞，不含種子且石細(xì)胞數(shù)量低于其他兩者。

從左至右依次為大皂角、豬牙皂小果、豬牙皂大果圖4 3種莢果橫切面

大皂角與豬牙皂莢果種子形態(tài)差異對(duì)比結(jié)果見圖5、圖6和表2。大皂角種子飽滿，顏色較淺，出籽率較高；豬牙皂小果無(wú)種子；豬牙皂大果種子干癟，顏色較深，出籽率低。

2.3 大皂角與豬牙皂粗皂苷和刺囊酸含量分析

大皂角與豬牙皂的粗皂苷和刺囊酸含量測(cè)定結(jié)果見表3。大皂角、豬牙皂小果、豬牙皂大果的粗皂苷含量分別為37.40%、46.70%、35.15%，大皂角與豬牙皂大、小果之間粗皂苷含量差異極顯著；大皂角、豬牙皂小果、豬牙皂大果的刺囊酸含量分別為0.37%、0.11%、0.27%，大皂角與豬牙皂大、小果之間的刺囊酸含量差異極顯著。

圖5 大皂角種子

圖6 豬牙皂大果種子表2 大皂角與豬牙皂形態(tài)指標(biāo)

莢果顏色飽滿度出籽率/%大皂角淺褐色飽滿30.2豬牙皂小果無(wú)無(wú)0豬牙皂大果深褐色干癟27.1

表3 大皂角與豬牙皂粗皂苷和刺囊酸含量 %

3 結(jié)論與討論

根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》(2015年)[3]對(duì)大皂角與豬牙皂的指標(biāo)描述及國(guó)內(nèi)外研究文獻(xiàn)，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室對(duì)藥用資源評(píng)價(jià)指標(biāo)要求，從大皂角與豬牙皂形態(tài)特征、內(nèi)部結(jié)構(gòu)和成分方面進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，其形態(tài)特征、內(nèi)部結(jié)構(gòu)和成分方面存在明顯差異。

在提取皂莢細(xì)皂苷的過(guò)程中，由于豬牙皂小果和豬牙皂大果出現(xiàn)大量膠狀類似多糖物質(zhì)，獲得細(xì)皂苷困難，因此，將粗皂苷含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。大皂角與豬牙皂的粗皂苷和刺囊酸含量具有極顯著差異[18]。粗皂苷含量依次排序?yàn)椋贺i牙皂小果>大皂角>豬牙皂大果；刺囊酸含量依次排序?yàn)椋捍笤斫?豬牙皂大果>豬牙皂小果。大皂角與豬牙皂用藥的藥效與配伍有所不同，這與二者藥用成分差異有關(guān)，其藥效關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，在山東省鄒城市5個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)分布700多株100 a以上的豬牙皂古樹，樹上不結(jié)刺、部分羽狀復(fù)葉頂端著生2個(gè)小羽狀復(fù)葉，繁育后代采用嫁接等無(wú)性繁殖方式，可以穩(wěn)定遺傳。根據(jù)大皂角與豬牙皂在形態(tài)結(jié)構(gòu)與成分等方面的差異，建議將豬牙皂作為皂莢的變種。