鄧俊琳 朱永清 陳 建 陸榮榮 夏 陳鄧海云 王嘉怡 潘姝璇 張盈嬌 高 佳

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所1，成都 610066) (四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院2，成都 610041) (四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院3，雅安 625014)

青稞(HordeumvulgareL.var.nudum Hook. F.)屬禾本科大麥屬，亦稱裸大麥，在我國(guó)主要分布于西藏、青海、四川甘孜州和阿壩州、甘肅的甘南等高海拔地區(qū)[1]。青稞適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高，病蟲害少，較少使用農(nóng)藥，是青藏高原地區(qū)農(nóng)牧民的主要食糧[2]。青稞具有高蛋白質(zhì)、高膳食纖維、低脂肪等營(yíng)養(yǎng)特點(diǎn)，適于三高人群，是每日膳食中優(yōu)質(zhì)的谷物來源。青稞中人體必需氨基酸齊全，尤其富含一般谷物中所缺乏的賴氨酸，其含量高達(dá)0.36 g/100g[1]。青稞中的β-葡聚糖含量居全球大麥之最，研究表明β-葡聚糖具有降血糖、降低總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇，對(duì)預(yù)防心血管疾病、糖尿病等有顯著作用[3-5]。青稞中富含γ-氨基丁酸，γ-氨基丁酸[C4H9NO2]是一種游離氨基酸，作為一種天然非蛋白質(zhì)氨基酸，是脊椎動(dòng)物交感神經(jīng)細(xì)胞結(jié)合點(diǎn)的抑制性神經(jīng)傳遞物質(zhì)，研究表明其具有降血壓、改善腦功能、調(diào)節(jié)激素的分泌等作用[6-7]。有報(bào)道稱，γ-氨基丁酸的合成會(huì)因缺氧、避光、熱處理或者胞質(zhì)酸化等外界環(huán)境刺激而加強(qiáng)[8]。另外，研究表明全谷物與氧化應(yīng)激相關(guān)的慢性病有密切聯(lián)系，在一定程度上有助于緩和慢性病發(fā)展，其機(jī)制可能與全谷物中的多酚成分有關(guān)[9]。多酚類化合物作為谷物中的主要抗氧化成分，被認(rèn)為是全谷物發(fā)揮作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[10]。青稞中富含類黃酮、花青素等酚類物質(zhì)，這些抗氧化物質(zhì)，可能在抗癌、抗衰老等方面發(fā)揮重要功效。

目前已有研究發(fā)現(xiàn)，谷物在萌動(dòng)過程中，其所含水分增加到一定程度時(shí)，激活處于休眠狀態(tài)的酶，使其由結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)變成游離態(tài)，從而促進(jìn)酶解作用，使谷物中的化學(xué)物質(zhì)及其含量發(fā)生不同程度的變化，對(duì)人體而言，這些變化大部分是有益的[11-12]，因此，萌動(dòng)谷物可用于制作食品、保健品和化妝品等。國(guó)外對(duì)于小麥、大麥等谷物均有萌動(dòng)研究[13]，但對(duì)青稞尚鮮見萌動(dòng)研究，國(guó)內(nèi)對(duì)青稞萌動(dòng)研究較少，僅有關(guān)于萌動(dòng)青稞中β-葡聚糖[14]和胡蘿卜素[15]的研究。青稞作為青藏高原重要的糧食作物，對(duì)其營(yíng)養(yǎng)成分的深層挖掘和充分利用有著重要意義。本實(shí)驗(yàn)對(duì)青藏高原的5個(gè)青稞品種在不同萌動(dòng)階段β-葡聚糖、γ-氨基丁酸和總多酚三種活性物質(zhì)的含量進(jìn)行研究，探索其變化趨勢(shì)以確定最佳的青稞萌動(dòng)條件，為生產(chǎn)富含功能活性物質(zhì)的萌動(dòng)青稞及其增值功能食品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 青稞樣品

康青7號(hào)(甘孜州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供)；獨(dú)立花、紫青稞(若爾蓋縣多爾瑪藏族食品有限公司提供)；藏青25號(hào)、西藏2000(西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)研究院農(nóng)業(yè)研究所提供)。收獲期均為2016年9月。

1.2 主要儀器和試劑

LHS-250HC-11型恒溫恒濕箱：上海一恒科技儀器有限公司； KH2200DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；ELX-800型號(hào)酶標(biāo)儀：美國(guó)伯騰儀器有限公司；1260型高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司；UV-6100型號(hào)紫外分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；PHS-3C型酸度計(jì)：上?？朴觾x器儀表有限公司。

Megazyme試劑盒：愛爾蘭Megazyme公司；γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純)：美國(guó)Fluka公司；乙腈、甲醇(色譜純)：美國(guó)MREDA公司；福林酚(分析純)：北京索萊寶科技有限公司；沒食子酸、磷酸二氫鉀、硼酸、氫氧化鈉、乙酸鈉、冰乙酸等(均為分析純)：成都市科龍化工試劑廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 青稞萌動(dòng)[16]

每組50.0 g完整的青稞顆粒，0.5%次氯酸鈉浸泡30 min消毒，蒸餾水洗滌5次，置于27 ℃蒸餾水浸泡6 h，每組青稞樣品分別按照相對(duì)應(yīng)的溫度和時(shí)間在培養(yǎng)皿中萌動(dòng)：在不同溫度下(15、22、30 ℃)將康青7號(hào)青稞樣品進(jìn)行萌動(dòng)處理，萌動(dòng)結(jié)束后于90 ℃干燥箱中滅酶20 min，60 ℃干燥箱中烘干至恒重，打粉過60目篩，檢測(cè)β-葡聚糖、γ-氨基丁酸和總多酚，以三種物質(zhì)的含量最高時(shí)的萌動(dòng)溫度選為最適溫度；在此最適溫度下，將5個(gè)品種的青稞樣品在不同時(shí)間下(0、15、27、39、63、87、111 h)進(jìn)行萌動(dòng)處理，滅酶、干燥、打粉、過篩，冷凍儲(chǔ)藏備用。

1.3.2 葡萄糖氧化酶-過氧化酶法(Glucose oxidase/peroxidase method，GOPOD)測(cè)定β-葡聚糖含量[17]

1.3.2.1 樣品處理

精確稱取青稞粉0.100 g于15 mL離心管中，加入0.2 mL 50%乙醇溶液，振蕩混勻，再加入4.0 mL 磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 6.5)，振蕩混勻。置于沸水浴中5 min，每隔半分鐘取出于漩渦振蕩器混勻，防止其結(jié)塊。50 ℃水浴5 min，加入0.2 mL 地衣酶(10 U)，于50 ℃恒溫水浴鍋中酶解1 h ，期間震蕩3～4次。加入5 mL醋酸鈉緩沖液(200 mmol/L，pH4.0)，混勻5 min，1 000 r/min離心 10 min，上清液即為待測(cè)樣品液。

1.3.2.2 顯色反應(yīng)

96孔板中樣品組加入7 μL樣品上清液和7 μL β-葡聚糖苷酶，樣品對(duì)照組用7 μL 50 mmol/L pH=4.0的醋酸鹽緩沖液代替β-葡聚糖苷酶，標(biāo)準(zhǔn)品組加7 μL標(biāo)準(zhǔn)液和7 μL 50 mmol/L pH=4.0的醋酸鹽緩沖液，空白組加7 μL蒸餾水和7 μL 50 mmol/L pH=4.0的醋酸鹽緩沖液，50 ℃水浴10 min。加入200 μL GOPOD混合液，50 ℃水浴20 min，用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定吸光度值。每組測(cè)定8個(gè)平行樣，重復(fù)測(cè)量2次。

1.3.2.3 結(jié)果計(jì)算

式中：ΔA為樣品組吸光度值-樣品對(duì)照組吸光度值；F為100/(標(biāo)準(zhǔn)品組吸光度值-空白組吸光度值)；Fv為總體積/mL；m為樣品質(zhì)量/mg；D為稀釋倍數(shù)為1。

1.3.3 HPLC法測(cè)定γ-氨基丁酸含量[18]

1.3.3.1 樣品處理

精確稱量青稞粉1.00 g于50 mL離心管中，加入10 mL 70%乙醇，40 ℃超聲40 min，6 000 r/min離心5 min。

1.3.3.2 樣品衍生

衍生劑配制：準(zhǔn)確稱取 20 mg鄰苯二甲醛、4 mg pH 9.5的硼酸緩沖液、1 mL甲醇和100 μL 2-巰基乙醇，混合均勻；取300 μL樣品上清液于1.5 mL離心管中，加入150 μL現(xiàn)配的衍生劑反應(yīng)4.5 min，立即加入300 μL 0.1 mol/L磷酸二氫鉀溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，立即進(jìn)樣，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量3次。

1.3.3.3 色譜條件

Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為20 mmol/L醋酸鈉，B為乙腈；流速為1 mL/min，梯度洗脫：0 min(90% A)，15 min(65% A)，20 min(10% A)，22 min(90% A)；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量10 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)332 nm。

1.3.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品，配制成0.275、0.206、0.137、0.103、0.082 4、0.068 7 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，同1.3.3.2步驟衍生并用液相測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=8 806.0X-111.1(R2=0.999)，線性范圍0.044～1.1 mg/mL。

1.3.4 福林酚法測(cè)定多酚含量[19]

1.3.4.1 樣品的處理同1.3.3.1。

1.3.4.2 顯色反應(yīng)

取100 μL提取液，加入3.0 mL蒸餾水和200 μL福林酚，混勻并放置5 min，再加入800 μL 10% NaCO3溶液，避光1 h，紫外分光光度計(jì)在765 nm測(cè)吸光值。

1.3.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

稱取0.035 1 g沒食子酸，100 mL蒸餾水定容配成351 μg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液，用不同濃度梯度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液(17.55、35.1、70.2、105.3、140.4、175.5、210.6、245.7、280.8、315.9、351 μg/mL)與福林酚顯色，于765 nm處測(cè)吸光度值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.002 9X+0.0263(R2=0.998 2)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，采用Microsoft Excel 97-2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理作圖， 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適萌動(dòng)溫度

如圖1所示，隨機(jī)選擇康青7號(hào)青稞樣品在15、22、30 ℃萌動(dòng)15小時(shí)，β-葡聚糖含量隨萌動(dòng)溫度變化不大，而γ-氨基丁酸和多酚的含量均在22 ℃萌動(dòng)時(shí)最高。因此，將最適萌動(dòng)溫度確定為22 ℃。

圖1 不同萌動(dòng)溫度下康青7號(hào)青稞的β-葡聚糖含量(a)和γ-氨基丁酸、多酚含量(b)

2.2 萌動(dòng)青稞的形態(tài)

如圖2所示，康青7號(hào)和獨(dú)立花萌動(dòng)時(shí)間早，111 h時(shí)葉芽長(zhǎng)度較長(zhǎng)；紫青稞、藏青25號(hào)和西藏2000萌動(dòng)時(shí)間晚，111 h時(shí)葉芽長(zhǎng)度較短。

圖2 五種青稞樣品在不同時(shí)間下22 ℃萌動(dòng)的形態(tài)

2.3 萌動(dòng)時(shí)間對(duì)青稞β-葡聚糖含量的影響

如圖3所示，獨(dú)立花中β-葡聚糖含量先下降后略有上升，再下降，其中，其萌動(dòng)青稞中β-葡聚糖含量顯著高于萌動(dòng)后的，這與其他四個(gè)品種的青稞有明顯區(qū)別?？登?號(hào)、紫青稞、藏青25和西藏2000有相似的變化趨勢(shì)，隨著萌動(dòng)時(shí)間的延長(zhǎng)，β-葡聚糖含量先增加后下降，且含量最高出現(xiàn)于萌動(dòng)15～63 h之間，5個(gè)品種中含量最低均出現(xiàn)于111 h。此外，5個(gè)品種中，藏青25號(hào)中β-葡聚糖含量在萌動(dòng)的各個(gè)時(shí)期，含量均顯著高于同時(shí)期萌動(dòng)的其他品種，康青7號(hào)中各個(gè)萌動(dòng)時(shí)期中含量均小于或近似于其他品種。品種間基因型不同和萌動(dòng)條件(包括溫度、時(shí)間、酸堿度、金屬離子等)不同可能是通過影響青稞中β-葡聚糖合成酶和β-葡聚糖酶活性的強(qiáng)弱，從而改變青稞中β-葡聚糖的含量[20]。

注： 小寫字母：同一品種不同萌動(dòng)時(shí)間β-葡聚糖含量的差異顯著性分析(組內(nèi))；大寫字母：同一萌動(dòng)時(shí)間不同品種β-葡聚糖含量的差異顯著性分析(組間)。
圖3 五種青稞中β-葡聚糖含量隨萌動(dòng)時(shí)間的變化

本實(shí)驗(yàn)中，不同品種的青稞經(jīng)過不同時(shí)間的萌動(dòng)，β-葡聚糖含量的變化趨勢(shì)不完全相同，但就整體而言，萌動(dòng)后比萌動(dòng)前有所減少，這一結(jié)果與燕麥和大麥[20-21]等的研究結(jié)果一致。減少的原因可能是青稞在萌發(fā)中，胚上皮層細(xì)胞分泌的赤霉酸刺激胚乳糊粉層細(xì)胞，從而合成一系列的葡聚糖酶，葡聚糖酶合成后會(huì)隨著水分而滲出，然后水解青稞細(xì)胞壁上和細(xì)胞間的葡聚糖[22]。青稞在萌動(dòng)過程中葡聚糖合成酶和葡聚糖酶共同作用，在初期葡聚糖合成酶強(qiáng)于葡聚糖酶[23]，所以藏青25號(hào)和西藏2000 的β-葡聚糖增加，但后期由于葡聚糖酶活力增強(qiáng)β-葡聚糖含量會(huì)隨萌動(dòng)時(shí)間的延長(zhǎng)而減少[24]。因此在實(shí)際生產(chǎn)中要控制萌動(dòng)時(shí)間的長(zhǎng)短，以達(dá)到其他生物活性物質(zhì)增加的同時(shí)盡量保持多含量的β-葡聚糖。

2.4 萌動(dòng)時(shí)間對(duì)青稞γ-氨基丁酸含量的影響

如圖4所示，萌動(dòng)青稞中γ-氨基丁酸在11.5 min 左右出峰，分離度較高。如圖5所示，5個(gè)品種的萌動(dòng)青稞中γ-氨基丁酸含量隨萌動(dòng)時(shí)間的延長(zhǎng)，并不完全相同，但整體上均有萌動(dòng)后γ-氨基丁酸含量高于萌動(dòng)前含量的變化，這與Ohtsubo等[25]報(bào)道的糙米萌動(dòng)后γ-氨基丁酸含量升高和曾亞文等[26]報(bào)道的大麥籽粒萌動(dòng)后γ-氨基丁酸含量增加的結(jié)果相近。由圖5可知，γ-氨基丁酸含量最高多出現(xiàn)于萌動(dòng)的中期或后期，即藏青25號(hào)含量最高在萌動(dòng)39 h，康青7號(hào)在萌動(dòng)87 h，獨(dú)立花、紫青稞和西藏2000在萌動(dòng)后的111 h。在5個(gè)青稞品種中，藏青25號(hào)和西藏2000中的各個(gè)時(shí)期，γ-氨基丁酸含量均較其他品種的高。其中，西藏2000的在萌動(dòng)111 h處，含量達(dá)到最高，為61.36 mg/100 g。鄭向華等[27]研究溫度和時(shí)間對(duì)萌動(dòng)糙米中γ-氨基丁酸含量的影響，萌動(dòng)后γ-氨基丁酸含量隨萌動(dòng)時(shí)間的延長(zhǎng)，表現(xiàn)為先增加后減少，再增加又減少，這與本次試驗(yàn)中康青7號(hào)的γ-氨基丁酸得變化一致。研究表明，γ-氨基丁酸在豌豆、黃豆、扁豆等豆類以及燕麥、小麥和蕎麥等谷物中，萌動(dòng)后含量均高于萌動(dòng)前含量[13]。此外，本實(shí)驗(yàn)中青稞萌動(dòng)后γ-氨基丁酸含量在11.7～60.32 mg/100 g，其含量遠(yuǎn)高于Hung等[28]報(bào)道的小麥經(jīng)萌動(dòng)處理(6～48 h)后的含量(3.4～16.0 mg/100 g)和Jian等[29]報(bào)道的燕麥經(jīng)萌動(dòng)(1～7 d)后的含量(5.71～20.4 mg/100 g)。γ-氨基丁酸增加的原因可能是谷氨酸脫羧酶被激活，催化谷氨酸不可逆的脫去α位上的羧基形成γ-氨基丁酸；降低的原因可能是γ-氨基丁酸在γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶的催化下和丙酮酸或α-酮戊二酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨作用生成琥珀酸半醛[28-30]。

圖4 γ-氨基丁酸對(duì)照品和青稞樣品的高效液相色譜圖譜

注：小寫字母：同一品種不同萌動(dòng)時(shí)間γ-氨基丁酸含量的差異顯著性分析(組內(nèi))；大寫字母：同一萌動(dòng)時(shí)間不同品種γ-氨基丁酸含量的差異顯著性分析(組間)。
圖5 五種青稞中γ-氨基丁酸含量隨萌動(dòng)時(shí)間的變化

2.5 萌動(dòng)時(shí)間對(duì)青稞多酚含量的影響

如圖6所示，不同品種的青稞經(jīng)過不同時(shí)間的萌動(dòng)，多酚含量的變化趨勢(shì)不完全相同。紫青稞、藏青25號(hào)和西藏2000有相似的變化趨勢(shì)，均呈現(xiàn)下降、上升、下降、再上升的趨勢(shì)，其中，分別在萌動(dòng)27 h和萌動(dòng)39 h多酚含量最高，康青7號(hào)的變化趨勢(shì)與之相反，且萌動(dòng)39 h除外，其余萌動(dòng)時(shí)間處，多酚含量均接近或高于其他品種。獨(dú)立花隨萌動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，其多酚含量先降低后略有回升。其中含量最高為康青7號(hào)萌動(dòng)87 h，250.8 mg/100 g。 本次實(shí)驗(yàn)測(cè)量的多酚含量主要是游離型總酚，多酚含量下降的原因可能是游離型多酚在浸泡過程中可以溶解到水中，同時(shí)萌動(dòng)初期多酚氧化酶活性處于較高水平，也會(huì)降解一部分多酚；多酚含量增加的原因可能與萌動(dòng)中多酚氧化酶的活性降低和羥氨基苯甲酸-N-羥基肉桂酸轉(zhuǎn)移酶(HHT)活性升高有關(guān)[31]。

注：小寫字母：同一品種不同萌動(dòng)時(shí)間多酚含量的差異顯著性分析(組內(nèi))；大寫字母：同一萌動(dòng)時(shí)間不同品種多酚含量的差異顯著性分析(組間)。
圖6 五種青稞中的多酚含量隨萌動(dòng)時(shí)間的變化

2.6 相關(guān)性分析

經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，萌動(dòng)青稞中β-葡聚糖、γ-氨基丁酸和多酚的含量變化無顯著相關(guān)性(P<0.05)。

表1 萌動(dòng)青稞中β-葡聚糖、γ-氨基丁酸和多酚的含量的相關(guān)性分析(P<0.05)

3 結(jié)論

青稞在整個(gè)萌動(dòng)過程中，β-葡聚糖、γ-氨基丁酸和多酚含量隨萌動(dòng)時(shí)間的變化在不同品種內(nèi)不完全相同，且三者的變化無顯著相關(guān)性。就整體而言，β-葡聚糖萌動(dòng)后比萌動(dòng)前含量下降，γ-氨基丁酸萌動(dòng)后比萌動(dòng)前增加，多酚含量在不同品種間變化差異較大。萌動(dòng)前，β-葡聚糖、γ-氨基丁酸和多酚在藏青25號(hào)中的含量均高于其他品種中，萌動(dòng)后，β-葡聚糖在藏青25號(hào)中的含量顯著高于同時(shí)期萌動(dòng)的其他品種，γ-氨基丁酸在藏青25號(hào)和西藏2000中的含量均較其他品種同時(shí)期的高，多酚在康青7號(hào)中含量較高。在萌動(dòng)溫度為22 ℃時(shí)，康青7號(hào)萌動(dòng)87 h、西藏2000萌動(dòng)27 h、紫青稞和藏青25號(hào)萌動(dòng)39 h，可以得到四種青稞中三類物質(zhì)較佳含量；而獨(dú)立花青稞不適合做萌動(dòng)處理。本研究為青稞的精深加工提供了借鑒。