楊世麗李海芳陳科元陳小麗唐耀馬燕梅

(1.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，福州，350002；2.福建省福州動物園，福州，350012)

動物腸道菌群在長期的進化過程中已經(jīng)演變?yōu)闄C體的正常組成部分，它們與宿主保持著緊密聯(lián)系，機體對其不產(chǎn)生免疫反應(yīng)(免疫耐受)，處于動態(tài)平衡狀態(tài)，這種平衡與宿主的多種生理功能密切相關(guān)，如促進宿主腸道發(fā)育[1]，參與宿主的營養(yǎng)和代謝[2-3]，具有免疫屏障功能[4-5]，還與延緩宿主衰老、抵抗腫瘤發(fā)生、預(yù)防腸道疾病等有復(fù)雜緊密的聯(lián)系[6]。腸道菌群組成復(fù)雜，數(shù)量龐大，研究得較多的是作為益生菌的雙歧桿菌(Bifidobacterium)和乳酸桿菌(Lactobacillus)，通過添加益生菌活菌制劑或益生元制劑等以增加腸道益生菌的數(shù)量或促進益生菌的生長[7-8]，其中益生元制劑與非消化性低聚糖(NDOs，non-digestible oligosaccharides)的協(xié)同作用成為人們的研究熱點。

非消化性低聚糖是一類促雙歧桿菌生長因子，由于其經(jīng)濟且適用性強，被較廣泛地應(yīng)用于改善消化道機能[9]。水蘇糖是一種四碳糖，存在于地靈、豆類之中，其分子結(jié)構(gòu)為果糖-葡萄糖-半乳糖-半乳糖，相對分子量666.59 g/mol，分子式為C24H42O21，分子間主要以β-1，4糖苷鍵相連，屬于非消化性低聚糖。由于哺乳動物自身胃腸道產(chǎn)生的消化酶系只能降解α-1，4糖苷鍵，因此水蘇糖經(jīng)過胃和小腸時可保持結(jié)構(gòu)完整，到達(dá)結(jié)腸后可被雙歧桿菌屬及少數(shù)乳酸桿菌的酶系統(tǒng)分解，為這些菌的增殖提供能量，同時其酵解終產(chǎn)物為短鏈脂肪酸，可降低腸道pH，具有促進有益菌增殖和抑制有害菌繁殖的作用，對機體的生理功能也有重要影響[10-11]。

獼猴(Macacamulatta)，別名猢猴、黃猴、沐猴、恒河猴、廣西猴，在動物分類學(xué)上隸屬于哺乳綱，靈長目(Primates)，猴科(Cercopithecidae)，獼猴屬。由于圈養(yǎng)環(huán)境的飼養(yǎng)管理方式與野外環(huán)境大不相同，同時存在少數(shù)游客不文明的投食行為，可能造成獼猴出現(xiàn)營養(yǎng)不均衡，腸道菌群失調(diào)的現(xiàn)象[12]。本試驗通過給福州動物園獸類表演場的獼猴飼喂水蘇糖，檢測其糞便菌群(雙歧桿菌、乳酸桿菌和大腸桿菌Escherichiacoli等)數(shù)量的變化，研究水蘇糖對雙歧桿菌、乳酸桿菌的增殖作用及對大腸桿菌的抑制作用，分析水蘇糖改善腸道微生態(tài)及促進機體健康等方面的作用。

1 材料和方法

1.1 試驗動物及分組

將福州動物園獸類表演場圈養(yǎng)的15只獼猴，分為對照組和試驗組，每組分為幼年組(年齡1.5～5歲，體重1.5～4 kg)、成年組(年齡6～15歲，體重4～15 kg)和老年組(年齡15～25歲，體重8～15 kg)，對照組每組2只，試驗組每組3只。參照人類水蘇糖的最佳口服劑量，給幼年組、成年組和老年組每天分別飼喂0.63 g、 0.85 g和1.26 g的水蘇糖(純度80%，購自河南德大化工有限公司)。對照組為空白組，不飼喂水蘇糖。飼養(yǎng)試驗為期6 周。為確保試驗的準(zhǔn)確性，采樣前3個月未向動物飼喂或注射任何可能對腸道菌群結(jié)構(gòu)造成影響的藥物及添加劑。

1.2 糞便樣品的收集及處理

每個個體分4次采集糞便樣品，每間隔2周采集1次。所有樣品在動物每次排便后30 min內(nèi)采集，采集過程嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，并用無菌采樣袋收集，標(biāo)記后立即置于采樣箱(內(nèi)置干冰)中保存，1 h內(nèi)送至實驗室，-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 糞便樣品細(xì)菌DNA提取

將凍存的每個個體的4次采集的糞便樣品，分別取200 mg作為檢測樣品并編號。提取步驟參照糞便基因組DNA提取試劑盒(購于天根生化科技(北京)有限公司)的操作說明書進行，最后用40 μL的EB溶液將DNA從吸附柱中洗脫，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 雙歧桿菌、乳酸桿菌及大腸桿菌qPCR定量分析

以提取的靈長類動物糞便基因組DNA樣品為模板，利用2×TaqMaster PCR Mix進行PCR擴增 16S rRNA 目的基因片段。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

分別將雙歧桿菌、乳酸桿菌和大腸桿菌的PCR擴增產(chǎn)物，以1.2%瓊脂糖凝膠125V電泳30 min，用凝膠成像系統(tǒng)進行成像，切下目的片段，應(yīng)用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收，操作步驟參照試劑盒使用說明?；厥蘸笕?.5 μL純化產(chǎn)物于NanoDrop-2000檢測所提DNA濃度，計算目的片段拷貝數(shù)，作為雙歧桿菌、乳酸桿菌和大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)品，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

拷貝數(shù)計數(shù)公式：

拷貝數(shù)=阿伏伽德羅常數(shù)×片段濃度/片段分子量

即：copy number(copies·μL-1)=(6.02×1023×(ng·μL-1×10-9)/(DNA length×660)

將已制備的雙歧桿菌、乳酸桿菌和大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)品繪制擴增標(biāo)準(zhǔn)曲線，對未知樣品進行qPCR定量分析。

1.5 血液樣品采集及分析

在試驗6 周結(jié)束前后對獼猴進行血樣采集，采血前禁食12 h，采血時間為9：00 。從獼猴前肢肘中靜脈采集血樣，其中2 mL 抗凝血用于測定血常規(guī)，4 mL血液分離血清測定血清生化值，并用全自動血細(xì)胞分析儀和全自動生化分析儀檢測獼猴血液生理生化指標(biāo)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

2 結(jié)果與分析

2.1 水蘇糖對獼猴腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.1.1 水蘇糖對猴腸道雙歧桿菌的影響

表2結(jié)果表明，飼喂水蘇糖的獼猴的腸道雙歧桿菌數(shù)量極顯著的提高，空白組雙歧桿菌數(shù)量未見明顯變化。在添加水蘇糖過程中，試驗組獼猴糞便中雙歧桿菌的數(shù)量第2 周時較添加前增加了4～8倍，第4 周增加了8～10倍，第6 周增加了8～13倍。0～2周雙歧桿菌快速增長，2～4 周較快增長，但增長趨于緩和。不同年齡組趨勢相似?？傮w來說，水蘇糖對獼猴腸道菌群的增長速率在2～3 周達(dá)到最大值，數(shù)量增加10倍以上，3～6周雙歧桿菌增勢放緩，數(shù)量趨于穩(wěn)定，達(dá)到109數(shù)量級。

2.1.2 水蘇糖對獼猴腸道乳酸桿菌的影響

表3結(jié)果分析可知，試驗組0～6 周乳酸桿菌數(shù)量差異明顯。總體來說乳酸桿菌增加了2～4倍?？瞻捉M乳酸桿菌數(shù)量無明顯變化。

2.1.3 水蘇糖對獼猴腸道大腸桿菌的影響

表4結(jié)果表明，試驗組0～6 周大腸桿菌數(shù)量減少極顯著。與添加水蘇糖前對比，試驗組大腸桿菌降低了4～8倍?？瞻捉M試驗期間未見明顯變化。

2.1.4 水蘇糖對獼猴糞便外觀變化的影響

試驗期間觀察獼猴糞便外觀形狀的變化(圖1)，由飼喂水蘇糖6周前后的對比結(jié)果可知，獼猴糞便的形狀、顏色、水分含量均有明顯的變化。未飼喂水蘇糖前，有的獼猴排便次數(shù)多、糞便不成形以及部分獼猴肛周有糞便，有的獼猴排便次數(shù)少、排便困難、糞便干結(jié)甚至有便秘現(xiàn)象。試驗過程中這些情況逐漸改變，試驗結(jié)束時獼猴排便正常，糞便外觀黃色，呈疏松條狀。這些改變都表明獼猴腸道功能得到了改善。

表2 糞便雙歧桿菌qPCR檢測結(jié)果

Tab.2 Bifidobacterium qPCR test results in the fecal

注：同行肩標(biāo)相同小寫字母者差異顯著(P<0.05)，同行肩標(biāo)相同大寫字母者差異極顯著(P<0.01)。下同

Note：The same lowercase superscript letters mean significant difference in the same line(P<0.05)，and uppercase letters indicate very significant difference(P<0.01).The same as below

表3 糞便乳酸桿菌qPCR檢測結(jié)果

Tab.3 Lactobacillus qPCR test results in the fecal

表4 糞便大腸桿菌qPCR檢測結(jié)果

Tab.4 E.coli qPCR test results in the fecal

圖1 獼猴糞便外觀Fig.1 Macaques feces appearance(a.Before the test；b.After the test)

2.2 水蘇糖對獼猴血液生理生化指標(biāo)的影響

2.2.1 水蘇糖對獼猴血細(xì)胞含量的影響

由表5得出，在給獼猴飼喂水蘇糖后，獼猴血液紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞有顯著增加(P<0.05)。其他指標(biāo)都有少許增加(單核細(xì)胞減少外)，但差異不顯著(P>0.05)。

表5 獼猴血細(xì)胞含量

Tab.5 Cell levels in macaque blood

2.2.2 水蘇糖對獼猴血液肝功能生化指標(biāo)的影響

由表6得出，在水蘇糖添加前后獼猴血液總蛋白、白蛋白、腺苷脫氨酶和血鈣等指標(biāo)有顯著提高(P<0.05)。谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量減少極顯著(P<0.01)。血清總膽紅素、間接膽紅素、谷草轉(zhuǎn)氨酶及堿性磷酸酶都有減少，但差異不顯著(P>0.05)。

表6 獼猴血液肝功能生化水平

Tab.6 Liver function biochemical levels in macaque blood

2.2.3 水蘇糖對獼猴血液腎功能指標(biāo)及離子的影響

由表7得出，在水蘇糖添加前后獼猴血液尿素含量降低極顯著(P<0.01)，且鈣含量顯著升高(P<0.05)。鎂、磷及K+、Na+、Cl-無顯著變化(P>0.05)。

表7 獼猴血液腎功能生化水平

Tab.7 Kidney function biochemical levels in macaque blood

2.2.4 水蘇糖對獼猴血液蛋白質(zhì)、脂類和糖類代謝指標(biāo)的影響

由表8得出，在水蘇糖添加前后獼猴血液載脂蛋白、膽固醇、甘油三酯、HDL膽固醇指標(biāo)有顯著提高(P<0.05)。載脂蛋白B、脂蛋白aLp(a)無明顯變化(P>0.05)。LDL膽固醇有所升高，但不顯著(P>0.05)。血液葡萄糖含量有所提高，但效果不顯著(P>0.05)。

表8 獼猴血液脂類和糖類水平

Tab.8 Lipid and sugar levels in macaque blood

2.3 討論

2.3.1 水蘇糖對獼猴腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

給獼猴飼喂6周的水蘇糖后，檢測獼猴糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌及大腸桿菌的數(shù)量，結(jié)果表明，試驗組雙歧桿菌在1～2周增長顯著(P<0.01)，3～6周增長趨勢緩慢，不同年齡段均有增加，菌群數(shù)量增加了10倍以上，最終可達(dá)109CFU/g以上。成年體及老年體增長數(shù)量較幼年體較少，但與空白組對比均有極顯著的增長(P<0.01)。試驗結(jié)果與高鵬等[13]研究水蘇糖對人類腸道菌群影響的結(jié)果基本相似，與舒國偉等[14]報導(dǎo)水蘇糖等低聚寡糖體外增菌試驗(增菌效率為40倍)結(jié)果有顯著差異，這可能與體內(nèi)試驗時動物腸道菌群之間的相互作用有關(guān)。乳酸桿菌在試驗期間增長趨勢比雙歧桿菌慢，但0～6 周不同年齡段均有2～4倍的數(shù)量變化，前后差異明顯(P<0.05)，這與王利紅等[15]的水蘇糖對酸乳增菌效果的研究結(jié)果一致。大腸桿菌數(shù)量在試驗期間不同年齡段均有顯著減少(P<0.05)，飼喂6 周后大腸桿菌數(shù)量降至106～107CFU/g，這可能與飼養(yǎng)試驗周期較短，腸道菌群之間的相互作用有關(guān)。試驗結(jié)果表明，水蘇糖作為非消化性低聚糖能夠到達(dá)消化道后端，并被雙歧桿菌等有益菌分解利用，對雙歧桿菌有顯著的增殖作用，有利于調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的結(jié)構(gòu)，促進有益菌增殖，抑制有害菌在腸道內(nèi)定植和繁殖，促進機體的腸道健康。

2.3.2 水蘇糖對獼猴血液生理生化指標(biāo)的影響

給獼猴飼喂6周的水蘇糖后，分析其血液生理生化指標(biāo)的變化，結(jié)果顯示，獼猴血液紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血液總蛋白、白蛋白、腺苷脫氨酶、載脂蛋白、膽固醇、甘油三酯、HDL膽固醇和血鈣等指標(biāo)有顯著提高(P<0.05)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量減少極顯著(P<0.01)，這與Mansour等、張紅梅、易中華等[16-18]的研究結(jié)果相近，但獼猴血液膽固醇、甘油三酯、HDL膽固醇也顯著提高，這與以上研究結(jié)果不同。在查閱了福州動物園建立的獼猴血液生理生化指標(biāo)庫，對比人類血液生理生化指標(biāo)后，發(fā)現(xiàn)在現(xiàn)有飼養(yǎng)條件下，大多數(shù)獼猴血液膽固醇、甘油三酯、HDL膽固醇指標(biāo)都處于人類指標(biāo)的最低臨界值水平，這可能與獼猴在現(xiàn)有飼養(yǎng)條件下長期素食，造成的營養(yǎng)不良有較大的關(guān)系。因此在飼喂水蘇糖后獼猴腸道菌群結(jié)構(gòu)改善，促進了機體營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，導(dǎo)致獼猴血液脂類指標(biāo)的上升。綜上，水蘇糖可以顯著地影響血液膽固醇、甘油三酯等脂類在體內(nèi)的代謝，對鈣也有良好的促進吸收作用，因此水蘇糖可以通過改善獼猴腸道菌群結(jié)構(gòu)，促進機體營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收，提高獼猴的免疫機能和抗病能力。