黃開明，趙立欣，馮 晶，姚宗路，于佳動，羅 娟

（農業(yè)農村部規(guī)劃設計研究院，農業(yè)農村部農業(yè)廢棄物能源化利用重點試驗室，北京 100125）

0 引 言

中國是農業(yè)大國，農作物秸稈資源豐富、種類多樣。其中，玉米秸稈年產量約為3.2億t，合1.6億t標準煤[1-3]。然而，每年產生的巨量玉米秸稈除了一小部分被用于造紙、紡織、基料、飼料和肥料外，每年約有1億t玉米秸稈被就地廢棄，這不僅造成了資源的嚴重浪費，而且還會帶來嚴重的環(huán)境污染[4]。以玉米秸稈為原料進行厭氧消化，不僅可以解決玉米秸稈因焚燒等處理方式所帶來的環(huán)境污染問題，還可以為各類沼氣工程的運行提供大宗原料來源。但玉米秸稈中含有大量難降解的纖維素、半纖維素和木質素，不易被厭氧微生物所降解和利用，成為制約玉米秸稈為原料生產沼氣的一個瓶頸[5]。

玉米秸稈有著致密的組織結構，抗分解能力強，在自然條件下，往往需要很長時間才能被分解，因此如何加速玉米秸稈腐解，使其無害化、資源化，已成為國內外研究的一個熱點[6-7]。綜合比較各種技術，利用微生物產生纖維素酶來分解和轉化纖維素，被認為是纖維素利用的一個有效途徑[8]。要利用玉米秸稈為原料厭氧發(fā)酵生產沼氣，首先需對玉米秸稈進行預處理，以解決玉米秸稈水解酸化問題。目前，國內外對玉米秸稈預處理的研究主要集中在擠壓、粉碎、揉搓、蒸汽爆碎、化學制劑處理等幾個方面[9]。但利用這些預處理方法處理玉米秸稈，存在能耗高、水耗大，易造成二次污染等諸多實際問題。和這些技術相比，生物預處理具有一定的優(yōu)勢，生物預處理是利用具有生物活性的酶、單一菌株降解玉米秸稈，此方法具有使用能耗低、條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)點[10-13]。但生物酶、單一菌株往往只能降解玉米秸稈中的個別成分，降解效果并不十分理想。為此人們將目光轉向復合菌系，希望利用復合菌系中不同微生物之間的協同作用，實現含纖維素、半纖維素和木質素類物質的高效轉化與利用[14-19]。

目前，研究較多的可降解農作物秸稈的微生物有黑曲霉（Aspergillus）、木霉（Trichoderma）、草酸青霉（Penicillium）和白腐真菌等[8]。黑曲霉、木霉、草酸青霉、白腐真菌分別為可利用不同底物如葡萄糖、丁酸、丙酸等碳水化合物高效降解纖維素和半纖維素的菌株。李硯飛等利用白腐真菌和木霉預處理玉米秸稈產沼氣研究，玉米秸稈中木質素質量分數由未處理秸稈的15.2%降低為 7.4%，纖維素質量分數由 31.2%降低到20.1%，產氣量比未經預處理秸稈提高11.95%[20]；張瑞等利用灰綠草酸青霉、米根霉、白腐菌、黃曲霉和螺孢菌預處理15 g的小麥秸稈，并投入沼氣罐中，在37 ℃條件下，進行30 d的厭氧發(fā)酵產氣研究，較空白對照組提升了181%[19]。

黑曲霉、木霉和草酸青霉都可分泌纖維素酶，這是一種復合酶，由外切β-葡聚糖酶、內切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等組成，這3種酶共同作用把纖維素降解成葡萄糖；黑曲霉、木霉和草酸青霉降解半纖維素的酶主要也有3種酶：內切酶、外切酶和糖苷酶，這3種酶把半纖維素降解為單糖和糖醛酸[14]；白腐真菌是目前發(fā)現能同時分解植物聚合物的少數微生物之一，因能產生分解木質素的過氧化物酶，所以它能分解秸稈中的纖維素和木質素，且降解木質素的能力優(yōu)于降解纖維素的能力[15]。本文利用黑曲霉、木霉、草酸青霉和白腐真菌 4株菌發(fā)酵底物的互補性，以期提高玉米秸稈的轉化效率，對其進行混合培養(yǎng)，構建了高效產乙酸復合菌系HK-4，通過優(yōu)化其混合培養(yǎng)條件，并將其應用于沼氣厭氧發(fā)酵領域，以期實現玉米秸稈的高效利用與轉化，為玉米秸稈的資源化利用及農業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米秸稈：取自河北省張家口市農場，自然晾干，粉碎至粒徑為0.7～1 cm，測得總固體TS（total solid）為89.63%，室溫儲藏備用。

玉米秸稈前處理微生物為黑曲霉（ACCC 30171）、木霉（ACCC 31490）、草酸青霉（ACCC 32576）、黃孢原毛平革菌（CICC 40299），其中，黑曲霉、木霉和草酸青霉購于中國農業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ACCC），黃孢原毛平革菌購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）；牛糞取自河北省三河市華夏畜牧。試驗原料和接種物基本性質見表1。

表1 試驗原料和接種物基本性質Table 1 Basic properties of experimental materials and inoculating substances

1.2 反應儀器裝置

試驗的整個過程分為微生物預處理階段和厭氧發(fā)酵產沼氣階段，2個階段在2個不同的裝置內進行。微生物預處理試驗階段試驗裝置選用容積為2 L廣口瓶，管口用無菌過濾透氣封口膜密封，橡皮筋勒緊瓶口，固定在搖床中，在28 ℃、180 r/min的條件下進行試驗；厭氧發(fā)酵產沼氣階段試驗選用容積為750 mL的廣口瓶，發(fā)酵裝置固定在恒溫水池中，38 ℃靜置培養(yǎng)。

SW-CJ-2FD超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）、BSA124S萬分之一電子分析天平（梅特勒托利多儀器有限公司）、DZF-6050干燥箱（上海索普儀器有限公司）、QYC-2102C生物培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）、YXQ-LS-50S立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊儀器有限公司）、DR/5000紫外可見光分光光度計（上海元析儀器有限公司）、便攜式pH計（SX-610，上海三信）、便攜式沼氣成分分析儀（Biogas check，Geotech，英國）、ANTOM 220型纖維素分析儀（北京正方興達科技發(fā)展有限公司，中國）。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：稱取39 g固體的培養(yǎng)基粉末（DifcoTM Potato Dextrose Agar，BD公司）溶于1 L水中，121 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L、蛋白胨 0.5 g/L、麩皮浸出液20 g/L、硫酸銨1.4 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、氯化鈣0.3 g/L、硫酸亞鐵0.005 g/L、硫酸錳0.001 6 g/L、硫酸鋅 0.001 4 g/L、氯化鈷 0.002 g/L，蒸餾水定容到1 000 mL（pH 值 6.8±0.2）[12]。

1.3.2 菌劑的制備

孢子懸浮液的制備：將以上菌種活化后移至PDA平板上，于28 ℃培養(yǎng)4～6 d，長滿孢子后，用無菌生理鹽水將孢子沖洗至三角瓶中，三角瓶中加入滅菌玻璃珠，在200 r/min的振蕩器中震蕩30 min，取出，利用血球計數板計數，利用無菌蒸餾水調整至每種菌種的孢子數在108mL-1。復合菌劑的制備：將以上菌種的孢子懸浮液按照體積比為1:1:1:1的比例進行混配，制成復合微生物菌系HK-4，復合微生物菌系每種真菌孢子數為108CFU/mL[13]。

1.4 試驗設計

復合微生物菌系HK-4生長曲線與發(fā)酵液pH值測定試驗，在2 L廣角瓶中加入400 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，無菌透氣封口膜密封，橡皮筋扎緊瓶口，于121 ℃滅菌15 min，每個三角瓶接種菌液10 mL，設置3個重復，在28 ℃恒溫條件下 190 r/min震蕩培養(yǎng)15 d，接種后每天測定發(fā)酵液的光密度（OD600）和pH值。

復合微生物菌系 HK-4預處理玉米秸稈試驗設置微生物預處理組和空白對照組。在2 L廣角瓶中加入400 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，無菌透氣封口膜密封，橡皮筋扎緊瓶口，于121 ℃滅菌15 min；將玉米秸稈（0.7～1 cm）30 g，置于1 000 mL的廣口瓶中，橡皮筋扎緊瓶口，于121 ℃滅菌15 min，冷卻至室溫后，在超凈工作臺中進行混配操作。其中，微生物預處理組將滅菌玉米秸稈加入到滅菌培養(yǎng)基中，每個三角瓶接種菌液10 mL；空白對照組將滅菌玉米秸稈加到滅菌培養(yǎng)基中，2組試驗每個處理組有3次重復。在28 ℃恒溫條件下 190 r/min震蕩培養(yǎng)15 d。接種后每天測定菌液生長量可溶性化學需氧量、可溶性糖含量及總糖含量；每3天測定纖維素、半纖維素和木質素的殘余量[14]。

厭氧發(fā)酵產沼氣階段的試驗原料為微生物預處理過的玉米秸稈、以及未經復合微生物菌系HK-4處理的玉米秸稈，2種秸稈分別撈出，放置烘箱中，110 ℃烘干至恒質量，各稱取20 g；新鮮牛糞和秸稈，秸稈∶牛糞=3:1，TS為10%，發(fā)酵溫度為38 ℃，加水調節(jié)有效體積為0.8 L，進行32 d中溫厭氧消化批次試驗。同時設置未預處理玉米秸稈和牛糞混合組[15]。每組試驗設 3個平行，厭氧消化過程中每天記錄產氣量和氣體成分，每天測定發(fā)酵液的pH值和產氣量等指標。

1.5 分析方法

TS、VS測定參照美國 APHA方法[16]。采用紫外分光光度法測定發(fā)酵液的光密度（OD600），使用便攜式 pH計監(jiān)測發(fā)酵過程的pH值；采用排水集氣法收集氣體，每天定時記錄量筒測量管中排出的水量，即沼氣產量（mL）；使用便攜式沼氣成分分析儀測定沼氣中的甲烷體積分數（%）；溶解性化學需氧量（soluble chemical oxygen demand，sCOD）的測定采用酸化水解液在4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液用COD測定儀測定；可溶性糖測定選用蒽酮硫酸法、總糖測定選用DNS法；纖維素、半纖維素、木質素采用范式洗滌法。

基礎數據處理、顯著性差異分析基于Microsoft Office 2003軟件平臺。

2 結果與分析

2.1 微生物預處理

2.1.1 復合微生物菌系HK-4生長曲線與發(fā)酵液pH值

由圖1可見，接種后，復合菌系HK-4的生長大致分為3個生長階段，即快速增加、穩(wěn)定和降低3個階段性生長階段。其中，第 0～5 d，曲線斜率最大，這一階段復合菌系HK-4處于對數生長期，OD600值達到1.71，說明該復合菌系適應能力很強，細胞代謝旺盛，生物量增加量較快；第5～12 d，復合菌系生長進入緩慢増長的穩(wěn)定期，增殖速度較第0～5 d時降低，OD由1.71緩慢增長到 2.31；12 d以后，可能由于發(fā)酵培養(yǎng)基中復合菌系HK-4種間及種內競爭的原因，加劇了食物競爭、環(huán)境競爭、空間競爭，復合菌系進入衰弱期，OD600值逐漸下降[17]。復合菌系培養(yǎng)液的pH值呈現先下降后升高的趨勢，經過4 d的發(fā)酵，發(fā)酵液pH值由初始值7.96下降至6.79左右，表明復合菌系HK-4發(fā)酵初期產生酸類物質，使pH值快速降低，5 d后發(fā)酵液的pH值穩(wěn)步提高到7.8左右，13 d時，pH值穩(wěn)定在8.1左右，整個微生物預處理過程中，pH值在6.79～8.28間浮動，表明復合菌系HK-4具有良好的pH值自我調節(jié)能力和穩(wěn)定性，不會造成系統酸化現象[18]。

圖1 復合微生物菌系HK-4生長曲線與發(fā)酵液pH值Fig.1 Growth curve and pH value of compound microbial strain HK-4

2.1.2 復合微生物菌系 HK-4預處理玉米秸稈發(fā)酵液sCOD的動態(tài)變化

復雜有機物在厭氧消化過程中，各類揮發(fā)性有機酸是主要的代謝中間產物，也是完成產甲烷過程的重要前體基質。本研究所得復合微生物菌系HK-4預處理玉米秸稈發(fā)酵液sCOD的變化趨勢如圖2所示。結果表明，培養(yǎng)的前4 d，培養(yǎng)體系的可溶性化學需氧量呈逐漸降低的趨勢。復合微生物接種初期，玉米秸稈中的可溶性有機物和培養(yǎng)基成分使得初始可溶性化學需氧值較高，達到8 210 mg/L；接種復合菌系后，微生物快速繁殖將培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質快速消耗，使得可溶性化學需氧量迅速減小，接種第1 天便迅速降低至6 467 mg/L，到第4 天，降低至4 823 mg/L，呈現出單邊下降的趨勢，且下降速率較快。另外，隨著發(fā)酵時間的延長，由于微生物的呼吸作用，底物降解過程中產生的酸會被轉化成 CO2，從體系中排除，最終也會導致可溶性化學需氧量的下降[18]。第4～15 天，培養(yǎng)體系的可溶性化學需氧量趨向于平穩(wěn)，此階段培養(yǎng)體系中易于降解的可溶性有機物基本降解掉，培養(yǎng)體系中的微生物通過產生胞外酶釋放到培養(yǎng)體系中，作用于玉米秸稈，使得秸稈中的纖維素、半纖維素、木質素等難降解的有機物降解成可溶性多糖，菌液中的復合菌系將其利用掉，從而形成這一階段的 sCOD呈現出總體平穩(wěn)，波浪往復的可溶性化學需氧量變化情況[18]。

圖2 復合微生物菌系HK-4預處理玉米秸稈發(fā)酵液可溶性化學需氧量動態(tài)Fig.2 Dynamics of soluble COD in pretreatment of corn straw fermentation with composite microbial strain HK-4

2.1.3 復合微生物菌系 HK-4預處理玉米秸稈發(fā)酵液可溶性糖含量及總糖含量的動態(tài)

由圖3可知，復合微生物菌系HK-4預處理玉米秸稈發(fā)酵液可溶性糖含量呈波浪形變化趨勢，發(fā)酵培養(yǎng)第 3天，可溶性糖質量濃度升高至9.71μg/mL，隨后迅速降低，然后呈波浪形降低趨勢，培養(yǎng)15 d結束時，發(fā)酵液可溶性糖質量濃度為1.48μg/mL；復合微生物菌系HK-4發(fā)酵液總糖含量隨著預處理進行逐漸降低，3 d后趨于穩(wěn)定。這是由于在發(fā)酵過程中的0～10 d，復合菌系HK-4中的組成菌株發(fā)生交替生長發(fā)酵，協同分解玉米秸稈底物，將其降解成可溶性糖，可溶性糖又被復合菌系利用，從而發(fā)酵液中的可溶性糖含量呈現出先上升，然后波浪狀上下波動的形態(tài)，預處理第10～15 天期間，由于易于降解的纖維素、半纖維素成分基本降解完成，加之復合菌系也由穩(wěn)定期逐漸進入凋亡期，代謝產物積累，菌種活力下降，因此，這一階段的發(fā)酵液總糖含量呈現下降趨勢。發(fā)酵第3天總糖質量濃度由初始值0.49 mg/mL降低至0.16 mg/mL，之后的第3～15天趨于穩(wěn)定。復合微生物菌系HK-4將玉米秸稈分解過程中產生的糖逐漸消耗，而隨著培養(yǎng)時間的延長易分解的纖維素物質越來越少，最終導致總糖濃度趨于穩(wěn)定[20]。

圖3 復合微生物菌系HK-4預處理玉米秸稈發(fā)酵液可溶性糖質量濃度及總糖質量濃度的動態(tài)Fig.3 Dynamics of soluble sugar concentration and total sugar mass concentration in corn straw fermentation broth pretreated by composite microbial strain HK-4

2.1.4 復合微生物菌系 HK-4預處理玉米秸稈木質纖維素降解過程分析

由圖4可知，復合微生物菌系HK-4預處理過程中木質素、纖維素、半纖維素的含量都呈現出減少。從結構角度來看，木質素是由對羥苯基丙烷、愈創(chuàng)木基丙烷和紫丁香基丙烷 3種單體組成的復雜芳香族高聚體[21]，屬于非水溶性難降解物質，說明復合微生物菌系產生了能夠降解木質素的胞外酶，作用于玉米秸稈；纖維素是由D-吡喃葡萄糖環(huán)彼此經β-1，4-糖苷鍵，以 C1椅式構象聯結而成的線形高分子化合物，具有很高的結晶度和聚合度，同時還被木質素包裹著，與纖維素相比，半纖維素結構較簡單，由木糖、甘露糖和半乳糖等組成[22]，屬于比較容易降解的物質，說明復合微生物菌系產生了能夠降解纖維素、半纖維素和木質素的胞外復合酶系，作用于玉米秸稈。李硯飛等利用白腐菌和木霉菌組成的復合菌進行玉米秸稈微生物預處理，纖維素的降解率為35.6[23]；姜潔等利用白腐真菌預處理玉米秸稈，纖維素的降解率為58.5%[12]。而本試驗研究，微生物預處理組預處理纖維素降解率為64.52%，半纖維素降解率為51.06%，而木質素較難被厭氧微生物利用，它的降解率為3.89%。

圖4 復合微生物菌系HK-4預處理玉米秸稈纖維素、半纖維素和木質素的含量Fig.4 Content of cellulose, hemicelluloses and lignin in corn straw treated by composite microbial strain HK-4

2.2 復合微生物菌系HK-4預處理玉米秸稈對產氣的影響

2.2.1 產氣潛力

由圖5可以看出，玉米秸稈復合微生物菌系HK-4預處理組和空白對照組厭氧發(fā)酵產沼氣階段，氣潛力差別較大。復合微生物菌系HK-4預處理組和未處理組分別在厭氧發(fā)酵第4天及第8天進入產氣高峰，峰值分別為287和249 mL/d，產氣主要集中在第4～24 天及第6～21 天之間，產氣高峰期，復合微生物菌系HK-4預處理組的日產氣量維持在 280 mL/d，未處理組日產氣量維持在240 mL/d水平。另外，復合微生物菌系HK-4預處理組產氣過程中呈現出多個不規(guī)則產氣高峰，原因可能是由于發(fā)酵過程中，當揮發(fā)性脂肪酸酸(volatile fatty acids)的產生速度大于其消耗速度時，導致揮發(fā)性脂肪酸累積，從而影響了原料的產氣效果，之后隨著VFA的消耗，解除了揮發(fā)酸所產生的抑制，復雜有機物逐漸被厭氧菌群消化，產氣能力恢復，產氣量升高[24]。但由于復雜有機物降解難易程度不同，當大分子有機質水解、產酸的速率與產甲烷速率不能保持平衡時，則造成沼氣日產氣量呈現上下起伏狀的變化[25]。

圖5 厭氧發(fā)酵日產氣量Fig.5 Anaerobic fermentation of daily gas production

經復合微生物菌系 HK-4預處理組和未經處理的玉米秸稈與牛糞混合厭氧消化32 d，累積產氣量（見圖6）分別為7 364和5 347 mL，差異極顯著（P＜0.01＝；單位干質量產氣量為294.6和213.9 mL/g。李硯飛等利用白腐菌和木霉菌組成的復合菌進行玉米秸稈微生物預處理，產氣量可比未經預處理秸稈的產氣量提高11.95%[23]；萬楚筠等利用包含有枯草芽胞桿菌（Bacillus Subtilis）、地衣芽胞桿菌（Bacillus Licheniformis）、克魯斯酵母菌（Canadian krusei）、變色栓菌（Trametes versicolor）和黃孢原毛平革菌（Phaerochaete chrysosporium）等微生物菌種的秸稈高效降解混合菌劑處理油菜秸稈，發(fā)現預處理后的秸稈累計產氣量提高了17.8%[26]。本研究微生物預處理組比未處理組高了27.4%，產氣高峰期甲烷體積分數提高了33%，效果明顯。此外，由圖6也可看出微生物預處理組產氣量在厭氧消化前24天增長迅速，24 d之后逐漸變慢，表明產氣高峰結束。由此可見，復合微生物菌系HK-4預處理過的玉米秸稈累積產氣量明顯提高，消化速率也得到大幅提升。

2.2.3 產氣甲烷含量

各試驗組日產甲烷體積分數變化如圖 7所示。在厭氧消化過程中，2個試驗組甲烷體積分數的波動規(guī)律基本一致，都呈現出先緩慢增加后趨于穩(wěn)定的趨勢[24]。復合微生物菌系HK-4預處理組，厭氧消化的第4天，CH4體積分數就快速提升到40%以上，之后20 d在45%～53%之間波動，說明此時段營養(yǎng)物質充足，消化體系內甲烷菌的活性得到了很大的提升。而未預處理組測得的 CH4含量相對較低，到第6天才升到36.7%以上，之后20 d，基本在26%～36%之間變動，隨后開始下降。與復合微生物菌條HK-4預處理組相比，空白對照組發(fā)酵產氣速率增長緩慢，原料轉化及甲烷產生率低，秸稈利用效率差[27]。

圖6 厭氧發(fā)酵累積產氣量Fig.6 Accumulative gas production in anaerobic fermentation

圖7 厭氧發(fā)酵甲烷含量動態(tài)Fig.7 Methane content dynamics in anaerobic fermentation

3 結 論

玉米秸稈經復合微生物菌系HK-4在28 ℃處理14 d，纖維素、半纖維素和木質素的降解率分別可達64.52%、51.06%和3.89%，對復合微生物菌系HK-4處理過的玉米秸稈進行厭氧發(fā)酵產沼氣研究，發(fā)現復合微生物菌系HK-4預處理過的玉米秸稈厭氧發(fā)酵產沼氣，累積產氣量明顯提高，經過 32 d的厭氧發(fā)酵，累積產氣量提高了27.4%，產氣高峰期甲烷含量提高了33%。

綜上，復合微生物菌系 HK-4對玉米秸稈中的纖維素、半纖維素擁有很好的水解效果，實現了在較低溫度下獲得較高的秸稈降解率，使用復合微生物菌系HK-4預處理過的玉米秸稈用于厭氧發(fā)酵產沼氣，可有效提高日產氣量及甲烷含量，是一種經濟高效的預處理方法，為寒區(qū)秸稈資源化利用提供了新的微生物資源和方法。

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