江艷華，許東勤,2，姚 琳，李風(fēng)鈴，朱文嘉，郭瑩瑩，張 媛，王聯(lián)珠※

（1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266071；2. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；3. 獐子島集團(tuán)股份有限公司，大連 116001）

0 引 言

水產(chǎn)品因其味道鮮美和高營養(yǎng)價(jià)值深受廣大消費(fèi)者的青睞，然而，由于特殊的生長環(huán)境以及加工過程中與其他物品的接觸，水產(chǎn)品不可避免地存在微生物的污染。水產(chǎn)品具有高水分、高蛋白等營養(yǎng)特點(diǎn)，如果儲(chǔ)存不當(dāng)，其中的微生物往往會(huì)滋生，從而導(dǎo)致產(chǎn)品腐敗，縮短貨架期，如果污染了食源性致病菌，會(huì)對(duì)人類健康造成嚴(yán)重危害，對(duì)國家造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。尤其像三文魚等主要以生食為主的海產(chǎn)品，更是高風(fēng)險(xiǎn)的食品[1]。因此，水產(chǎn)品的安全控制與防腐保鮮尤為重要。

目前，水產(chǎn)品中常用的抑菌劑包括茶多酚、殼聚糖、ε-聚賴氨酸、乳酸鏈球菌素（nisin）、雙乙酸鈉、山梨酸鉀等[2]，這些抑菌劑抑菌機(jī)理各不相同，單獨(dú)使用并不能達(dá)到最佳效果，尤其在控制某種致病菌方面靶向性差。噬菌體（bacteriophage或phage）的發(fā)現(xiàn)及其在食品中的應(yīng)用，豐富了抑菌劑的種類，更為食品安全提供了一種安全、高效和靶向性強(qiáng)的生物抑菌劑[3]。噬菌體是細(xì)菌的病毒，在自然界中含量豐富，其中裂解性噬菌體在繁殖過程中能裂解并殺死宿主菌。2006年美國食品藥品管理局批準(zhǔn)了一種噬菌體混合物作為食品添加劑用于李斯特氏菌的控制[4]，此后，噬菌體在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用報(bào)道越來越多[5-12]。然而，噬菌體的宿主特異性限制了其應(yīng)用范圍，有研究報(bào)道表明，噬菌體與其他抑菌劑復(fù)配比二者單一使用能更有效地控制病原菌，同時(shí)還可抑制其他腐敗菌的生長，達(dá)到對(duì)食品防腐保鮮的作用[13-15]。

沙門氏菌（Salmonella）是重要的食源性致病菌之一，能引起人類急性腸胃炎，出現(xiàn)腹瀉、腹痛、發(fā)燒和嘔吐等癥狀，其中引起食物中毒的主要為鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌[16]。沙門氏菌在環(huán)境中廣泛存在，畜禽肉、蛋、水產(chǎn)品等都可能攜帶該菌，因此，沙門氏菌是多數(shù)食品必檢項(xiàng)目，并被規(guī)定不得檢出。在中國，由沙門氏菌引起的微生物中毒事件位居第二，但導(dǎo)致的發(fā)病人數(shù)最多[17]。本研究以沙門氏菌作為靶致病菌，通過篩選能與噬菌體SLMP1復(fù)配的抑菌劑，并將復(fù)配抑菌劑應(yīng)用于生三文魚中，評(píng)價(jià)其對(duì)沙門氏菌和腐敗的控制效果，以期為水產(chǎn)品的質(zhì)量安全控制提供新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

沙門氏菌為鼠傷寒沙門氏菌（SalmonellaTyphimurium），購自美國典型微生物保藏中心，編號(hào)為 ATCC14028。

噬菌體SLMP1由本實(shí)驗(yàn)室從貝類樣品中分離得到，能裂解鼠傷寒沙門氏菌和部分腸炎沙門氏菌，前期對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了分析[18]。

1.1.2 樣品

生三文魚購自青島當(dāng)?shù)爻?，試?yàn)前測(cè)定樣品中沙門氏菌的污染情況，無沙門氏菌檢出方可用于試驗(yàn)。在低溫條件下無菌操作將樣品切成約3 cm×5 cm的片狀（約10 g），備用。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑

營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽酸鈉（xylose lysine deoxycholate，XLD）瓊脂、磷酸鹽緩沖液，北京陸橋生物技術(shù)有限公司；營養(yǎng)瓊脂半固體培養(yǎng)基，為營養(yǎng)肉湯中添加 0.75%瓊脂配制而成；殼聚糖（脫乙酰度80.0%~95.0%）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；ε-聚賴氨酸（純度≥95%），浙江銀象生物技術(shù)有限公司；乳酸鏈球菌素（nisin，活力>1 000 IU/g），浙江銀象生物技術(shù)有限公司；茶多酚（多酚含量≥98%），天津希恩思生化科技有限公司；雙乙酸鈉、山梨酸鉀（純度99%），阿拉丁生化科技股份有限公司；EDTA（乙二胺四乙酸二鈉），純度>99%，索萊寶科技有限公司；三氯乙酸、硼酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；SM緩沖液（5.8 g NaCl，2 g MgSO4·7H2O，50 mL 1 mol/L pH 值 7.5 Tris-HCl，5 mL 2%明膠溶液）。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax i3x酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司；麥?zhǔn)蠞岫葍x，法國生物梅里埃公司；分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；高壓蒸汽滅菌器，日本SANYO公司；恒溫培養(yǎng)振蕩箱，上海智城分析儀器制造有限公司；生化培養(yǎng)箱，日本SANYO公司；生物安全柜，美國NUAIRE公司。

1.3 方法

1.3.1 不同抑菌劑對(duì)沙門氏菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）測(cè)定

將沙門氏菌培養(yǎng)至麥?zhǔn)蠞舛燃s 1.0，即約 2×108cfu/mL，然后稀釋至2×104cfu/mL。抑菌劑的選擇與配制參考GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[2]，最高測(cè)定濃度比標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定限量適當(dāng)升高，即殼聚糖 6.0 mg/mL、茶多酚 1.2 mg/mL、ε-聚賴氨酸1.0 mg/mL、nisin 2.0 mg/mL、EDTA 4.0 mg/mL、nisin+EDTA 0.5 mg/mL+4.0 mg/mL、山梨酸鉀4.0 mg/mL、雙乙酸鈉4.0 mg/mL，其中EDTA作為細(xì)胞膜通透劑與nisin復(fù)配使用。將抑菌劑進(jìn)行倍比稀釋，共稀釋 10次，取100μL濃度為2×104cfu/mL沙門氏菌與對(duì)應(yīng)的各稀釋度的抑菌劑100μL混勻，36 ℃培養(yǎng)24 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)定菌液在600 nm處的吸光值，以沙門氏菌不生長的最低濃度為抑菌劑的MIC值。

1.3.2 不同抑菌劑對(duì)噬菌體SLMP1穩(wěn)定性的影響

配制最高試驗(yàn)濃度的抑菌劑溶液，分別與噬菌體SLMP1（終濃度為1×108pfu/mL）混合，置于36 ℃培養(yǎng)48 h，測(cè)定噬菌體效價(jià)。對(duì)照采用無菌水替代抑菌劑溶液。噬菌體效價(jià)的測(cè)定采用雙層平板法，即對(duì)噬菌體懸液進(jìn)行10倍梯度稀釋，取100μL適當(dāng)濃度懸液與200μL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的沙門氏菌懸液混合，然后加入5 mL溶解后在50 ℃下保溫的營養(yǎng)瓊脂半固體培養(yǎng)基，充分混勻后倒入營養(yǎng)瓊脂平板，待培養(yǎng)基凝固、表面水分晾干后在36 ℃下培養(yǎng)18~24 h，計(jì)數(shù)平板上噬菌斑數(shù)，從而計(jì)算噬菌體效價(jià)[19]。

1.3.3 噬菌體與其它抑菌劑復(fù)配在生三文魚中的應(yīng)用

1）樣品處理：參照薩姆布魯克《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版）》[20]的方法制備高濃度噬菌體懸液（約 1011pfu/mL），然后稀釋成適宜的使用濃度。每片生三文魚表面接種100μL 1×106cfu/mL的沙門氏菌懸液，放置10 min讓其充分吸收。取250μL抑菌劑（單用和復(fù)配，見表1）添加至人工污染了沙門氏菌的三文魚片表面。將處理好的樣品置于無菌封口袋中，于（4±1）℃下貯藏，分別在貯藏3、7、10和14 d時(shí)取樣進(jìn)行菌落總數(shù)、沙門氏菌、噬菌體效價(jià)以及揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）的測(cè)定。每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行，并重復(fù)2次。

表1 噬菌體與抑菌劑復(fù)配應(yīng)用表Table 1 Application of bacteriophage and other bacteriostatic agents

2）沙門氏菌的計(jì)數(shù)：將10 g樣品加入90 mL磷酸鹽緩沖液中，均質(zhì)，制成1∶10樣品勻液。為了避免噬菌體對(duì)沙門氏菌的干擾，取10 mL樣品勻液，8 000 r/min離心10 min，沉淀重懸于10 mL磷酸鹽緩沖液中，取100μL涂布XLD瓊脂平板；對(duì)于菌濃度極低的樣品，將10 mL勻液沉淀重懸于1 mL磷酸鹽緩沖液中，涂布3塊平板（檢出限為1 cfu/g）。在36 ℃培養(yǎng)18~24 h，計(jì)數(shù)平板上典型沙門氏菌菌落數(shù)，從而計(jì)算樣品中沙門氏菌含量[21]。

3）菌落總數(shù)的測(cè)定：按2)方法制成1∶10樣品勻液，取10 mL勻液，8 000 r/min離心10 min，沉淀重懸于10 mL磷酸鹽緩沖液中，進(jìn)行10倍梯度稀釋，取100μL適當(dāng)濃度稀釋液涂布營養(yǎng)瓊脂平板；對(duì)于菌落總數(shù)較低的樣品，則將沉淀重懸于1 mL磷酸鹽緩沖液中，取100μL涂布營養(yǎng)瓊脂平板。將平板置于30 ℃培養(yǎng)72 h，計(jì)數(shù)平板上菌落數(shù)，從而計(jì)算樣品中的菌落總數(shù)。

4）TVB-N值的測(cè)定：TVB-N值的測(cè)定參照 GB 5009.208-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》[22]。即?。?0± 0.001）g均質(zhì)樣品，加入50.0 mL三氯乙酸溶液振搖1 min，靜置15 min待蛋白沉淀后過濾，采用凱氏定氮儀進(jìn)行蒸餾，10 mL硼酸加5滴指示劑用于接收蒸餾液，最后以鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（0.010 mol/L）滴定至終點(diǎn)。

5）噬菌體效價(jià)的測(cè)定：將2）中1∶10樣品勻液離心后的上清液用于噬菌體效價(jià)的測(cè)定，方法參照1.3.2。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用 T檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)的差異性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05表示差異性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抑菌劑的MIC值

本研究以沙門氏菌作為靶細(xì)菌，分析各種抑菌劑對(duì)其抑制效果，表 2為不同抑菌劑對(duì)沙門氏菌的最小抑菌濃度。

表2 不同抑菌劑對(duì)沙門氏菌的最小抑菌濃度Table 2 Minimal inhibitory concentration of different bacteriostatic agents against Salmonella

在所測(cè)試的濃度范圍為，殼聚糖、ε-聚賴氨酸、EDTA、nisin+EDTA對(duì)沙門氏菌有抑制作用，而茶多酚和 nisin對(duì)沙門氏菌沒有抑制作用。殼聚糖 MIC值為1.5 mg/mL，ε-聚賴氨酸為 0.5 mg/mL，EDTA 為4.0 mg/mL，nisin+EDTA為0.5 mg/mL+4.0 mg/mL，山梨酸鉀為4.0 mg/mL，雙乙酸鈉為2.0 mg/mL。其中ε-聚賴氨酸和山梨酸鉀的MIC超過了GB 2760《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中的允許使用限值（0.25和1.0 mg/g）[2]。雖然有研究證明當(dāng)茶多酚濃度為8 mg/mL時(shí)三文魚片有明顯保鮮作用[23]，但這已經(jīng)超過國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的允許使用限值0.3 mg/g[2]。ε-聚賴氨酸抑菌譜廣，對(duì)大部分革蘭氏陰性菌和陽性菌、酵母菌和霉菌均具有較高的抑菌活性，是一種安全性高的生物抑菌劑，對(duì)海產(chǎn)品有較好的保鮮作用[24]。nisin通常能抑制大部分革蘭氏陽性菌及其芽孢的生長，而對(duì)革蘭氏陰性菌抑菌范圍較窄[25]。本研究發(fā)現(xiàn)即使在細(xì)胞膜通透劑EDTA的作用下，也沒有增加nisin對(duì)沙門氏菌的抑菌效果，據(jù)報(bào)道鼠傷寒沙門氏菌可以改變其脂糖層的組成和結(jié)構(gòu)來減輕對(duì)它們的敏感性[26]。山梨酸鉀和雙乙酸鈉能有效抑制霉菌和好養(yǎng)性細(xì)菌，在食品防腐保鮮中有廣泛應(yīng)用[27-28]，然而山梨酸鉀的抑菌效果不明顯，而雙乙酸鈉的抑菌效果則較強(qiáng)。

2.2 噬菌體的穩(wěn)定性

表 3為不同抑菌劑對(duì)噬菌體穩(wěn)定性的影響作用。nisin、茶多酚、山梨酸鉀和雙乙酸鈉對(duì)噬菌體沒有顯著影響。殼聚糖、ε-聚賴氨酸、EDTA能顯著（P<0.05）降低噬菌體的效價(jià)，與對(duì)照組相比，噬菌體效價(jià)分別減少了3.9、1.5、4.0 lg pfu/mL，表明這些抑菌劑對(duì)噬菌體有較強(qiáng)的抑制作用。曾有報(bào)道 ε-聚賴氨酸對(duì)噬菌體有抑制作用，能使大腸埃希氏菌噬菌體失活, ε-聚賴氨酸對(duì)病毒的抑制作用最主要是由于聚賴氨酸中的賴氨酸單體數(shù)，賴氨酸單體數(shù)越高，抑菌活性越強(qiáng)[29]。此外，殼聚糖及其衍生物對(duì)噬菌體也有抑制作用，抑制作用與殼聚糖的氨基酸組成有關(guān)[30]。而其他抑菌劑對(duì)噬菌體的影響作用沒有相關(guān)報(bào)道。

表3 不同抑菌劑對(duì)噬菌體穩(wěn)定性的影響Table 3 Effect of bacteriostatic agents on stability of phage

2.3 噬菌體與其他抑菌劑復(fù)配在生三文魚中的應(yīng)用

2.3.1 抑菌劑的復(fù)配

在測(cè)定的抑菌劑中，殼聚糖、ε-聚賴氨酸能夠抑制沙門氏菌的生長，同時(shí)在短期內(nèi)對(duì)噬菌體有明顯抑制作用，因此不能與噬菌體進(jìn)行復(fù)配。山梨酸鉀的MIC值超過了國家標(biāo)準(zhǔn)限量的規(guī)定[2]，因而不做考慮。雙乙酸鈉MIC值在國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定限值內(nèi)、同時(shí)對(duì)噬菌體沒有明顯抑制作用，因此選擇雙乙酸鈉作為與噬菌體復(fù)配的抑菌劑。此外，考慮到nisin能抑制革蘭氏陽性菌，是一種安全高效、應(yīng)用廣泛的生物保鮮劑，以往的研究也發(fā)現(xiàn)其對(duì)水產(chǎn)品有一定保鮮作用[31]，且對(duì)噬菌體沒有抑制作用，因此選擇nisin作為其中一種抑菌劑進(jìn)行復(fù)配。噬菌體濃度參考前期的試驗(yàn)選擇1×108pfu/g，雙乙酸鈉濃度選擇對(duì)沙門氏菌的MIC值，由于抑菌劑以樣品終濃度計(jì)（以往的報(bào)道多以浸泡液的濃度計(jì)），高濃度的nisin溶液很難配制，同時(shí)考慮到nisin的成本，本試驗(yàn)選擇濃度為0.1 mg/g。

2.3.2 不同抑菌劑對(duì)沙門氏菌的抑制作用

圖1為不同抑菌劑對(duì)沙門氏菌的抑制作用。用噬菌體處理的三文魚片試驗(yàn)組（P，PN，PSD，PNSD）中沙門氏菌數(shù)量顯著降低，其中P和PN組在3 d時(shí)降至1.0 lg cfu/g以下，隨后漸趨于0.5 lg cfu/g，但不能完全消除沙門氏菌；而PSD和PNSD組在10 d后才降至1.0 lg cfu/g以下，PNSD組在14 d后低于檢測(cè)限（1 cfu/g）。沒有用噬菌體處理的N、SD和NSD組與對(duì)照KBS組數(shù)量接近，表明在樣品中，nisin和雙乙酸鈉對(duì)沙門氏菌沒有明顯抑制作用，這與 Wan等[32]的報(bào)道結(jié)果一致，即 nisin（500 IU/mL）、EDTA（0.02 mol/L）、山梨酸鉀（3%）復(fù)配劑在4 ℃下處理蝦7 d后不能顯著降低沙門氏菌數(shù)量。以往的研究表明噬菌體對(duì)海產(chǎn)品中沙門氏菌具有較強(qiáng)的控制作用，Galarce等[33]將沙門氏菌噬菌體分別用于生的和熏制的三文魚片中，4和18 ℃時(shí)，生三文魚片中腸炎沙門氏菌分別減少了2.82和3.19 lg cfu/g，熏制三文魚中腸炎沙門氏菌分別減少了1.16和1.96 lg cfu/g。本研究的噬菌體對(duì)沙門氏菌的抑制作用比上述報(bào)道的更強(qiáng)。本試驗(yàn)使用的雙乙酸鈉在肉湯體系中能抑制沙門氏菌，而在樣品中卻沒有明顯抑制作用，推測(cè)可能是樣品基質(zhì)影響了雙乙酸鈉的抑菌活性。因此，雖然噬菌體裂解譜較窄，但其抑制靶細(xì)菌的效果是其他抑菌劑不能比擬的。

2.3.3 不同抑菌劑對(duì)菌落總數(shù)的影響

圖 2為不同抑菌劑對(duì)菌落總數(shù)的影響作用。未用其他抑菌劑處理的樣品（KB、KBS、P），菌落總數(shù)先增長后穩(wěn)定在約6 lg cfu/g。只用噬菌體處理的樣品菌落總數(shù)與對(duì)照組（KBS）相比，沒有顯著性降低，表明噬菌體不能抑制沙門氏菌外的其他細(xì)菌。而用其他抑菌劑處理的樣品（N、SD、NSD、PN、PSD、PNSD）與KB、KBS、P組相比，都出現(xiàn)了不同程度的降低，其中SD和PSD組3 d后基本穩(wěn)定在5.0~5.5 lg cfu/g；N和PN組3 d后穩(wěn)定在4.5~5.0 lg cfu/g，與初始菌數(shù)基本一致。表明nisin和雙乙酸鈉能抑制樣品中的其它細(xì)菌，與nisin復(fù)配的抑菌效果比與雙乙酸鈉復(fù)配的抑菌效果明顯。海產(chǎn)品由于生存在水生環(huán)境，其中的菌群為海洋細(xì)菌，常見的特定腐敗菌為假單胞菌、腐敗希瓦氏菌、弧菌、嗜冷桿菌等[34]，可能 nisin對(duì)其中的優(yōu)勢(shì)菌抑菌效果優(yōu)于雙乙酸鈉。而NSD和PNSD組的數(shù)值則逐漸降低，14 d時(shí)PNSD組比只污染沙門氏菌的對(duì)照組（KBS）降低了2.5 lg cfu/g，抑菌效果最好。

圖1 不同抑菌劑對(duì)沙門氏菌的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of different bacteriostatic agents on Salmonella

圖2 不同抑菌劑對(duì)菌落總數(shù)的影響Fig.2 Effect of different bacteriostatic agents on total viable counts

2.3.4 不同抑菌劑對(duì)TVB-N值的影響

圖3為不同抑菌劑對(duì)TVB-N值的影響作用。在低溫儲(chǔ)藏過程中，所有試驗(yàn)組的TVB-N值均逐漸升高，表明樣品鮮度在緩慢下降，10 d內(nèi)所有試驗(yàn)組TVB-N值均低于30 mg/100 g，14 d后KB、KBS、P和PN組的TVB-N值高于30 mg/100g。含有雙乙酸鈉的試驗(yàn)組SD、PSD、NSD、PNSD的TVB-N含量增長速度較慢，與對(duì)照組KBS相比，14 d時(shí)TVB-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別減少了9.00、8.11、9.98、13.73 mg/100 g，其中PNSD組抑制TVB-N含量增長的效果最好。用雙乙酸鈉處理的 NSD、PNSD組的TVB-N含量變化趨勢(shì)與菌落總數(shù)變化趨勢(shì)一致，SD和PSD組的TVB-N含量比N組和PN組稍好，這與對(duì)菌落總數(shù)的抑制效果相反。雖然nisin對(duì)三文魚中的總細(xì)菌有較強(qiáng)抑制作用，但可能雙乙酸鈉對(duì)特定腐敗菌的抑制作用比nisin更好，從而使樣品的 TVB-N含量更低?！禛B 2733-2015 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品》中規(guī)定了海水魚的 TVB-N含量應(yīng)小于或等于 30 mg/100g[35]。14 d后含有雙乙酸鈉的試驗(yàn)組的TVB-N含量仍低于腐敗限值30 mg/100 g，其中噬菌體、nisin和雙乙酸鈉復(fù)配處理的樣品TVB-N值最低。

圖3 不同抑菌劑對(duì)TVB-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.3 Effect of different bacteriostatic agents on TVB-N mass fraction of samples

2.3.5 噬菌體在樣品中的穩(wěn)定性

圖4為不同抑菌劑對(duì)噬菌體的影響作用。P和PN組噬菌體效價(jià)穩(wěn)定，而PSD和PNSD組隨著時(shí)間延長逐漸降低，14 d時(shí)與初始效價(jià)相比分別降低了 1.38、1.40 lg pfu/g。從中可以看出，雙乙酸鈉對(duì)噬菌體有抑制作用，時(shí)間小于3 d時(shí)抑制作用不顯著（P> 0.05），隨著處理時(shí)間的延長，抑制作用明顯。雖然雙乙酸鈉在長時(shí)間作用時(shí)對(duì)噬菌體有一定抑制作用，但隨著時(shí)間的增加，噬菌體、nisin和雙乙酸鈉復(fù)配組對(duì)沙門氏菌的抑制作用比其他組效果更好，同時(shí)保鮮作用最明顯，因此雙乙酸鈉對(duì)噬菌體的抑制作用可以忽略。

圖4 不同抑菌劑對(duì)噬菌體的影響Fig.4 Effect of different bacteriostatic agents on phage

3 討 論

以往的研究表明，噬菌體對(duì)致病菌的抑菌作用效果是明顯的。然而，由于噬菌體是一種微生物，其安全性會(huì)引起人們的擔(dān)憂。噬菌體分布極廣，凡是有細(xì)菌的場(chǎng)所，就可能有相應(yīng)噬菌體的存在。據(jù)估計(jì)，噬菌體的豐度是原核生物的 5~10倍左右，是自然界最豐富的生物體[36]。噬菌體是環(huán)境中的正常菌群，日常人們食用的生食或熟食品都能分離到噬菌體，不會(huì)對(duì)人體造成危害。東歐國家就一直研究和生產(chǎn)用于治療疾病的噬菌體制劑，并沒有關(guān)于噬菌體不良副作用的報(bào)道。此外，動(dòng)物和人體試驗(yàn)均證明，噬菌體對(duì)動(dòng)物和人體是安全的[37?39]。因此，噬菌體的安全性較高，可以作用食品添加劑使用。

目前，關(guān)于噬菌體與其他抑菌劑的復(fù)配研究報(bào)道很少，由于噬菌體是一種微生物，與其他抑菌劑復(fù)配后能否穩(wěn)定存在、抑菌效果如何并不清楚，需要開展相關(guān)研究。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)沙門氏菌抑制效果較強(qiáng)的抑菌劑對(duì)噬菌體SLMP1有不同程度的抑制作用。由于噬菌體的特異性極強(qiáng)，因此只對(duì)沙門氏菌有抑制作用，發(fā)揮著靶向抑制食源性致病菌的目的，而nisin和雙乙酸鈉則對(duì)樣品中其他細(xì)菌有抑制作用，發(fā)揮著防腐保鮮作用。噬菌體與 nisin、雙乙酸鈉復(fù)配后，對(duì)生三文魚片中的沙門氏菌、菌落總數(shù)和TVB-N值均具有較強(qiáng)的抑制作用，保鮮效果優(yōu)于各抑菌劑單獨(dú)使用或兩兩復(fù)配。下一步可以通過分析樣品中菌群結(jié)構(gòu)的變化探討復(fù)配抑菌劑的作用機(jī)理。

本實(shí)驗(yàn)室前期預(yù)試驗(yàn)驗(yàn)證了噬菌體SLMP1對(duì)生三文魚中不同濃度沙門氏菌的作用，發(fā)現(xiàn)當(dāng)噬菌體效價(jià)在 1×108pfu/mL，樣品中102cfu/g的沙門氏菌能迅速降至檢測(cè)限1 cfu/g以下。雖然本研究中樣品中沙門氏菌在短期內(nèi)無法將至檢測(cè)限以下，但自然污染的樣本中沙門氏菌的濃度一般要低于本試驗(yàn)設(shè)置的濃度，因此在實(shí)際應(yīng)用中，噬菌體、nisin和雙乙酸鈉復(fù)配抑菌劑的作用效果將會(huì)更明顯。本研究將為水產(chǎn)品的質(zhì)量安全控制提供新的技術(shù)手段，下一步將通過開展不同致病菌的噬菌體與其他生物抑菌劑的復(fù)配作用研究，篩選更優(yōu)的復(fù)配劑應(yīng)用于水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制中。

4 結(jié) 論

本研究篩選獲得能與沙門氏菌噬菌體SLMP1進(jìn)行復(fù)配的抑菌劑nisin和雙乙酸鈉，將三者復(fù)配的抑菌劑應(yīng)用于污染了沙門氏菌的生三文魚片中，在低溫貯藏條件下，復(fù)配抑菌劑與三者單獨(dú)使用相比具有明顯的抑菌優(yōu)勢(shì)：1）復(fù)配抑菌劑能顯著降低樣品中沙門氏菌的數(shù)量，14 d后沙門氏菌低于檢測(cè)限1 CFU/g，其中噬菌體發(fā)揮著靶向抑制沙門氏菌的作用；2）復(fù)配抑菌劑能顯著抑制樣品中菌落總數(shù)的增長，14 d后與空白對(duì)照相比菌落總數(shù)減少了2.5 lg CFU/g，其中nisin對(duì)其他細(xì)菌的抑菌作用最強(qiáng)，噬菌體對(duì)沙門氏菌以外的細(xì)菌沒有明顯抑制作用；3）復(fù)配抑菌劑能顯著抑制樣品中TVB-N的增加，14 d后與空白對(duì)照相比TVB-N值降低了13.73 mg/100 g，其中雙乙酸鈉的抑制作用最強(qiáng)。結(jié)果表明，噬菌體、nisin及雙乙酸鈉復(fù)配劑在生三文魚沙門氏菌控制及防腐保鮮中具有良好應(yīng)用前景。

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